亚硫酸盐还原菌及检测
油田污水中硫酸盐还原菌检测技术的研究进展
在 Ｓ Ｂ上 ， 以在荧光 显微镜 下能 很 明显地 观察 并计 Ｒ 所
算 出 Ｓ Ｂ的总 含量 。陈蓉 等 ［ 在 传 统 培养 检 测 技 术 Ｒ ７ ］ 的基础上结合显微镜直接检 测技术 ， 发出了一种快 速 开
作 者在 此综述 了近 年 来 国 内外 Ｓ ＲＢ检 测 技 术 的研 究
新 进展 ， 并分 析 比较各种 检 测技术 的优 缺点 ， 拟为选 择
的增 加 ， Ｒ Ｓ Ｂ代 谢 旺 盛 ， 长 高 峰 期 延 长 ， 含 量 的 生 高 Ｆ。对 Ｓ ｅ＋ ＲＢ生长繁 殖没有 抑 制作用 ； 但在 有氧 和无 氧 环 境下 Ｓ Ｂ生 长 的适 宜 ｐ 值不 同 。 Ｒ Ｈ
全导致 检测 结果偏低 。缩 短培养 时 间和完善 培养基 是 该方法 有待 提高 的方面 。
２ ２ 显微 镜直接 检测技 术 ．
的危 害程度 ， 由此 研究 者们提 出通 过测 定 Ｓ Ｂ代 谢 产 Ｒ 物 Ｈ： Ｓ的含量来 对 Ｓ Ｂ进行 检测 。李婉 义等［ ］ 立 Ｒ １建 ｏ
了 Ｔ ＭＢ法 ， 法 的 原理 为 ： 养 液 中三 碘 化 亚 甲基 Ｉ 此 培
氧 细菌 。Ｓ Ｂ的生长 繁 殖受 到 很 多 因素 的影 响 ， 温 Ｒ 如 度 、 Ｈ 值 、 化度 及 聚丙 烯酰 胺 （ ＡＭ） 度 等 。 山 ｐ 矿 ＨＰ 浓 丹 等口 研究 了温 度 、 Ｈ 值 、 化 度及 ＨＰ ｐ 矿 ＡＭ 浓度 对
的阳性 反应 和 稀 释 倍 数 ， 算 污水 样 中 细 菌 的 含 量 。 计 该 法 的依据是 ＡＰ Ｒ － ８ 国石 油学 会推 荐 的地 下注 ＩＰ３ 美 入水 分 析方法 中的绝 迹稀释 法 。 白莉［ 发明 了能直 接 ５ ］ 用 于测定 Ｓ Ｂ含 量 的测试液 和测试 瓶 。 Ｒ
亚硫酸盐还原菌的检测与灭菌方法
中 图分 类 号 ：ＴＵ９ １ ２ ９ ．１ 文献 标 识 码 ：Ｃ 文章 编 号 ：１０ —４ ０ （０ ２ ０ ０ ０ ６ ２ ２ ０ ）９—０ ８ —０ ０４ ２
亚 硫 酸 盐 还 原 厌 氧 菌 是 一 类 具 有 还 原 亚 硫 酸
水样 检 测 ： １ ０ ｍＬ水 样 于 ７ 取 ０ ５℃ 下 加 热 １ ５ ａ ｎ 以杀 灭 营 养 型 细 菌 并 选 择 性 保 留 亚 硫 酸 盐 还 ｒｉ，
原厌氧菌孢子 。
盐 、 芽 孢 、 氧 等 特 点 的 菌 群 ， 不 是 某 个 菌 属 的 有 厌 而
张旭 东 ， 王 恩福 ， 李 嫱
（ 津 自来 水 集 团有 限公 司 ，天 津 ３ ０ ４ ） 天 ０ ０ ０
摘 要 ： 对 某 水 厂 处理 水 中亚 硫 酸 盐还 原 厌 氧 菌 含 量 的检 测 结 果 表 明 ， 前 余 氯 值 对 确保 灭 滤
菌 效 果起 着 关键 作 用 ， 当滤 前 余 氯 ＞ １０ｍｇＬ、 触 时 间 为 ９ ｉ 右 时 ， 达 到 １０ ． ／ 接 ５ｒ ｎ左 ａ 可 ０ ％的 灭 菌率 ，
１
在 滤 前 余 氯 值 、 温 基 本 相 同 的条 件 下 ， 过 延 水 通 长 预 氯 化 接 触 时 间 可 明 显 提 高 灭 菌 效 果 （ 表 见
１。 ）
表 １ 不 同接 触 时 间下 的灭菌 效 果
２ ３
接 触 时 间 （ ｎ 原 水菌 含量 ｍｉ） 滤前 水菌 含 量 除率 原水菌 含 量 前水 菌含 量 除率 原水 菌 含量 去 滤 去 滤前 水菌 含量 去 除率 （ ／Ｏ 个 ｌＯｍＬ）（ ／Ｏ （ ） （ ／０ （ ／０ ） （ ） （ ／０ ） （ ／０ （ ） 个 ｌ ＯｍＬ） ％ 个 １ ０ｍＬ） 个 １０ｍＬ ％ 个 １０ｍＬ 个 １ ０ｍＬ） ％
