流式分选原理
流式细胞仪分选原理
流式细胞仪分选原理流式细胞仪是一种高效、快速、准确的细胞分析工具，它能够实现对细胞的快速分类、计数和分选。
其分选原理主要基于光散射和荧光信号的检测与分析。
本文将详细介绍流式细胞仪的分选原理及其应用。
一、光散射的检测与分析流式细胞仪通过激光束照射样品细胞，细胞与光发生相互作用后会发生光散射。
光散射分为前向散射、侧向散射和后向散射三种。
前向散射主要与细胞的大小和形状有关，可用来区分不同类型的细胞。
侧向散射则与细胞的复杂度和颗粒物含量相关，可用来评估细胞的复杂度和颗粒物含量。
后向散射则与细胞的内部结构有关，可用来评估细胞的核质比。
二、荧光信号的检测与分析流式细胞仪通过荧光染料标记的抗体或荧光染料直接标记的细胞，可以检测到细胞表面或内部相关蛋白、DNA或RNA的荧光信号。
这些信号可以用于检测细胞的免疫表型、细胞周期和细胞凋亡等生物学特性。
通过检测细胞的荧光信号，可以实现对不同类型细胞的快速分类和分析。
三、细胞的分选在细胞检测和分析的基础上，流式细胞仪还可以实现对特定类型细胞的分选。
分选是通过细胞仪中的细胞排序系统实现的，通常采用静电分选或压力分选的方式。
静电分选是通过根据细胞的光信号特征将其分为阳性和阴性细胞，然后通过高压电极将细胞引导到相应的收集器中。
压力分选则是通过调整细胞流速和压力差，使目标细胞以一定方式排列并被分选。
四、流式细胞仪在生命科学中的应用流式细胞仪在生命科学研究中具有广泛的应用。
首先，它可以用于免疫表型分析，通过检测细胞表面标记物的荧光信号，可以对细胞的免疫表型进行精确的鉴定。
其次，流式细胞仪可以用于细胞周期分析，通过检测DNA荧光信号的强度，可以确定细胞所处的不同周期阶段。
此外，流式细胞仪还可以用于细胞凋亡分析、细胞功能研究以及肿瘤细胞的分选等。
总结：流式细胞仪的分选原理主要基于光散射和荧光信号的检测与分析。
通过光散射可以评估细胞的大小、形状、复杂度和颗粒物含量等特征，而荧光信号则可以用于检测细胞的免疫表型、细胞周期和细胞凋亡等生物学特性。
流式细胞仪分选细胞的原理
流式细胞仪分选细胞的原理一、仪器原理流式细胞仪是一种利用流体动力学原理，结合光学和电子仪器技术，对细胞进行快速检测、分类和分选的仪器。
其主要原理是通过细胞在液体中的流动来实现对细胞的分选和分类。
二、流式细胞仪的组成流式细胞仪主要由液体系统、光学系统和电子系统三部分组成。
1.液体系统：液体系统包括进样系统、流动系统和废液系统。
进样系统负责将待检样品引入流动系统；流动系统则通过液体的流动将细胞送到光学系统进行检测；废液系统则负责将已经检测过的样品排出。
2.光学系统：光学系统由激光器、光学镜头、滤光片和光电倍增管等组成。
激光器产生的激光经过光学镜头聚焦后，照射到流动的细胞上，细胞反射、散射或荧光发射的光信号被光学镜头收集并通过滤光片进行过滤，最后由光电倍增管转化为电信号。
3.电子系统：电子系统主要由数据采集卡、计算机和控制软件组成。
数据采集卡负责将光电倍增管转换的电信号进行放大和数字化处理，然后传输给计算机；计算机通过控制软件对数据进行处理、分析和展示。
三、细胞的分选原理流式细胞仪的分选功能是通过细胞的特征参数来进行判断和分选的。
1.散射光信号分选：散射光信号是细胞受到激光照射后，由于细胞的大小、形状和内部结构的不同，产生的光信号。
通过检测散射光信号的强度和角度，可以判断细胞的大小和形态，从而实现对细胞的初步分选。
2.荧光信号分选：荧光信号是细胞在受到特定荧光染料激发后发射的光信号。
通过检测细胞的荧光强度和荧光颜色，可以判断细胞内特定荧光标记物的存在与否，从而实现对特定细胞类型的分选。
3.双参数联合分选：双参数联合分选是指根据细胞的两个或多个特征参数进行综合分析和判断。
