硫酸盐还原菌鉴定和检测方法的研究进展
硫酸盐还原菌浓度检测和腐蚀活性监测方法研究进展
DOI ：10.19965/ki.iwt.2022-0884第 43 卷第 12 期2023年 12 月Vol.43 No.12Dec.，2023工业水处理Industrial Water Treatment 硫酸盐还原菌浓度检测和腐蚀活性监测方法研究进展王彦然，唐永帆，肖杰（中国石油西南油气田分公司天然气研究院，四川成都 610213）[ 摘要 ] 国内外已形成多种硫酸盐还原菌（SRB ）浓度检测和腐蚀活性监测方法，适用条件各有差异。
详细论述了SRB 浓度检测和腐蚀活性监测方法的研究进展。
首先基于方法形成的理论基础对SRB 浓度检测方法进行了分类，主要包括基于细菌培养、基于SRB 代谢物质、基于遗传基因、基于特异性生物酶和基于生物传感器5大类；并分别选取具有代表性的绝迹稀释法、同位素标记法、PCR 技术、酶联免疫吸附法和电化学传感器等经典方法，重点阐述各类方法的操作要领和应用特征。
其次基于SRB 的腐蚀机理，探讨了形成SRB 腐蚀活性连续监测方法的理论基础，据此将监测方法分为基于生物膜演变和基于代谢产物积累两类方法；并针对目前已形成的电化学监测方法和硫离子选择电极法阐述了研究进展，剖析了实际应用中存在的问题。
最后结合油气田对SRB 腐蚀评价和控制的实际需求，对SRB 浓度检测和腐蚀活性监测方法的发展趋势进行了展望。
［关键词］ 硫酸盐还原菌；检测方法；腐蚀活性；细菌代谢［中图分类号］ TE991；X835 ［文献标识码］A ［文章编号］ 1005-829X （2023）12-0058-08Research progress on methods of concentration detection and corrosiveactivity monitoring of sulfate reducing bacteriaWANG Yanran ，TANG Yongfan ，XIAO Jie（Research Institute of Natural Gas Technology ，PetroChina Southwest Oil & Gasfield Company ，Chengdu 610213，China ）Abstract ：A variety of methods have been developed for concentration detection and corrosion activity monitoring of sulfate reducing bacteria （SRB ） at home and abroad ，but the application conditions of which are different. In this paper ，the research progress of SRB concentration detection methods and corrosion activity monitoring methods was described in detail. At first ，the methods for SRB concentration detection were classified based on the theoretical ba⁃sis of the method formation ，which mainly included five categories ： bacteria cultivation ，metabolites of SRB ，genetic genes ，specific biological enzyme and biosensor respectively. Some of the classical methods ，including extinction di⁃lution method ，isotope -signed method ，polymerase chain reaction ，enzyme -linked immunosorbent assay and electro⁃chemical biosensor ，were selected respectively ， and the operation essentials and application characteristics of each method were emphasized. Then ，based on the corrosion mechanism of SRB ，the theoretical