硫酸盐还原菌的培养及检测方法的研究进展_王丹
收稿日期:2008-09-09作者简介:王丹(1983-),女(汉族),辽宁盖州人,硕士研究生,E -m ail w angdan0417@yaho o com cn ;游松(1963-),男(汉族),辽宁沈阳人,教授,博士,主要从事天然产物生物学与药学研究,T el .024-********,E -m ail y ousong206@y ahoo com cn 。
文章编号:1006-2858(2009)06-0502-05硫酸盐还原菌的培养及检测方法的研究进展王 丹,贾 贞,游 松(沈阳药科大学生命科学与生物制药学院,辽宁沈阳110016)摘要:目的综述硫酸盐还原菌的培养及其检测方法的研究进展。
方法在查阅国内外文献的基础上,以其中的26篇文献为依据,对硫酸盐还原菌的培养及检测方法进行分析和归纳。
结果与结论由于硫酸盐还原菌自身的特点,尤其在制药等行业废水治理方面的优势,硫酸盐还原菌的研究已引起人们的广泛关注。
通过综述硫酸盐还原菌的培养方法及其检测技术,为该菌的进一步研究打下了基础。
关键词:硫酸盐还原菌;培养;检测;废水处理中图分类号:Q 81 文献标志码:A硫酸盐还原菌(su lfate -reduc i n g bacteria ,SRB)是一类形态、营养多样化,利用硫酸盐作为有机物异化作用的电子受体的严格厌氧菌。
1895年首先由Be ij e rinck 发现,1903年De l d en 发表了有关海水中耐盐菌种的报道。
1925年E lion 发现了一种嗜热的SRB [1]。
SRB 生长能力顽强,生存环境广泛,是引起钢铁、金属等材料腐蚀的重要原因之一。
据估计,在美国,油井的腐蚀77%以上由SRB 造成[2]。
然而,由于SRB 可将硫酸盐异化还原生成硫化氢,硫化氢又能与废水中的许多重金属生成沉淀,使得SRB 在废水处理方面表现出很大的优越性和可行性[3-4]。
制药等行业排出的废水属于高硫酸盐有机废水,利用SRB 可有效去除废水中的硫酸盐,SRB 法得到了越来越多的重视。
食品中亚硫酸盐添加剂检验方法综述
食品中亚硫酸盐添加剂检验方法综述车毅*于杰（东港出入境检验检疫局，东港）摘要：本文对食品添加剂亚硫酸盐的使用，来源，危害与添加方式做了简要的阐述。
对食品添加剂亚硫酸盐的检测方法进行了归类，并指出其中优缺点。
列举不同国家对食品添加剂亚硫酸盐的检测标准和限量标准。
使读者对食品添加剂亚硫酸盐从使用、危害到检测、限量有一个清楚的认识。
关键词：亚硫酸盐、危害、来源、使用、添加方式、限量标准、检测方法1亚硫酸盐的危害、来源、使用与添加方式1.1亚硫酸盐的危害亚硫酸盐，通常指二氧化硫及能够产生二氧化硫的无机性亚硫酸盐的统称，是一类很早即在世界范围内广泛使用的食品添加剂。
但最初，并无各类亚硫酸盐的名称，直到1948年，被日本总的指定为食品添加剂[1]。
大量使用亚硫酸盐类食品添加剂会破坏食品的营养素[2]。
亚硫酸盐能与氨基酸、蛋白质等反应生成双硫键化合物，能与多种维生素结合，特别是与维生素B1的反应为不可逆亲核反应，结果使维生素B1裂解为其它产物而损失。
由此，FDA规定亚硫酸盐不得用于作为维生素B1源的食品[3]。
我国规定生产A级绿色食品不得使用硫磺漂白剂。
亚硫酸盐能够使细胞产生变异，亚硫酸盐会诱导不饱和脂肪酸的氧化。
人一天摄入1g亚硫酸盐时不会产生明显危害，摄入4～6g则可造成胃肠障碍，引起剧烈腹泻。