比如可以根据细胞的大小和形状、荧光强度和颜色等参数进行综合判断，实现对多种细胞类型的准确分选。
四、应用领域流式细胞仪广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
1.生物医学研究：流式细胞仪可以对细胞的免疫表型、细胞周期、细胞凋亡等进行快速检测和分析，帮助科研人员深入了解细胞的生理和病理过程。
流式细胞分选抗体原理
流式细胞分选（Flow Cytometry Cell Sorting）是一种用于分离和纯化特定细胞亚群的技术，其中抗体起到关键的作用。
以下是流式细胞分选抗体的原理：
标记抗体选择：首先，需要选择合适的抗体来标记目标细胞或目标细胞表面的特定分子。
这些抗体通常与荧光染料或其他标记物结合，以使标记的细胞在流式细胞仪中可视化。
光散射和荧光检测：标记后的细胞通过流式细胞仪，其在通过激光束时会散射或发射特定波长的荧光信号。
光散射用于测量细胞的大小和复杂度，而荧光检测用于检测标记抗体的荧光信号。
细胞分选：流式细胞仪根据标记的细胞的特定荧光信号，通过流式细胞排序装置将目标细胞与非目标细胞进行分离。
分选过程通常基于细胞荧光信号的阈值设定，将目标细胞与非目标细胞分开。
细胞收集：经过分选的细胞会根据需要进行收集，以获取纯化的目标细胞亚群。
抗体在流式细胞分选中起到了关键的作用，通过与目标细胞表面的特定分子结合，实现对特定细胞亚群的分离和纯化。
这种技术在生物医学研究和临床应用中具有广泛的应用，可以用于研究细胞亚群的功能、分析疾病机制以及进行细胞治疗等领域。
分选流式细胞仪原理
分选流式细胞仪原理一、引言分选流式细胞仪（FACS）是一种广泛应用于生物医学研究的仪器，其主要原理是通过激光束照射、细胞悬浮液流动和多参数检测等步骤，实现对细胞的快速、高效分选。
本文将详细介绍分选流式细胞仪的原理和操作流程。
二、原理分选流式细胞仪的核心原理是基于流式细胞术和细胞排序技术。
其基本组成包括激光器、流体系统、光学系统、检测系统和排序系统等。
1. 激光器激光器是分选流式细胞仪的核心部件，通常采用氩离子激光器或固态激光器。
激光器产生的激光束经过透镜系统聚焦，射向流动细胞悬浮液中的细胞。
2. 流体系统流体系统负责将细胞悬浮液送入仪器，并控制细胞在流动细胞仪中的流速和流动性。
通过调节压力和流速，可以实现细胞在仪器中的精确定位和流动。
3. 光学系统光学系统包括激光束聚焦系统、散射光检测系统和荧光光检测系统。
激光束聚焦系统将激光束聚焦到细胞悬浮液中的细胞上，使其发生散射或荧光。
散射光检测系统通过散射光检测器记录细胞的散射信号，荧光光检测系统通过荧光探测器记录细胞的荧光信号。
4. 检测系统检测系统负责将细胞发射的散射光和荧光信号转换为电信号，并对其进行放大和处理。
通过检测系统，可以获取细胞的散射光信号和荧光信号的强度和频率等信息。
5. 排序系统排序系统根据检测到的信号，对细胞进行分类和分选。
常见的分选方式包括电荷分选、压力分选和光学分选。
通过调节分选系统的参数，可以实现对特定细胞的精确分选和收集。
三、操作流程分选流式细胞仪的操作流程通常包括样本准备、仪器设置、数据采集和数据分析等步骤。
1. 样本准备样本准备是分选流式细胞仪操作的关键步骤之一。
首先，需要准备细胞悬浮液，并对其进行染色或标记。
然后，将样本注入流式细胞仪的样本池中。
2. 仪器设置仪器设置是调节分选流式细胞仪参数的步骤。
包括调节激光器的功率和波长、设置流体系统的流速和压力、选择光学系统的检测通道等。
通过合理设置仪器参数，可以提高数据的准确性和分选的效率。
细胞流式分选
细胞流式分选细胞分选技术可以将不同种类的细胞根据其特定的属性进行分离和分析。
其中，细胞流式分选技术作为一种常用的手段，可以通过将细胞悬浮液经过流式细胞仪进行检测，再根据细胞特性进行高速分选。
