基因转录调控
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• 打破了“one gene， one enzyme”学说
• 模型的来由 • β-半乳糖苷酶受乳糖诱导 • λ噬菌体从溶源性到裂解阶段 • 导致了mRNA的发现
体外结合 试验：
证明阻遏子与 Lac操纵基因 的结合
后期验证： DNaseI足迹 EMSA
操纵子
操纵子是细菌基因表达和 调控单元 包括结构基因和调控序列 多顺反子转录（Polycistron）
基本转录“机器”
（Basal transcription mechinary）
• 启动子识别（TF） • RNA合成基本“组件” • RNAPII和5个转录因子
• • • • • TFIID：时空特异表达 TFIIB：TBP结合、定向 TFIIE：结合H TFIIF：促进RNAP结合E、H TFIIH：具有解旋活性
核心启动子元件
• • • • • 核心启动子是指紧邻转录起始的调控区 相对远离的调控区可以称为启动子前调控元件 核心启动子位置移动导致活性丧失 TFIID是通用的识别核心启动子元件的转录因子 TATA Box、Inr、BRE、MTE、DPE （元件或基序）
元件TATA Box
TATAA基序
证明实验 • 腺病毒启动子含有TATA Box • 21bp、43两个片段克隆到pBR322 • 酶切线性化 • 体外转录 • 2-3样井:2个21bp同方向，分别用EcoRI、 BamHI酶切 • 4-5：21和43相对方向，分别用EcoRI、 BamHI、SalI酶
~ 17bp
细菌RNAP结构特点
• RNAP（全酶）= 核心酶 +σ因子 • 核心酶负责催化合成：αI, αII, β, β’, ω
• 核心酶结合DNA任一部分可启动转录 • σ因子阻止这一过程，保证特异位点转录
结合-10、-35区
蟹螯 蟹爪状
大肠杆菌的不同σ因子
Mycoplasma genetalia 1个，Streptococcus coelicolour，63个；Bacillus subtilis 18个芽孢相关
3H标记的dsDNA 非标记的dsDNA RNAP全酶 RNAP核心酶
Fra Baidu bibliotek
硝酸纤维素结合实验
证明σ因子促进RNAP与启 动子结合的强度
转录的起始
封闭的启动子复合物
可逆结合双链DNA
开放的启动子复合物
部分解链DNA不可逆
启动子的释放
开始RNA合成并离开 σ因子变构利于RNA
转录的延伸（9-12nt）
真核RNA聚合酶
基本转录“机器”
转录激活或抑制因子
协同转录因子或协同抑制子
转录调控区
• • • • • 某个基因的特异转录是特异调控序列及其调控因子的组合 人类基因编码序列小于基因组的2% 调控区一般位于转录起始位置前 单细胞真核如酵母调控区很短 多细胞真核生物调控区超过10Kb，但转录长度一般2-3Kb
DNA转录及其调控 DNA Transcription and its regulation
基因转录（transcription）
• • • • 基因表达的重要步骤就是转录（信息拷贝） RNA聚合酶，DNA为模板 具体生化过程清楚但调控复杂 原核生物的调控相对清楚，具有借鉴意义
– 乳糖操纵子 – 蛋白质与DNA互作
90度
CAP与DNA结合
二聚体
Lac阻遏物与DNA结合
结合IPTG变构
盐桥
DNA结合域
阿拉伯糖操纵子
AraC调控蛋白 既是阻遏子又是激活子
AraC处于阻遏状态
AraC处于激活状态
改变DNA螺旋 证明O2负调控
增加半 个螺旋
RNA调控基 因的表达
色氨酸操纵子
弱化子10倍 阻遏子60倍
RNA调控
• • • • • • 反式激活作用域 DNA结合域 二聚体域 辅因子结合域 核定位序列 核输出序列
DNA结合域