慢性中毒可引发头痛，二氧化硫可与血中硫胺素结合，能导致肝、脑、脾等脏器退行性变性，并且二氧化硫气体对呼吸道有刺激作用，能引发粘膜炎症、水肿、破坏红细胞等[4]。
哮喘者对亚硫酸盐更是格外敏感，因其肺部不具有代谢亚硫酸盐的能力[5]。
动物长期使用含亚硫酸盐的饲料会出现神经炎，骨髓萎缩等症状，并对成长有障碍。
实验表明，用含NaHSO3 0.1％的饲料喂养大白鼠2年，大白鼠发育受到抑制；用含Na2SO3 0.1％的饲料喂养大白鼠2年，大白鼠出现神经炎、骨髓萎缩等病症，生长发育缓慢。
二氧化硫的吸入可引起小白鼠肺、脑、肝、心、脾、肾，六种组织即生殖系统的氧化损伤作用[6]。
还原亚硫酸盐梭状芽孢杆菌检测方法
还原亚硫酸盐梭状芽孢杆菌检测方法亚硫酸盐梭状芽孢杆菌（Clostridium perfringens）是一种常见的致病菌，广泛存在于自然环境和动植物体内。
其在食品和水源中的污染常导致食物中毒和水源污染等健康问题。
因此，快速、准确地检测亚硫酸盐梭状芽孢杆菌的方法对于有效预防疾病的传播和保证食品安全至关重要。
以下将介绍一种常见的亚硫酸盐梭状芽孢杆菌检测方法，便于大家更好地了解和应用。
步骤一：样本的采集与准备首先，我们需要采集样本以进行亚硫酸盐梭状芽孢杆菌的检测。
常见样本有水、食品、环境表面等。
在采集样本时，应保持无菌操作，使用干净的工具和容器，避免外界污染。
步骤二：培养基的准备亚硫酸盐梭状芽孢杆菌的培养需要适宜的培养基。
一种常用的培养基是SFP（sulfite-polymyxin-sulfadiazine）培养基。
将SFP培养基按照规定的配方和方法制备好。
步骤三：样本的预处理将采集到的样本进行简单的预处理操作。
根据不同样本的特点，可以采用不同的方法，如过滤、浸泡、搅拌等，将样本中的悬浮物或沉积物与培养基充分混合。
步骤四：菌种的接种和培养将样本与SFP培养基混合好后，使用无菌技术将混合液接种到无菌培养基上。
可以采用平板法、管内法等不同的接种方式。
然后将接种好的培养基在适当的温度和湿度下培养，通常为35-37摄氏度，约18-24小时。
步骤五：菌落的观察与计数培养一定时间后，亚硫酸盐梭状芽孢杆菌会形成特征性的菌落。
观察培养基上的菌落形态、颜色、大小等特征，用肉眼或显微镜进行观察。
根据菌落的数量和特征，可以估算样本中的亚硫酸盐梭状芽孢杆菌数目。
步骤六：鉴定与确认对于观察到的菌落，还需要进行进一步的鉴定与确认。
可以使用生化试剂或分子生物学方法进行菌株的鉴定，以确定是否为亚硫酸盐梭状芽孢杆菌。
通过上述的亚硫酸盐梭状芽孢杆菌检测方法，我们可以快速、准确地检测出样本中是否存在亚硫酸盐梭状芽孢杆菌，为预防疾病传播和保障食品安全提供有力支持。
羽毛羽绒中亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌特性研究
羽毛羽绒中亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌特性研究作者：谭玉静刘巧妮杨阳李彦王永林来源：《中国纤检》2011年第19期摘要:通过选择性培养基从羽绒中分离得到一株亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌S1,研究了其形态特征、生理生化特征和在不同氧气含量条件下生长的特征。
结果表明分离菌株S1在亚硫酸铁琼脂培养基上，37℃厌氧生长过夜后的菌落形态为：菌落圆形边缘整齐，表面干燥粗糙，颜色为黑色；显微观察到菌体两端钝圆，直杆状，无鞭毛，革兰氏阳性菌，产芽孢；在生理生化反应中，分离菌S1的西蒙式枸橼酸盐、MR-VP、甘露醇和葡萄糖反应均为阴性；动力为不扩散生长；硝酸盐培养基为阴性；木糖-明胶4℃呈液态，显色阳性。