basis of corrosion activity SRB monitoring technology was discussed. And the monitoring methods were divided into two groups ：biofilm evolu⁃tion and metabolite accumulation. The research progress of electrochemical monitoring method and sulfur ion selec⁃tive electrode method was discussed and the problems existing in practical application were analyzed. Finally ，thedevelopment tendency of SRB concentration detection and corrosion activity monitoring methods was prospected.Key words ：sulfate reducing bacteria ；detection methods ；corrosion activity ；bacterial metabolism硫酸盐还原菌（SRB ）是一类广泛存在的兼性厌氧微生物，在代谢过程中，主要以有机碳源或铁作为电子供体，以硫酸盐作为电子受体，最终将硫酸盐还原生成硫化氢，促进金属的化学或者电化学反应〔1-2〕，导致金属腐蚀。
油田污水中硫酸盐还原菌检测技术的研究进展
在 Ｓ Ｂ上 ， 以在荧光 显微镜 下能 很 明显地 观察 并计 Ｒ 所
算 出 Ｓ Ｂ的总 含量 。陈蓉 等 ［ 在 传 统 培养 检 测 技 术 Ｒ ７ ］ 的基础上结合显微镜直接检 测技术 ， 发出了一种快 速 开
作 者在 此综述 了近 年 来 国 内外 Ｓ ＲＢ检 测 技 术 的研 究
新 进展 ， 并分 析 比较各种 检 测技术 的优 缺点 ， 拟为选 择
的增 加 ， Ｒ Ｓ Ｂ代 谢 旺 盛 ， 长 高 峰 期 延 长 ， 含 量 的 生 高 Ｆ。对 Ｓ ｅ＋ ＲＢ生长繁 殖没有 抑 制作用 ； 但在 有氧 和无 氧 环 境下 Ｓ Ｂ生 长 的适 宜 ｐ 值不 同 。 Ｒ Ｈ
全导致 检测 结果偏低 。缩 短培养 时 间和完善 培养基 是 该方法 有待 提高 的方面 。
２ ２ 显微 镜直接 检测技 术 ．
的危 害程度 ， 由此 研究 者们提 出通 过测 定 Ｓ Ｂ代 谢 产 Ｒ 物 Ｈ： Ｓ的含量来 对 Ｓ Ｂ进行 检测 。李婉 义等［ ］ 立 Ｒ １建 ｏ
了 Ｔ ＭＢ法 ， 法 的 原理 为 ： 养 液 中三 碘 化 亚 甲基 Ｉ 此 培
氧 细菌 。Ｓ Ｂ的生长 繁 殖受 到 很 多 因素 的影 响 ， 温 Ｒ 如 度 、 Ｈ 值 、 化度 及 聚丙 烯酰 胺 （ ＡＭ） 度 等 。 山 ｐ 矿 ＨＰ 浓 丹 等口 研究 了温 度 、 Ｈ 值 、 化 度及 ＨＰ ｐ 矿 ＡＭ 浓度 对
的阳性 反应 和 稀 释 倍 数 ， 算 污水 样 中 细 菌 的 含 量 。 计 该 法 的依据是 ＡＰ Ｒ － ８ 国石 油学 会推 荐 的地 下注 ＩＰ３ 美 入水 分 析方法 中的绝 迹稀释 法 。 白莉［ 发明 了能直 接 ５ ］ 用 于测定 Ｓ Ｂ含 量 的测试液 和测试 瓶 。 Ｒ
硫酸盐还原菌的培养及检测方法的研究进展_王丹
收稿日期:2008-09-09作者简介:王丹(1983-),女(汉族),辽宁盖州人,硕士研究生,E -m ail w angdan0417@yaho o com cn ;游松(1963-),男(汉族),辽宁沈阳人,教授,博士,主要从事天然产物生物学与药学研究,T el .024-********,E -m ail y ousong206@y ahoo com cn 。
文章编号:1006-2858(2009)06-0502-05硫酸盐还原菌的培养及检测方法的研究进展王 丹,贾 贞,游 松(沈阳药科大学生命科学与生物制药学院,辽宁沈阳110016)摘要:目的综述硫酸盐还原菌的培养及其检测方法的研究进展。
方法在查阅国内外文献的基础上,以其中的26篇文献为依据,对硫酸盐还原菌的培养及检测方法进行分析和归纳。
结果与结论由于硫酸盐还原菌自身的特点,尤其在制药等行业废水治理方面的优势,硫酸盐还原菌的研究已引起人们的广泛关注。
通过综述硫酸盐还原菌的培养方法及其检测技术,为该菌的进一步研究打下了基础。