• • • • • • • • DNA结合域决定了序列专一性 结合依赖于三维结构的构型和氢键 依赖于α-螺旋结构与DNA双螺旋“沟”的互作 蛋白质和核酸的N-H、O-H、O之间的氢键 疏水基团的接触 比对结合域，具有类似基序组成的不同组 基序是特定三维折叠行使特定功能的一簇氨基酸 DNA结合域常见有四类
– CAP：DNA结合、RNAP（C端α-螺旋）结合 – 即使浓度低时也可以互相协助与DNA（启动子）结合
• 变构与DNA结合
– 例如CAP、Lac阻遏物与DNA结合 – CAP：结合cAMP发生变构，二聚体结合DNA使之弯曲 – HTH structure motif：α-螺旋插入DNA大沟
• DNA looping：阿拉伯糖操纵子
增强子不同位置
LCR（locus controlling region）
• • • • • • • 组织染色质使之处于转录活跃状态 具有方向性 DNaseI超敏区域（5） 约200Kb 与RNAPII等结合 形成环状 拉近顺式位置序列
• 球蛋白的转录
– 发育时期特异性
MARs（Matrix Attachment Regions）
核酸转换
（riboswitches） 结合代谢产物 调控基因表达
真核基因转录
• • • • • • • • • • 真核基因约2万-5万 一些在所有细胞中转录（持家基因） 一些只在特定的细胞和发育时期表达 1980s前期主要体外研究DNA-蛋白质互作 亲和层析分离DNA结合蛋白 EMSA分析反式作用因子 DNaseI足迹分析鉴定顺时作用元件 1980s后期鉴定许多蛋白并证明蛋白互作实现调控 1990s后发现染色质结构、核结构、细胞区隔化的调控 多水平、多方位的调控机制
乳糖操纵子
适应环境（碳源） 改变代谢模式（C源） 基因调控的经典
正调控：cAMP +CRP（CAP） 负调控: 阻遏物
围绕起始复合体调控
乳糖操纵子的基础转录
• • • • 正和负调控 葡萄糖导致cAMP下降 CAP（CRP）激活需要cAMP 缺少CAP的作用，RNAP维持基础的转录水平
– RNAP随机与启动子结合并起始转录的频率
• 20个亚基组成的介导子
• 介导激活因子与增强子结合
RNAPII结构
12个亚基（Rbp1-12） 核心酶10个(除去4、7)
催化活性
RNAPII
亚基4/7形成异源二聚体
转录及转录后起作用 参与转录偶联的DNA修复
结构特征 狭缝：合成RNA位点 墙：使RNA弯90度 夹子：动态变化 CTD：10个7aa重复 磷酸化状态
阻断子（insulator）
• • • • • 位于常染色质（富含基因）异染色质（非编码区）之间 300p-2000bp长度的DNA序列 功能一：分开异染色质和染色质，界桩的作用 功能二：防止增强子、抑制因子作用于临近基因 至少被3个DNA结合蛋白所识别
– CTCF：CCCTC结合因子，具增强子的阻断活性 – USF、USF2:招募染色质修饰酶
– 蛋白质活性的变构修饰
• 远距离DNA调控位点通过蛋白质的折叠
原核生物转录和翻译相偶联
核糖体结合转录RNA 数分钟完成 真核生物核内mRNA 蛋白质在内质网合成 数小时或数月 更多调控步骤
真核生物的 mRNA转录和 蛋白质合成
调控步骤 8个调控步骤
mRNA“帽子”结构
稳定mRNA 利于核糖体识别
• • • • Helix-Turn-Helix （HTH） Zinc Finger （Zif） Basic Leucine Zip （bZIP） Basic Helix-Loop-Helix （BHLH）
HTH（Helix-Turn-Helix）转录因子
• • • • 简单氨基酸折叠组成的3个α-螺旋结构 第三个（识别螺旋）插入到双螺旋的“大沟” 第二个与第三个之间有β-turn Homeodomain （HD）转录因子及其他变异类型
依赖ρ
结合“rut”位点 六聚体、可移动 防“readthrough” 解杂合链、RNAP释放