对氧气的需求为严格厌氧。
关键词：亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌；形态特征；生理生化特征；氧气含量亚硫酸还原梭状芽孢杆菌是一类能将亚硫酸盐还原为硫化物的梭状芽孢杆菌，而不是一个专门的生物学分类单位，亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的代表性菌株是致黑梭状芽孢杆菌，其他较为常见的还有产气荚膜梭菌、肉毒梭菌和破伤风梭菌。
这类细菌有很强的抵抗力，可以在自然环境中存活很长时间，即使在经适当加工处理后其芽孢仍会存活，条件适宜时又会生长繁殖[1]。
其大量存在于人和动物肠道中，由粪便污染土壤，经伤口感染引起疾病。
亚硫酸还原梭状芽孢杆菌是羽毛羽绒检测中主要微生物指标之一，也是引起产品不合格的主要污染菌[2]。
而国内关于羽绒亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的特性分析报告很鲜见。
本文通过选择性培养基从羽绒中分离出一株厌氧亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌，然后研究其菌落特征，菌体显微特征、生理生化特征以及在不同氧气含量下的平板生长特性，以期为羽毛羽绒中准确检测厌氧亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌奠定基础，同时为国家标准的修订及规范企业提供实验室依据。
1材料与方法1.1试剂与材料菌种来源：亚硫酸还原梭状芽孢杆菌，本实验室分离；大肠杆菌，ATCC11229。
革兰氏染色试剂盒、芽孢染色液、微量生化鉴定管系列、亚硫酸铁琼脂培养基、厌氧液体培养基、庖肉培养基基础等均购自北京陆桥技术有限责任公司。
硫酸盐还原菌_SRB_的生态特性及其检测方法研究进展_胡德蓉
第3卷第3期2007年6月南 方 水 产South China Fisheries ScienceVol 13,No 13Jun 1,2007收稿日期:2006205219;修回日期:2006211207资助项目:科技部社会公益研究专项(2000D I B 50175)作者简介:胡德蓉(1982-),女,硕士研究生,从事海洋渔业资源与生态环境研究。
E 2mail:xiaohu458@hot m ail 1com 通讯作者:林钦,E 2mail:linqinscs@21cn 1com・综述・硫酸盐还原菌(S RB )的生态特性及其检测方法研究进展胡德蓉1,2,林 钦1(11农业部渔业生态环境重点开放实验室,中国水产科学院南海水产研究所,广东广州510300;21上海水产大学,上海200090)摘要:文章从碳源、氮源利用以及溶解氧、pH 值、温度和其它环境因子对其影响等方面综述了环境中硫酸盐还原菌(SRB )的生态特性,重点介绍了S RB 的检测方法,并讨论了各种检测方法的优缺点,以及随着科学技术和实验条件的进步对各种检测方法的改进。
另外还介绍了SRB 对水产养殖业发展所造成的危害。