关键词:硫酸盐还原菌;培养;检测;废水处理中图分类号:Q 81 文献标志码:A硫酸盐还原菌(su lfate -reduc i n g bacteria ,SRB)是一类形态、营养多样化,利用硫酸盐作为有机物异化作用的电子受体的严格厌氧菌。
1895年首先由Be ij e rinck 发现,1903年De l d en 发表了有关海水中耐盐菌种的报道。
1925年E lion 发现了一种嗜热的SRB [1]。
SRB 生长能力顽强,生存环境广泛,是引起钢铁、金属等材料腐蚀的重要原因之一。
据估计,在美国,油井的腐蚀77%以上由SRB 造成[2]。
然而,由于SRB 可将硫酸盐异化还原生成硫化氢,硫化氢又能与废水中的许多重金属生成沉淀,使得SRB 在废水处理方面表现出很大的优越性和可行性[3-4]。
制药等行业排出的废水属于高硫酸盐有机废水,利用SRB 可有效去除废水中的硫酸盐,SRB 法得到了越来越多的重视。
硫酸盐还原菌(SRB)处理废水的研究进展与现状
题 受 到 了人 们 极 大 的关 注 。废 水 处 理 法 中 的 生 物 法 由 于 成 本低 、 果好 而倍 受 青 睐 ， 硫 酸 盐 还 原 菌 （ｕ ａ 效 以 Ｓｌ ｔ ｆｅ Ｒ ｄｃ ｇＢ ｃ ｒ Ｓ Ｂ 为 代 表 的生 物 沉 淀 法 作 为 一 项 ｅｕｉ ａｔ ｉ Ｒ ） ｎ ｅａ， 新 的实 用 技 术 应 用 前 景 广 阔 。 近 年 来 ， 们 对 硫 酸 盐 人 还原 菌 的 研 究 越 来 越 深 入 ， 内 外 学 者 对 硫 酸 盐 还 原 国 菌研 究 做 了大 量 的 工 作 ， 括 Ｓ Ｂ的 生 态 特 性 、 理 学 包 Ｒ 毒 研究 及 其 污 染 与 防 治 方法 、 离 及 筛 选 、 理 工 艺 及 反 分 处 应器 等 ｌ ｊ ｌ 。从 使 用 单 一 Ｓ Ｂ菌 种 发 展 到 使 用 Ｓ Ｂ复 Ｒ Ｒ 合功 能 菌 群 及 Ｓ Ｂ污 泥 体 系 ， 分 批 沉 淀 发 展 到 厌 氧 Ｒ 从 污 泥 床 、 化 床 工 艺 ｌ ９， 立 了 硫 酸 盐 还 原 过 程 中 流 ６ 】建 Ｉ Ｓ Ｂ的 限 制 性 生 态 因 子 的 神 经 网 络 模 型 ， 量 描 述 反 Ｒ 定
递、 化 ， 图 １ 示 。 氧 如 所
质 量 ： 生 的硫 化 氢 与溶 解 的 金 属 离 子 反 应 ， 成 不 可 产 生 溶 的 金属 硫 化 物 从 溶 液 中 除 去 ； 酸 盐 还 原 一 方 面 消 硫 耗 水 合 氢离 子 ， 得 溶 液 ｐ 使 Ｈ值 升 高 ， 属 离 子 以 氢 氧 金 化 物形 式 沉 淀 ； 另一 方 面 ， 酸 盐 还 原 反 应 降 低 了溶 液 硫 中 硫酸 根 浓 度 ； 酸 盐 还 原 反 应 以 有 机 营 养 物 氧 化 产 硫
硫酸盐还原菌_SRB_的生态特性及其检测方法研究进展_胡德蓉
第3卷第3期2007年6月南 方 水 产South China Fisheries ScienceVol 13,No 13Jun 1,2007收稿日期:2006205219;修回日期:2006211207资助项目:科技部社会公益研究专项(2000D I B 50175)作者简介:胡德蓉(1982-),女,硕士研究生,从事海洋渔业资源与生态环境研究。
E 2mail:xiaohu458@hot m ail 1com 通讯作者:林钦,E 2mail:linqinscs@21cn 1com・综述・硫酸盐还原菌(S RB )的生态特性及其检测方法研究进展胡德蓉1,2,林 钦1(11农业部渔业生态环境重点开放实验室,中国水产科学院南海水产研究所,广东广州510300;21上海水产大学,上海200090)摘要:文章从碳源、氮源利用以及溶解氧、pH 值、温度和其它环境因子对其影响等方面综述了环境中硫酸盐还原菌(SRB )的生态特性,重点介绍了S RB 的检测方法,并讨论了各种检测方法的优缺点,以及随着科学技术和实验条件的进步对各种检测方法的改进。
另外还介绍了SRB 对水产养殖业发展所造成的危害。