翻译 终止 点
高保真转录（proofreading）
• • • • RNAP沿RNA可以随时向后滑动（~5bp） 滑动后可以恢复原位 也可以切掉新合成的RNA，去掉配错的核苷酸 继续链的延伸
细菌染色体的转录方向
复合物
磷酸化
TFIIH在ATP作用下 对RNAPII磷酸化
解旋作用
TFIIH
Lane1：41bp标记的单链 Land2：没有蛋白（负对照） Lane3：20ng TFIIH，没有ATP Lane4: 10ng TFIIH，有ATP Lane5: 20ng TFIIH，有ATP
转录因子是模块化的蛋白质
• • • • • • • • 核骨架结合区域处于转录活跃状态 染色质处于“环状”结构 每隔5-200Kb就有MAR AT-rich 区域 DNA二级结构改变 形成一个操作平台 结合转录因子 组织特异性表达
MAR作用模式
• MAR分为结构MAR和功能MAR • 结构MAR起“锚定”作用 • 功能MAR动态转换将基因带入核骨架区域
• 环分开两个α-螺旋 • 二聚体后结合DNA • 结合位点是碱性氨基 酸（带+电）
共激活（抑制）因子
• 不直接与DNA结合 • 与蛋白互作增强或抑制转录活性 • 分为二大类 • 染色质修饰（modification）复合物：组蛋白翻译后修饰有 利于转录因子 • 染色质重建（remodeling）复合物：如依赖ATP的DNA解旋
RNAPII转录过程
• • • • 启动子的释放 RNA合成 保真：可调节（tunable）活性位点 延伸因子保障转录的进行
真核生物启动子元件
TFIID = TBP + TAF1（TBP-associated factor 1）、TAF2
远距离调控元件
• • • • 酵母的UAS，距离较近且位置基本固定 大多数增强子位置可以处于上、下游或内含子内 典型增强子500bp，含有一系列调控因子的结合位点 调控基因组织、发育时期的特异表达
核心酶发生显著的变构
RNAP-DNA接触的变化（σ因子）
形成“转录泡”
大约30bp（RNA保护实验） 含有核苷酸、产物两个结合位点 合成并移动一个碱基 保持9-12bp长的RNA-DNA杂合链
核心酶高速移动模型
转录的终止
终止子
终止信号 终止序列
不依赖ρ
茎环结构 之后的7-8个“U”
无共同序列 之后无“U”
RNA聚合酶 （RNAP）
转录机制
• • • • • • RNAP结合基因的启动子（promoter） 启动子是顺式作用（cis-acting）元件（序列） 结合在顺式元件上的调控蛋白称为反式作用因子 通过基序（motif）结合（如TATAAT） 反式作用因子是转录、翻译而来 启动子共有序列（-10区、-35区）
锌指（Zinc finger）转录因子
• 半胱氨酸或与组氨酸 共价结合锌离子 • 三维结构显示二聚体 和DNA识别位点
• C2H2、C2C2型
bZIP、BHLH转录因子
• CAAT增强子结合蛋白 • 本身没有DNA结合域 • 两个带bZIP形成二聚 体结合到DNA上 • coiled-coil结构 • 碱性Arg、His
• • • • • 环状基因组 复制方向5’- 3’ 复制半圆1、2 顺时针和逆时针转录 复制与转录方向相同
转录的调控
Jacob-Monod 操纵子（operon）模型
1959年 • 调控基因产物“R” • R（或结合其他因子后）结合操纵基因（operator） • 调控结构基因的表达
操纵子模型的意义和作用
• 基础转录比高效转录低29-40倍 • ρ因子参与调控
– 氨基酸水平低下时候起终止作用 – 避免细胞在缺少氨基酸时还翻译蛋白质（消耗）
半乳糖相关 糖类的结构
乳糖操纵子 广泛用于
-重组子筛选 -原核蛋白表达 lacZ、IPTG
异乳糖
异丙基硫代半乳糖苷
转录调控因子的作用模式