关键词:硫酸盐还原菌(SRB );生态特性;检测方法中图分类号:Q93919 文献标识码:A文章编号:1673-2227-(2007)03-0067-06Detecti on and ecology character isti c of sulfate 2reduci n g bacter i aHU Der ong1,2,L I N Q in1(11Key L ab 1of M arine Fishery Ecology Environm ent and Pollution M onitoring &Control Techniques ;South ChinaSea F isheries R esearch Institute,Chinese A cade m y of Fishery Sciences,Guangzhou 510300,China;21Shanghai Fishery U niversity,Shanghai 200090,China )Abstract:This paper revie wed the ecol ogy characteristic of sulfate 2reducing bacteria (SRB )in the envir on ment fr om carbon s ource,nitr ogen s ource,oxygen,pH value,te mperature and other fact ors 1It als o e mphasized on the detecti on of SRB,and discussed the ad 2vantage of each detecti on method,and intr oduced the i m p r ove ment of detecti on method with the devel opment of technol ogy and experi 2mental con 2diti on 1I n additi on,the har m of S RB t o aquaculture devel opment was described 1Key words:sulfate 2reducing bacteria (SRB );ecol ogy characteristic;detecti on technique 硫酸盐还原菌(sulfate 2reducing bacteria,SRB )是生态系统中土著微生物类群,是一类形态各异、营养类型多样、能利用硫酸盐或者其它氧化态硫化物作为电子受体来异化有机物质的微生物,在其代谢活动中,除CO 2和水外,还产生高浓度的H 2S 为呼吸终产物[1-5]。
亚硫酸盐还原酶的分离纯化和酶学性质的研究
向粗酶液中加固体（ ＮＨ４） ２ＳＯ４ 至含量达 ３０ ％， 边加 边搅拌， 搅拌 １ ｈ， 使盐析完全让杂蛋白沉淀。于 １００００ ｒ／ｍｉｎ ４ ℃离心 ３０ ｍｉｎ， 取上清液。向上清液中继续缓慢 加入（ ＮＨ４） ２ＳＯ４ 至 含 量 达 ５０ ％， 边 加 边 搅 拌 ， 搅 拌 １ ｈ， 使目标蛋白析出。于 １００００ ｒ／ｍｉｎ ４ ℃离心 ３０ ｍｉｎ 收集 沉淀。
ＮＡＤＰＨ， 考 马 斯 亮 蓝 Ｇ－ ２５０， 牛 血 清 白 蛋 白（ＢＳＡ） （ 华 美 公 司 进 口 分 装 ， Ｂｉｏｍｏ 公 司 生 产） ； Ｓｅｐａｄｅｘ Ｇ － １００， ＤＥＡＥ－ ５２（ 华美进口分装， Ｐｈａｒｍａｃｉａ 公司生产） ； 溶 菌 酶 （ 北 方 同 正 进 口 分 装 ， Ｓｉｇｍａ 公 司 生 产 ） ； Ｔｒｉｓ （ Ｐｒｏｍｅｇａ 公司生产） ； 十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）（ Ｂｉｏｍｏ 公 司生产） 。其余均为国产分析纯。 １．２ 方法 １．２．１ 亚硫酸盐还原酶活力测定