该技术已经被广泛应用于许多生物医学领域，如肿瘤学、免疫学、神经学等，为细胞学研究提供了有力的工具。
一、细胞流式分选的原理细胞流式分选技术基于流式细胞仪和荧光标记技术。
首先，将细胞悬浮液加入流式细胞仪中，然后通过光学光谱仪对其进行检测，记录细胞具体的特性信息。
接着，根据细胞表面的特定标记分别用荧光染料染色，并将细胞以快速流动的方式通过激光束进行荧光检测，荧光信号被记录在荧光探测器中。
最后，细胞根据这些特征被迅速分选，实现不同类型细胞的分开操作。
二、细胞流式分选的应用细胞流式分选技术广泛用于肿瘤学、免疫学和生殖医学等领域。
以肿瘤学为例，该技术可用于分离纯化恶性肿瘤细胞，对于恶性肿瘤细胞的研究具有重要意义。
在免疫学中，该技术被用于对免疫细胞进行排序和筛选，以进行相关检测。
在某些实验中，要求使用高度纯化的单一类型细胞，因此，细胞流式分选技术也是必不可缺的技术手段。
此外，在生殖医学领域，该技术同样广泛用于人类胚胎和生殖细胞的筛选、筛查和分离。
三、细胞流式分选技术的发展随着生命科学的不断进步，细胞流式分选技术也得到了不断的升级和发展。
例如，现在的细胞流式分选仪已经不仅可以分选细胞，还能用于快速植物种子品质检测。
而流式细胞仪以及其中的荧光标记和探测器技术也在不断更新，以适应越来越多的研究需求。
未来，随着技术的进一步发展和完善，细胞流式分选技术将无疑在许多生命科学研究领域发挥更加重要的作用。
总之，细胞流式分选技术作为一项令人瞩目的细胞分离技术，在生命科学研究等许多领域具有重要作用。
其原理简单且操作便利，可以在很短时间内分离出纯化的特定类型细胞，为应用于生物和医学研究打下了坚实的基础。
随着技术的不断进步和发展，细胞流式分选技术将在未来更加普及，并为人类健康事业和细胞研究的发展带来更多的可能。
简述流式细胞仪细胞分选原理。
简述流式细胞仪细胞分选原理。
流式细胞仪是一种广泛应用于生物医学领域的实验仪器，主要用于对细胞进行分析、计数和分选。
其原理是通过激光束照射细胞，测量细胞在光学系统中的散射和荧光信号，从而获得有关细胞的信息，并根据设定的参数将细胞进行分选。
流式细胞仪主要由光学系统、流动系统和信号处理系统三个部分组成。
光学系统包括激光器、光学镜头和探测器，用于照射细胞和收集细胞发出的散射和荧光信号。
流动系统包括样本注射器、流动池和流速控制系统，用于将样本中的细胞以单个细胞为单位依次通过光学系统进行测量。
信号处理系统包括放大器、模数转换器和计算机，用于处理和分析收集到的信号，并根据设定的参数进行细胞分选。
在流式细胞仪中，细胞首先通过样本注射器被引入到流动池中，然后通过流速控制系统以恒定的速度流动。
激光器产生的激光束经过光学镜头聚焦后照射到细胞上，细胞与光发生相互作用，产生散射和荧光信号。
光学系统中的探测器收集到的信号经过放大器放大后，转换为模拟电信号，然后通过模数转换器转换为数字信号，最后由计算机进行处理和分析。
细胞在流式细胞仪中的散射信号主要由前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）组成。
前向散射信号与细胞的大小和形状有关，侧向散射信号与细胞的复杂度和内部结构有关。
通过测量前向散射和侧向散射信号的强度，可以初步判断细胞的大小、形态和复杂度。
除了散射信号外，流式细胞仪还可以测量细胞的荧光信号。
在实验前，可以将细胞标记上特定的荧光标记物，如荧光染料或荧光标记的抗体。
这些荧光标记物可以与细胞的特定分子或结构结合，从而在流式细胞仪中产生荧光信号。
通过选择适当的激光器和探测器，可以同时测量多种不同波长的荧光信号，实现多参数的分析。
根据测量到的散射和荧光信号，流式细胞仪可以将细胞分为不同的亚群。
这种分选可以根据细胞的大小、形状、复杂度和荧光信号的强度来进行。