关键词:硫酸盐还原菌(SRB );生态特性;检测方法中图分类号:Q93919 文献标识码:A文章编号:1673-2227-(2007)03-0067-06Detecti on and ecology character isti c of sulfate 2reduci n g bacter i aHU Der ong1,2,L I N Q in1(11Key L ab 1of M arine Fishery Ecology Environm ent and Pollution M onitoring &Control Techniques ;South ChinaSea F isheries R esearch Institute,Chinese A cade m y of Fishery Sciences,Guangzhou 510300,China;21Shanghai Fishery U niversity,Shanghai 200090,China )Abstract:This paper revie wed the ecol ogy characteristic of sulfate 2reducing bacteria (SRB )in the envir on ment fr om carbon s ource,nitr ogen s ource,oxygen,pH value,te mperature and other fact ors 1It als o e mphasized on the detecti on of SRB,and discussed the ad 2vantage of each detecti on method,and intr oduced the i m p r ove ment of detecti on method with the devel opment of technol ogy and experi 2mental con 2diti on 1I n additi on,the har m of S RB t o aquaculture devel opment was described 1Key words:sulfate 2reducing bacteria (SRB );ecol ogy characteristic;detecti on technique 硫酸盐还原菌(sulfate 2reducing bacteria,SRB )是生态系统中土著微生物类群,是一类形态各异、营养类型多样、能利用硫酸盐或者其它氧化态硫化物作为电子受体来异化有机物质的微生物,在其代谢活动中,除CO 2和水外,还产生高浓度的H 2S 为呼吸终产物[1-5]。
硫酸盐还原菌的快速检测方法的完善
新
疆
有
色
金
属
５ ３
硫 酸盐还原 菌 的快速检测 方法 的完 善
左 小 刚
（ 新疆众和股份有限公 司 乌鲁木齐 ８ ３ ０ ０ １ ３ ）
摘 要 使用银 电极测定硫 酸盐还原菌指数生长期 内的硫酸盐还原菌 的数量可以实现低浓度硫 酸盐还原菌的快速检测 。但是 ， 银 电
离 子 的浓 度 的对 数 具 有很 好 的 线性 关 系 ，其斜 率 相
随体 系中硫 离子浓 度变化 的关系曲线
同， 为１ ４ ． ２ ｍ Ｖ・ ｄ ｅ ｃ ～ 。 当体系中硫离子的浓度 ＞ ２ ． ２ ×
１ ０ Ｍ 时 ， 检 测 的结 果偏 离 该 线 性 关 系 ， 这 是 由于 硫
Ｒ
∞， ０ ， ｒ ｍ
图 ３ 在硫酸盐还原菌的指数 生长阶段使用银电极测定体 系中
硫 酸 盐 还 原 菌 数 量 的 工 作 曲 线
Ⅳ Ｂ Ｍ（ Ｍ Ｐ Ｎ ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ） ／ ｍｒ ’
图 ４ 校正后方法检测硫酸盐还原菌的数量和用 ＭＰ Ｎ法检测 的
硫 酸 盐还 原 菌 的数 量 的 结 果 对 比
极电位的变化是否单纯是 由于硫离子的影响还不能够确定。而且 ， 硫酸盐还原菌的生长过程对体 系的环境参数影响很大 。
关 键 词 硫酸盐还原菌 检测 银电极 电位
Ｏ 前 言
如 果体 系 中的硫 酸 盐 还原 菌 的生 长 不 处在 指 数 生 长期 范 围 内 ，需 要 怎么 样来 快 速 检 测硫 酸盐 还 原 菌 的数 量 呢？
Ⅳ ８ Ｒ Ｂ ， ｍｒ １
图 ２ 在含有不 同浓度硫离子体系中 。 硫酸盐还原菌的
油田硫酸盐还原菌快速定量检测方法
油田硫酸盐还原菌快速定量检测方法
油田硫酸盐还原菌快速定量检测方法
摘要：现有油田废水中硫酸盐还原菌检测周期长、检测费用较高,本研究应用聚合酶链式反应(PCR)技术与倍比稀释法(MPN)相结合的DSR-MPN-PCR法,对硫酸盐还原菌进行快速定量检测.从废水中制备了直接用于PCR扩增的菌液,保证了定量准确性;建立以硫酸盐还原菌亚硫酸盐还原酶基因(Dsr)为靶位点的`通用探针DSR1F和DSR5R的反应体系和扩增条件.结果表明,该方法检测灵敏度明显比液体稀释培养法高2个数量级,真实地表征了废水中实际的SRB菌数量,整个操作过程需要3～4 h,检测结果非常稳定,降低了检测费用,可以在生产中应用.作者：魏利马放王继华赵立军 WEI Li MA Fang WANG Ji-hua ZHAO Li-jun 作者单位：哈尔滨工业大学市政环境工程学院,哈尔滨,150090 期刊：环境科学ISTICPKU Journal：CHINESE JOURNAL OF ENVIRONMENTAL SCIENCE 年，卷(期)：2007, 28(2) 分类号：X172 关键词：硫酸盐还原菌菌液制备定量检测异化型亚硫酸盐还原酶 DSR-MPN-PCR法。