• • • • 带有不同结构域：蛋白-DNA、蛋白-蛋白 一种调控因子结合DNA可能需要另外一个协助 远距离DNA调控位点可能通过蛋白相互作用拉近 蛋白之间的协助不需要变构
• 模型的来由 • β-半乳糖苷酶受乳糖诱导 • λ噬菌体从溶源性到裂解阶段 • 导致了mRNA的发现
体外结合 试验：
证明阻遏子与 Lac操纵基因 的结合
后期验证： DNaseI足迹 EMSA
操纵子
操纵子是细菌基因表达和 调控单元 包括结构基因和调控序列 多顺反子转录（Polycistron）
基本转录“机器”
（Basal transcription mechinary）
• 启动子识别（TF） • RNA合成基本“组件” • RNAPII和5个转录因子
• • • • • TFIID：时空特异表达 TFIIB：TBP结合、定向 TFIIE：结合H TFIIF：促进RNAP结合E、H TFIIH：具有解旋活性
核心启动子元件
• • • • • 核心启动子是指紧邻转录起始的调控区 相对远离的调控区可以称为启动子前调控元件 核心启动子位置移动导致活性丧失 TFIID是通用的识别核心启动子元件的转录因子 TATA Box、Inr、BRE、MTE、DPE （元件或基序）
元件TATA Box
TATAA基序
证明实验 • 腺病毒启动子含有TATA Box • 21bp、43两个片段克隆到pBR322 • 酶切线性化 • 体外转录 • 2-3样井:2个21bp同方向，分别用EcoRI、 BamHI酶切 • 4-5：21和43相对方向，分别用EcoRI、 BamHI、SalI酶
~ 17bp
细菌RNAP结构特点
• RNAP（全酶）= 核心酶 +σ因子 • 核心酶负责催化合成：αI, αII, β, β’, ω
• 核心酶结合DNA任一部分可启动转录 • σ因子阻止这一过程，保证特异位点转录
结合-10、-35区
蟹螯 蟹爪状
大肠杆菌的不同σ因子
Mycoplasma genetalia 1个，Streptococcus coelicolour，63个；Bacillus subtilis 18个芽孢相关
3H标记的dsDNA 非标记的dsDNA RNAP全酶 RNAP核心酶
Fra Baidu bibliotek
硝酸纤维素结合实验
证明σ因子促进RNAP与启 动子结合的强度
转录的起始
封闭的启动子复合物
可逆结合双链DNA
开放的启动子复合物
部分解链DNA不可逆
启动子的释放
开始RNA合成并离开 σ因子变构利于RNA
转录的延伸（9-12nt）
真核RNA聚合酶
基本转录“机器”
转录激活或抑制因子
协同转录因子或协同抑制子
转录调控区
• • • • • 某个基因的特异转录是特异调控序列及其调控因子的组合 人类基因编码序列小于基因组的2% 调控区一般位于转录起始位置前 单细胞真核如酵母调控区很短 多细胞真核生物调控区超过10Kb，但转录长度一般2-3Kb
DNA转录及其调控 DNA Transcription and its regulation
基因转录（transcription）
• • • • 基因表达的重要步骤就是转录（信息拷贝） RNA聚合酶，DNA为模板 具体生化过程清楚但调控复杂 原核生物的调控相对清楚，具有借鉴意义
– 乳糖操纵子 – 蛋白质与DNA互作
90度
CAP与DNA结合
二聚体
Lac阻遏物与DNA结合
结合IPTG变构
盐桥
DNA结合域
阿拉伯糖操纵子
AraC调控蛋白 既是阻遏子又是激活子
AraC处于阻遏状态
AraC处于激活状态
改变DNA螺旋 证明O2负调控
增加半 个螺旋
RNA调控基 因的表达
色氨酸操纵子
弱化子10倍 阻遏子60倍
RNA调控
• • • • • • 反式激活作用域 DNA结合域 二聚体域 辅因子结合域 核定位序列 核输出序列
DNA结合域