将 样 品 与 已 知 分 子 量 的 标 准 蛋 白 质 进 行 ＳＤＳ － ＰＡＧＥ 电泳， 然后以相对迁移率对分子量对数作图， 从 图中求出亚硫酸盐还原酶的亚基相对分子质量。 １．２．５．２ 最适温度的测定
在 ｐＨ７．０ 的条件下， 于 １５～８０ ℃温度范围内按照 标准方法测定酶活， 研究不同温度对酶活力的影响， 以 酶活最高者为 １００ ％。 １．２．５．３ 最适 ｐＨ 的测定
于 ＤＥ－ ５２ 层 析 柱 （ "２．６×５６ ｃｍ） ， 该 层 析 柱 已 用 ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ 磷 酸 钾 （ ｐＨ７．７） 缓 冲 液 预 平 衡 。 调 节 流 速 为 ２ ｍＬ／ｍｉｎ， 用 约 ６００ ｍＬ 含 ＮａＣｌ ０．１～１．０ ｍｏｌ／Ｌ（ ｐＨ ７．７） 的 ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ 磷酸钾缓冲液直线盐梯度洗脱， 测定各收 集管液的酶活力及蛋白质含量。 １．２．３ 蛋白质含量的测定
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亚硫酸盐还原菌及检测一、生物学特性与卫生学意义亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌是梭状芽胞杆菌属的一群细菌，而不是一个生物学分类单位。
多指厌氧芽胞杆菌，代表性菌株是致黑梭状芽胞杆菌，其他常见的还有产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌等。
此类细菌的主要特征是将亚硫酸盐还原为硫化物，多为有动力的革兰氏阳性菌，可形成芽胞，厌氧生长。
厌氧亚硫酸盐还原菌的孢子在自然环境中广泛存在，通常出现在人和动物的粪便排泄物，废水和土壤中。
与大肠杆菌和其它杆菌不同的是，由于它们的孢子比营养体对物理和化学因子具有更强的抵抗力，所以可以在自然环境中存活很大时间。
因而，通常将他们作为长期污染或间断污染的指示菌。
它们甚至可以抵抗正常水处理所用氯的工作浓度，因此，它们对判断是否已达到控制目的非常有用。
由于此类细菌抵抗力强，即使在经适当加工处理的加工食品中其芽胞仍会存活，条件适宜时又会生长繁殖，造成食品品质降低或腐败，甚至会引起食物中毒的危险。
因此在食品的制备、贮存以及食品加工厂环境卫生控制上颇受重视，作为食品、矿泉水、加工设备卫生、生产环境的卫生状况的评估指标，正确得到越来越广泛的应用。
该类细菌的检测多用于环境水质和生活饮用水污染状况的评估，在九十年代中后期开始在食品卫生领域中有所要求，但多局限于欧洲国家和地区，如法国、瑞士、英国、捷克等欧盟成员国。
到目前为止，该菌一般不被作为食品卫生常规检测项目和致病菌检测内容，我国和美国未将该检测项目列入食品微生物检测项目和要求中。
二、检测方法由于此类细菌以形成芽胞、厌氧生长和还原亚硫酸盐为硫化氢为主要特征，往往无需作进一步实验验证，因此在检测中将满足以上三个条件的一群细菌全部认定为厌氧亚硫酸盐还原菌。
检测方法一般包括以下三部分：检样在接种前在80-100℃水浴中处理10-15分钟，以杀灭抵抗力弱的芽胞细菌的营养体，同时刺激芽胞的繁殖；通过选择性培养如亚硫酸铁盐琼脂等判定是否具有还原亚硫酸盐的能力，如果有则进一步与培养基中的亚铁盐如枸橼酸铁反应，使菌落呈现黑色；培养基接种后置于厌氧环境中培养确认厌氧特征。
也可在培养基中加入抗生素等抑制剂抑制其它非亚硫酸盐还原菌的生长。