硫酸盐还原菌
硫酸盐还原菌硫酸盐还原菌 (Sulfate-Reducing Bacteria，简称SRB) 是一种厌氧的微生物。
广泛存在于土壤、海水、河水、地下管道以及油气井等缺氧环境中。
它能利用金属表面的有机物作为碳源，并利用细菌生物膜内产生的氢，将硫酸盐还原成硫化氢。
在某些环境中，硫酸盐还原细菌（SRB）能够在管道壁上聚集，使管道可能发生局部点蚀。
硫酸盐还原菌与有机物质和硫酸盐反应生成硫化氢和二氧化碳会与管道壁中的铁反应，产生不同形式的硫化铁。
硫化铁和管道中其他形式的沉积物形成大量的黑色粉末，这些黑色粉末比管道碳钢硬度大，故会对管道部件造成严重的腐蚀危害。
仪器和控制阀的污染 - 结垢可能导致测量结果不良，腐蚀会导致的部件损；堵塞过滤系统 - 当管道系统中含有过量的黑色粉末时，可能会导致过滤器寿命缩短；管道 - 黑色粉末增加了管道内壁表面的粗糙度，可能会引起严重或不受控制的腐蚀以至于导致管道失效；对于SRB，水是其存在且发生代谢活动的主要因素，要减少SRB的腐蚀影响，就需要对管道中的水汽进行控制或消除，并用适当的生物杀灭剂进行控制。
硫酸盐还原菌的检测SRB的生物腐蚀带来的危害和损失是巨大的，然而在对SRB进行控制和消除之前，需要对相关可能会发生腐蚀的场合进行SRB检测，以判断SRB是否存在以及含量多少，从而制定适当的治理方案。
目前，国内外学者对硫酸盐还原菌的检测方法进行了许多探索和研究，发明了许多检测技术，从原理上讲，主要分为：（1）培养法；（2）免疫学法；（3）atp法；（4）代谢产物定量法。
1培养法培养法主要有测试瓶法、琼脂深层培养法和溶化琼脂管法。
这些方法都是根据API RP-38美国石油学会推荐的地下注入水分析方法中的3管平行绝迹稀释法（Disappearing Dilution Method）进行的。
其中测试瓶法是利用瓶装的含乳酸盐、硫酸盐和fe2+（或金属铁）的培养基对待测水样进行接种培养，当待测样品中存在SRB时，经过培养瓶底会出现黑色的沉淀（FeS），以此作为SRB生长指示，从而确定水样中srb的含量。
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硫酸盐还原菌鉴定和检测方法的研究进展王明义1,2,梁小兵13,郑娅萍2,赵由之1,魏中青1(1.中国科学院地球化学研究所环境地球化学国家重点实验室,贵州贵阳 550002;2.贵阳医学院生物化学与分子生物学教研室,贵州贵阳 550001)摘 要 硫酸盐还原菌有着重要的生态、经济和环境意义。
系统地论述了硫酸盐还原菌鉴定和检测常用手段,如硫酸盐还原菌分离纯化培养方法、检测遗传标记的分子生物学方法和生物特征化合物方法。
这些技术的发展,不断扩展了硫酸盐还原菌的研究领域和深度并使对硫酸盐还原菌在分子水平的研究成为可能。
关键词 硫酸盐还原菌;分离纯化;遗传标记;生物特征化合物中图分类号 Q93-31 文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2005)06-0081-04Advanced in Identif ication of Sulfate2R educing B acteria andIts Detection MethodWAN G Ming2yi1,2,L IAN G Xi2bing1,ZHEN G YA2ping2,ZHAO Y ou2zhi1,WEI Zhong2qing1(1.State Key L ab.of Envi ron.Geochem.Inst.of Geochem.Chi nese Acad.of Sci.Guiyang,Guiz hou550002;2.Teach,&Res.Sect.of Biochem.