• • • • • • • • DNA结合域决定了序列专一性 结合依赖于三维结构的构型和氢键 依赖于α-螺旋结构与DNA双螺旋“沟”的互作 蛋白质和核酸的N-H、O-H、O之间的氢键 疏水基团的接触 比对结合域，具有类似基序组成的不同组 基序是特定三维折叠行使特定功能的一簇氨基酸 DNA结合域常见有四类
– CAP：DNA结合、RNAP（C端α-螺旋）结合 – 即使浓度低时也可以互相协助与DNA（启动子）结合
• 变构与DNA结合
– 例如CAP、Lac阻遏物与DNA结合 – CAP：结合cAMP发生变构，二聚体结合DNA使之弯曲 – HTH structure motif：α-螺旋插入DNA大沟
• DNA looping：阿拉伯糖操纵子
增强子不同位置
LCR（locus controlling region）
• • • • • • • 组织染色质使之处于转录活跃状态 具有方向性 DNaseI超敏区域（5） 约200Kb 与RNAPII等结合 形成环状 拉近顺式位置序列
• 球蛋白的转录
– 发育时期特异性
MARs（Matrix Attachment Regions）
核酸转换
（riboswitches） 结合代谢产物 调控基因表达
真核基因转录
• • • • • • • • • • 真核基因约2万-5万 一些在所有细胞中转录（持家基因） 一些只在特定的细胞和发育时期表达 1980s前期主要体外研究DNA-蛋白质互作 亲和层析分离DNA结合蛋白 EMSA分析反式作用因子 DNaseI足迹分析鉴定顺时作用元件 1980s后期鉴定许多蛋白并证明蛋白互作实现调控 1990s后发现染色质结构、核结构、细胞区隔化的调控 多水平、多方位的调控机制
乳糖操纵子
适应环境（碳源） 改变代谢模式（C源） 基因调控的经典
正调控：cAMP +CRP（CAP） 负调控: 阻遏物
围绕起始复合体调控
乳糖操纵子的基础转录
• • • • 正和负调控 葡萄糖导致cAMP下降 CAP（CRP）激活需要cAMP 缺少CAP的作用，RNAP维持基础的转录水平
– RNAP随机与启动子结合并起始转录的频率
• 20个亚基组成的介导子
• 介导激活因子与增强子结合
RNAPII结构
12个亚基（Rbp1-12） 核心酶10个(除去4、7)
催化活性
RNAPII
亚基4/7形成异源二聚体
转录及转录后起作用 参与转录偶联的DNA修复
结构特征 狭缝：合成RNA位点 墙：使RNA弯90度 夹子：动态变化 CTD：10个7aa重复 磷酸化状态
阻断子（insulator）
• • • • • 位于常染色质（富含基因）异染色质（非编码区）之间 300p-2000bp长度的DNA序列 功能一：分开异染色质和染色质，界桩的作用 功能二：防止增强子、抑制因子作用于临近基因 至少被3个DNA结合蛋白所识别
– CTCF：CCCTC结合因子，具增强子的阻断活性 – USF、USF2:招募染色质修饰酶
– 蛋白质活性的变构修饰
• 远距离DNA调控位点通过蛋白质的折叠
原核生物转录和翻译相偶联
核糖体结合转录RNA 数分钟完成 真核生物核内mRNA 蛋白质在内质网合成 数小时或数月 更多调控步骤
真核生物的 mRNA转录和 蛋白质合成
调控步骤 8个调控步骤
mRNA“帽子”结构
稳定mRNA 利于核糖体识别
• • • • Helix-Turn-Helix （HTH） Zinc Finger （Zif） Basic Leucine Zip （bZIP） Basic Helix-Loop-Helix （BHLH）
HTH（Helix-Turn-Helix）转录因子
• • • • 简单氨基酸折叠组成的3个α-螺旋结构 第三个（识别螺旋）插入到双螺旋的“大沟” 第二个与第三个之间有β-turn Homeodomain （HD）转录因子及其他变异类型
依赖ρ
结合“rut”位点 六聚体、可移动 防“readthrough” 解杂合链、RNAP释放
翻译 终止 点
高保真转录（proofreading）