通过设定合适的参数和阈值，可以选择性地收集和分选出感兴趣的细胞亚群。
分选过程可以通过电荷击打、压力击打或光束偏转等方式实现。
流式细胞分析分选原理
• SS用于检测细胞内部结构 如:胞浆内颗粒多少, 核质比
侧向散射光
Light Scatter Gating
Side Scatter Projection
1000
Forward Scatter Projection
• 光源 与通过的细胞聚焦在同一点上
• 激光 空冷
488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green, 水冷
Innova300系列 固态
Innova70系列
检测信号
散射光信号—前向散射光(FS)
• FS----Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光 检测器
光路
• 光源 • 检测信号 • 光电倍增管PMT HV
电路
• 放大电路HV及GAIN 增益 • A/D转换
• 统计：计算机
流式细胞仪
光路
流路
电子
软件
软件
电路/ 电子
光路
流路Leabharlann 流路• 单细胞悬液• 大多数仪器是在50-300 µm 大小的孔径中, 将细胞悬液注射进入鞘液中
• 这一过程,成为流体动力学聚焦
670
APC
633
670
光路 - 滤片特性
• 当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过 一定波长的光,同时也可以阻断并折射该 波长以下的光
• 这种方式的滤片称为二向色性滤片 ( dichroic filter)
标准带通滤片 band pass
630/30 nm BP
流式细胞分选仪原理
流式细胞分选仪原理流式细胞分选仪是一种高级技术，通过对细胞进行分选，可以实现对生物学样品的复杂分析及细胞实验。
流式细胞分选仪的原理是分离，分析和获取单个细胞的鉴定信息。
本文将深入探讨流式细胞分选仪的原理及其工作原理。
流式细胞分选仪的原理流式细胞分选仪原理的核心是细胞的流式分析和分离，这是通过激光与细胞进行交互作用和光电学传感器进行反应实现的。
以下是流式细胞分选仪的核心原理：1.细胞磨灭和单个细胞的过滤细胞需要经过破碎和过滤的过程才能进入到流式细胞分选仪中，这样可以使细胞变成单个的、均匀的微小物体，从而方便流式细胞的分析和识别。
2.荧光染色在采样之前，需要将生物学样品进行荧光染色。
荧光染色增加可视性和如下的优点：荧光染色标记可以匹配基因表达谱，特异性标记具有相对高的突破性和稳定性；荧光染色活化荧光蛋白和其他化学染料（例如溶菌酶和邻苯二甲酸Rhodamine）的荧光，这可以用于进一步分析和控制细胞的生物学活性和行为。
3.激光照射与细胞交互作用激光照射是流式细胞分选仪原理的核心。
激光的作用是产生一个非常强的电场，它可以对荧光标记的分子发生选通作用。
经过激光照射后，荧光标记分子的光学特性发生改变，这可以使分子获得比荧光标记分子原样更多的信息。
4.光电增益器的检测光电增益器是流式细胞分选仪中的重要元件。
它可以将信号放大，从而提高光敏感度和信号的确性。
光电增益器会检测通过采样单个细胞的荧光信号并进行放大，而这些信号将转换为可视化、可读取的数据，所以它可以通过检测荧光信号并将这些信号转换为数字信号的方法，高效地对细胞进行定量建模。
5.流式细胞的参数排序流式细胞在此阶段被参数排序，将荧光强度以及其他参数作为依据，对细胞进行排序。
结果是通过细胞表面上的多个参数，包括在有机反应体系中人工合成的色素、化学标记物及其他添加的成分，来将细胞进行分离并识别。
6.细胞的收集最后，流式细胞分选仪将过滤、破碎的单个分离的细胞分离出来。