下面详细介绍亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌的检验方法。
1.培养基和试剂1.1 氯化钠胰蛋白胨稀释液1.2 亚硫酸铁琼脂1.3 过氧化氢试剂2.仪器和设备2.1 均质器:用于处理固体样品2.2培养罐（箱）,带产生厌氧环境的设备或试剂2.3 恒温培养箱:37±1℃或46±1℃2.4 振荡器2.5 吸管:1mL、10mL,具0.1mL刻度2.6 培养皿:直径为90mm2.7 稀释瓶:容量为500mL和250mL的广口瓶2.8 天平:感量0.1g3.抽样和试样制备3.1 抽样参照SN0330-94规定抽样3.2试样制备无菌操作称取剪碎后的样品25g,置于装有225mL氯化钠胰蛋白胨稀释液的广口瓶中。
若检测亚硫酸盐还原梭菌的芽胞,可75℃ 20min或煮沸保持10min 热处理样品,之后以流水迅速冷却至室温后再称取。
充分混匀后据样品污染情况做进一步的系列十倍梯度稀释。
4.检验步骤与计数4.1菌落计数法适用于检查未经加工处理的生鲜食品及亚硫酸盐还原梭菌计数>10g(mL)的食品。
4.1.1接种和培养4.1.1.1对每一份试样，选用适宜的三个连续稀释度的样液，分别用灭菌吸管吸取1 mL，一式双份地接种于每个灭菌的培养皿中。
4.1.1.2 倾注约15 mL制备好的并于水浴箱保温至45℃的亚硫酸铁琼脂。
从制备最初稀释液结束到倾注培养基于最后一个平皿所用的时间不应超过15min。
仔细将接种物和培养基充分混匀，水平放置，使其凝固。
4.1.1.3待混合物凝固后，在倾注10 mL同样的培养基于已凝固的培养基上作为隔层以防氧吸附，并防止细菌蔓延生长。
4.1.1.4 待该隔层凝固后反转制备好的平板，于37±1℃厌氧培养24-48h。
若对培养温度有特殊要求（如46℃），可依据情况进行培养。
4.1.2计数4.1.2.1亚硫酸盐还原梭菌在亚硫酸铁琼脂上呈暗灰色或黑色菌落。
37±1℃厌氧培养24h后，计数典型的菌落；若平板上无特征性菌落或菌落较小（<0.5mm），则需继续培养24h再计数；若48 h后的菌落增大以至相连，则以24 h的计数为准，反之则以48h为准。
S）的厌氧菌生长时也可还原亚硫酸盐而导致培养那些仅产生氢（而不是H2基出现弥散的、非典型的普遍变黑，这种现象不应计数。
4.1.2.2取特征性菌落（不少于5个）移种于疱肉培养基中，37±1℃厌氧培养24-72 h。
待出现生长特征（培养液浑浊、产气、出现异味）后，按5条进行证实试验。
对阳性结果进行计数。
4.1.2.3读取带有10-100个黑色菌落的平皿，结果以相应稀释度的两个平板的菌落数平均值乘以相应稀释倍数来计算每克样品中亚硫酸盐还原梭菌数。
结果报告如下：估计亚硫酸盐还原梭菌数/g(mL)。
若相应测试试样的两个平板上均无特征性菌落，以<10/g(mL)报告4.2最近似值（MPN）法适用于检查亚硫酸盐还原梭菌计数≤10 g(mL)及含有受损伤的亚硫酸盐还原梭菌的加工食品。
4.2.1接种和培养4.2.1.1增菌选用适宜的三个连续稀释的样液，从每个样液中分别吸取1mL，一式三份地接种于3管装有疱肉培养基的试管中,接种后上面覆盖一层无菌的液体石蜡，37±1℃培养24-72h。
待出现生长特征（培养液混浊、产气、出现异味）后,按5.1条进行镜检。
反之，则报告阴性。
4.2.1.2分离培养取4.2.1.1增菌培养物1mL置于灭菌的培养皿中，倾注约15mL45℃的亚硫酸铁琼脂。
仔细将接种物和培养基充分混匀，待其凝固后，再倾注10mL同样的培养基作为隔层，于37±1℃厌氧培养24-48h。
生成的暗灰色或黑色菌落，按5条加以证实；反之，则报告阴性。