• • • • RNAP沿RNA可以随时向后滑动（~5bp） 滑动后可以恢复原位 也可以切掉新合成的RNA，去掉配错的核苷酸 继续链的延伸
细菌染色体的转录方向
复合物
磷酸化
TFIIH在ATP作用下 对RNAPII磷酸化
解旋作用
TFIIH
Lane1：41bp标记的单链 Land2：没有蛋白（负对照） Lane3：20ng TFIIH，没有ATP Lane4: 10ng TFIIH，有ATP Lane5: 20ng TFIIH，有ATP
转录因子是模块化的蛋白质
• • • • • • • • 核骨架结合区域处于转录活跃状态 染色质处于“环状”结构 每隔5-200Kb就有MAR AT-rich 区域 DNA二级结构改变 形成一个操作平台 结合转录因子 组织特异性表达
MAR作用模式
• MAR分为结构MAR和功能MAR • 结构MAR起“锚定”作用 • 功能MAR动态转换将基因带入核骨架区域
• 环分开两个α-螺旋 • 二聚体后结合DNA • 结合位点是碱性氨基 酸（带+电）
共激活（抑制）因子
• 不直接与DNA结合 • 与蛋白互作增强或抑制转录活性 • 分为二大类 • 染色质修饰（modification）复合物：组蛋白翻译后修饰有 利于转录因子 • 染色质重建（remodeling）复合物：如依赖ATP的DNA解旋
RNAPII转录过程
• • • • 启动子的释放 RNA合成 保真：可调节（tunable）活性位点 延伸因子保障转录的进行
真核生物启动子元件
TFIID = TBP + TAF1（TBP-associated factor 1）、TAF2
远距离调控元件
• • • • 酵母的UAS，距离较近且位置基本固定 大多数增强子位置可以处于上、下游或内含子内 典型增强子500bp，含有一系列调控因子的结合位点 调控基因组织、发育时期的特异表达
核心酶发生显著的变构
RNAP-DNA接触的变化（σ因子）
形成“转录泡”
大约30bp（RNA保护实验） 含有核苷酸、产物两个结合位点 合成并移动一个碱基 保持9-12bp长的RNA-DNA杂合链
核心酶高速移动模型
转录的终止
终止子
终止信号 终止序列
不依赖ρ
茎环结构 之后的7-8个“U”
无共同序列 之后无“U”
RNA聚合酶 （RNAP）
转录机制
• • • • • • RNAP结合基因的启动子（promoter） 启动子是顺式作用（cis-acting）元件（序列） 结合在顺式元件上的调控蛋白称为反式作用因子 通过基序（motif）结合（如TATAAT） 反式作用因子是转录、翻译而来 启动子共有序列（-10区、-35区）
锌指（Zinc finger）转录因子
• 半胱氨酸或与组氨酸 共价结合锌离子 • 三维结构显示二聚体 和DNA识别位点
• C2H2、C2C2型
bZIP、BHLH转录因子
• CAAT增强子结合蛋白 • 本身没有DNA结合域 • 两个带bZIP形成二聚 体结合到DNA上 • coiled-coil结构 • 碱性Arg、His
• • • • • 环状基因组 复制方向5’- 3’ 复制半圆1、2 顺时针和逆时针转录 复制与转录方向相同
转录的调控
Jacob-Monod 操纵子（operon）模型
1959年 • 调控基因产物“R” • R（或结合其他因子后）结合操纵基因（operator） • 调控结构基因的表达
操纵子模型的意义和作用
• 基础转录比高效转录低29-40倍 • ρ因子参与调控
– 氨基酸水平低下时候起终止作用 – 避免细胞在缺少氨基酸时还翻译蛋白质（消耗）
半乳糖相关 糖类的结构
乳糖操纵子 广泛用于
-重组子筛选 -原核蛋白表达 lacZ、IPTG
异乳糖
异丙基硫代半乳糖苷
转录调控因子的作用模式
• • • • 带有不同结构域：蛋白-DNA、蛋白-蛋白 一种调控因子结合DNA可能需要另外一个协助 远距离DNA调控位点可能通过蛋白相互作用拉近 蛋白之间的协助不需要变构