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• 尽量将分选后细胞的洗涤过程减少到1次，并丐休 整数小时后再进行培养或是后续处理
分选后回测
仪器的维护保养
1、开液流和高压预热>30分 2、定期更换鞘液滤器（一年一次） 3、分选前检查Nozzle和O-ring
4、及时清洗放置Nozzle的部位和Nozzle Locking Lever
Tips: 如何提升活力
• 无菌环境的控制
• 降低鞘液压力 • 增大喷嘴孔径，脆弱细胞必须要用大孔径喷嘴
• 包被样本收集管
• 温度控制
• 提升速度
流式分选仪的原理及应用
• 流式分选的原理
• 流式分选的影响因素
• 分选流程及注意事项
鞘液
• 必须使用盐离子缓冲溶液作为 鞘液，通常是PBS，不建议使 用生理盐水 • 特别需要维持合适的pH值， 通常为中性 • 无菌分选时，需要高压灭菌鞘 液（建议一直使用无菌鞘液） • 一般不加NaN3 • 注意更换鞘液过滤器
合适样本类型
• 细胞大小一般不超过喷嘴孔径 1/5，绝不能超过1/3 • 建议无菌样本，容易维持上样针 部分的无菌条件
• 减少有高浓度PI的样本，以克残 留在管路内，影响后续样本活性
• 浓度可在107/ml • 一定要使用300-400目孔径过滤 网过滤
分选前
• 建议先进行预实验，调整实验设置，并丐预估回 收率，选择合适的样本量
PSI Hz μm events/sec
分选最重要的问题
• Good Purity – 分选后所得到的细胞是否是想要的？ • Good Recovery – 分选后得到的细胞数量是否够用? • Good Viability – 分选后有多少细胞是活的？
Aria III — 高纯度 高得率
Sweet spot - 液滴断点自动监控 Accudrop - 液滴延迟自动调节 32等分液滴分辨率，精确分选模式
分选中
• 温度的改变对细胞不利，控制上样舱和收集 的温度
• 一些细胞需要特别的培养基或是血清来维持 活性，加入不超过2%的血清 • pH值的变化同样会对细胞活性有影响，加入 不超过25 mM的HEPES到收集管中有助于维 持pH • 样本的沉降容易导致速度的降低和细胞的聚 集，导致堵塞，样本分选前过滤，可使用混 匀功能或上样管过滤器，减少此类事件发生
收集
• 收集管预先用human AB serum包被，然后加入 0.4 mL X-VIVO 15 培养液 + 10% human AB serum 及 0.2% acetylcysteine（用于培养）， 或是PBS + 1% Human AB serum（仅用于回测） • 选择合适的收集管，并调节分选液流加电，使得 分选液流尽可能打在培养基、PBS、血清的液面 上，而不是管壁 • 收集后的细胞，用250g,10分钟进行离心，小心 取上清，用于后续实验
BD FACSAriaIII流式 分选仪的原理及应用
BD生物科学 孔祥涛
400-819-9900
COE_BDB_China@
流式分选仪的原理及应用
• 流式分选的原理
• 流式分选的影响因素
• 分选流程及注意事项
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快 速、准确、客观，并丐能够同时检测直线流动状态中的单个 细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理技 术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、 单兊隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。
分析型流式细胞仪 VS 分选型流式细胞仪
Calibur
AriaIII
Catch tuber （捕获管分选）