4.2.2结果计算4.2.2.1计数每个稀释度得到的阳性反应管数。
4.2.2.2利用MPN表，由阳性管数估算每克（毫升）试样中亚硫酸盐还原梭菌最近似值。
结果报告如下：估计亚硫酸盐还原梭菌数/g(mL)。
5.证实试验5.1形态观察取疱肉培养物涂片，镜检，作革兰氏染色，检查培养物细菌形态。
亚硫酸盐还原梭菌为革兰氏阳性杆菌，单个散在，成对、成小链状或并列地聚堆存在。
产芽胞时，芽胞呈卵圆形或球形，位于中央、次终端或终端。
5.2过氧化氢酶试验在洁净载玻片上滴1滴培养物，再滴加1-2 滴3% 的过氧化氢。
出现小气泡说明有过氧化氢酶活性。
亚硫酸盐还原梭菌不形成过氧化氢酶。
附录：A1 氯化钠胰蛋白胨稀释液将8.5g氯化钠和1.0g胰蛋白胨溶解于1000 mL蒸馏水中。
调节pH至7.2±0.1。
分装225 mL于250 mL广口瓶中，121℃高压灭菌15min。
A2 亚硫酸铁琼脂胰蛋白胨 15.0g大豆蛋白胨 5.0g酵母浸膏 5.0g偏重亚硫酸钠 1.0g柠檬酸铁铵 1.0g琼脂 20.0g蒸馏水 1000g将各成分混匀，加热溶解，调节pH至7.6±0.1，分装于500 mL锥形瓶中各250 mL，121℃高压灭菌15 min。
一周内用完。
A3疱肉培养基牛肉浸液 1000 mL蛋白胨 30.0g酵母浸膏 5.0g磷酸二氢钠 5.0g葡萄糖 3.0g可溶性淀粉 2.0g碎肉渣适量取碎肉渣分装15mm×150mm试管约2-3cm高，将上述液体培养基分装至每管内超过肉渣表面约1 cm。
121℃高压灭菌15 min。
A4 过氧化氢酶试验挑取培养物一接种环，置于洁净载玻片上，滴加3%过氧化氢溶液（临用时配制）2mL，于半分钟内观察发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。
耶尔森氏菌及检验耶尔森氏菌属包括11个种，其中对人有致病性的有三种：小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核菌和鼠疫菌。
只有小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核菌已确定是食源性病原体。
鼠疫耶尔森氏菌引起黑疽病，不通过食品传染。
1981年根据DNA以及生化和形态特征的相关资料，与小肠结肠炎耶尔森氏菌极为密切3个同源群被作为耶尔森氏菌的新种命名，它们是弗氏耶尔森氏菌（Y·frederiksenii）、中间型耶尔森氏菌（Y·intermedia）和克氏耶尔森氏菌（Y·krislensenii）。
一、生物学特性1、形态特性本菌为革兰氏阴性杆菌或球杆菌，大小为1-3.5×0.5-1.3μm，多单个散在，有时排列成短链或成堆。
本菌不形成芽胞，无荚膜，有周鞭毛；但其鞭毛在30℃以下培养条件形成，温度较高时即丧失，因此表现为30℃以下有动力，而35℃以上则无动力。
2、培养特性本菌生长温度为30-37℃，但在22-29℃才能使本菌的某些特性出现。
4℃时能保存和繁殖。
本菌世代时间长，最短亦需40分钟左右。
在SS或麦康凯琼脂上于25℃经24小时培养，菌落细小，至48小时直径才增大成0.5-3.0mm。
菌落圆整、光滑、湿润、扁平或稍隆起，透明或半透明；在麦康凯琼脂上菌落淡黄色，如若微带红色，则菌落中心的红色常稍深。
本菌在肉汤中生长呈均匀混浊，一般不形成菌膜。
3、生化特性表一：本菌的生化特性及其与近缘菌的鉴别4、生物型小肠结肠炎耶尔森氏菌的生物型分类方法有几种，目前FDA细菌分析手册第八版中采用的是Wanters 1981的分型方。