• 唯一可选配分选装置
的小型机。
提升活性
• 减少样本收集前后的处理过程，去除不必要的离 心和重悬
• 减少剪切力效应，轻柔使用移液枪
• 为减少细胞吸附到管壁，收集管使用聚丙烯材质， 并用100% human AB serum包被
• 分选中可暂停，轻柔混匀样本管和收集管，确保 细胞悬浮
分选后
• 分选后回测需要确保前后条件一致，确认进样针 管路无残留，回测样本无酚红
电子偏转的方式
流式分选仪的原理及应用
• 流式分选的原理
• 流式分选的影响因素
• 分选流程及注意事项
完美的分选速度Fra bibliotek纯度得率
高速分选的影响因素
•鞘液压力（Pressure ) •振荡频率 (Drop Frequency) •喷嘴大小 (Nozzle) •上样速度(Sample Flow Rate )
Thanks!
BDB 孔祥涛 400-819-9900
Purity and sort coincidence
• Purity is also maintained by detecting sort coincidence
Sort coincidence Two or more particles are too close together to be separated in two individual drops
高纯度分选,来自于分析的精度
Aria III 液滴32等分分析
Yield Mask
Tips: 如何提升分选的纯度
• 设置合适的分选模式 • 选择合适的喷嘴孔径 • 确保稳定的液流断点 • 设置正确的drop delay
• 进行4路分选时，将纯度要求高的细胞分选设置在 最外的2路
• 减少样本的粘连 • 正确的设门 • 确保上样管路清洁后回测
• Ficoll分离过的PBMC使用PBS+ 1% human AB serum 调整浓度到 1–2 x 107 PBMCs/mL
分选中
• 设门去除粘连体细胞
• 正确的分析 • 对于需要后续培养或是对于内毒素特别敏感的细 胞，建议完成无菌分选准备流程 • 选择合适的分选精度 • 选择合适的喷嘴孔径 • 选择合适的上样速度以保证纯度和得率
高得率分选,来自于液流稳定性
Sweet Spot — 液滴断点自动监测
• 液滴断点监测窗口 • 振幅自动调节，维持断点稳定
• 阻塞报警，保护分选样本不受
污染，实现分选时无人看管 • 提高分选纯度和得率
高纯度分选,来自于精确地充电
Accudrop —— 液滴延时自动控制
• 丏利的BD Accudrop技术能够自动地精确确定液滴延迟时间（细胞 颗粒与激光正交的时间和细胞颗粒到达断点处的时间这两个时间的 间隔）, 保证最高的分选纯度及得率。 • 全部自动完成精确计算，无需手动调节，并可实时监测。
Tips: 如何提升回收率
• 降低分选速度
• 减少纯度要求 • 正确的drop delay
• 正确的加电
• 合适的收集管
• 保护细胞活力
• 正确的设门
Aria III 对细胞的保护 — 高活性
影响细胞活性的因素： clean 1. 无菌处理 — Auto 1. 细胞本身状态 2. 圆滑管路设计
2. 细胞受到的撞击 3. NG流动池— 低功率激光照射 3. 激光照射 4. 电子减速 4. 细胞所处温度影响 5. 分选样本温控系统 5. 系统洁净程度 （4、25、37、42）
5、检查和更换快速接头o-ring 6、使用PBS（不要使用生理盐水），PBS要过滤（0.2um）
仪器的维护保养
7、选择合适的喷嘴和压力 8、液流启动完，立刻用DI清洗Closed Nozzle ，定期超声 清洗Closed Nozzle
9、更换Pinch Valve 管道
10、定期对上样架上润滑剂 11、做CS&T质控 12、定期整理实验实验数据（Data Manage）