&Molec.Biol.Guiyang Med.Coll.Guiyang,Guiz hou550001)Abstract Sulfate2reducing bacteria(SRB)play an important role in ecology,economy,and environment.Identifi2 cation of the bacteria and common detection methods were introduced,includin g the isolation,purification of the bacteria,the molecular biological methods based on the genetic markers and detecting methods of biologically charac2 teristic compounds.With the development of these technologies,it is possible to expand the research field and pro2 fundity of SRB and their research at molecular level.K eyw ords sulfate2reducing bacteria(SRB);isolation and purification;genetic markers;biologically characteristic compounds 硫酸盐还原菌(sulfate2reducing bacteria, SRB)是一大类严格厌氧菌,其利用硫酸盐作为有机物异化时的电子受体,并在代谢活动中产生高浓度H2S。
硫酸盐还原菌有着重要的生态、经济和环境意义。
研究表明硫酸盐还原菌参与有机物厌氧降解和低硫酸盐环境中碳的厌氧矿物化,其产生的H2S除了对很多微生物和其他生物有毒害作用,也可以作为一些硫代谢细菌的电子供体;同时由于硫酸盐还原菌产生的H2S、代谢过程中引起油和气体酸化以及细菌和FeS对孔隙的堵塞等原因可造成钢铁、金属等材料的腐蚀,引起工程设施受损[1,2]。
硫酸盐还原菌在倍受关注的甲基汞生物富集过程中起着重要作用,亦参与环境甲苯和二甲苯降解以及可溶性铀和不溶性铀转化[3～5]。
作为自然界中一类生物,硫酸盐还原菌是硫化物转化、物质循环和能量流动中不可缺少的参与者和发动者。
随着环境中硫酸盐还原菌研究的深入,要求建立准确可靠的硫酸盐还原菌鉴定和微生物群落结构中硫酸盐还原菌量化分析的方法。
本文围绕着对硫酸盐还原菌类群鉴定和量化分析方法作一综述。
收稿日期:2005-03-25 作者简介:王明义 男,主管检验师,硕士研究生。
研究方向为微生物分子生物学。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(40473050) 3通讯作者18微生物学杂志 2005年11月第25卷第6期 JOURNAL OF MICROBIOLOGY Nov.2005Vol.25No.61 硫酸盐还原菌分离纯化培养方法 硫酸盐还原菌分离纯化方法应用较多[6,7],多采用选择性培养基进行厌氧培养,常用的培养基为RP238肉汤。
硫酸盐还原菌大部分为中温性细菌,最适温度为30℃,但部分嗜热菌要求55℃生长,培养时应根据菌株的温度型选择培养温度。
硫酸盐还原菌在p H5～9.5的范围内生存,最适p H值为7.0～7.8。
取自高盐环境样品在进行硫酸盐还原菌培养时,还应加入2.5%的NaCl。
硫酸盐还原菌厌氧培养时所用培养基的氧化还原电位(Eh)要求在-100mV以下,通常添加巯基乙醇或抗坏血酸作为还原剂以获得较低的氧化还原电位。
同时培养基中加入的亚铁盐可以与硫酸盐还原菌代谢过程中产生的H2S形成FeS黑色沉淀,在固体培养基上可形成黑色菌落或菌落周围形成黑色沉淀环,液体培养基则表现为黑色混浊或沉淀成长。
硫酸盐还原菌分离纯化培养可以得到纯化菌株,有利于对菌株进一步分析。
但该法只能选择性地培养出硫酸盐还原菌某些类群,且分离培养后菌株的生理特性易发生改变等,有时并不能说明样品的真实情况。
选择适宜的培养基、正确的样品预处理和严格的厌氧实验条件是硫酸盐还原菌分离纯化培养获得成功的关键。
2 建立于检测硫酸盐还原菌遗传标记基础上的分子生物学方法 建立于检测硫酸盐还原菌遗传标记基础上的分子生物学方法主要有PCR、PCR2RFL P和原位杂交,常用的遗传标记主要有硫酸盐还原菌16S rRNA基因特征序列和硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶(dissimilatory sulfite reductase,dsr)基因。
2.1 PCR(polymerase chain reaction) PCR(polymerase chain reaction)技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,其目的是将微量DNA大量扩增。
PCR方法被广泛应用于硫酸盐还原菌的鉴定和检测中,所用引物多是依据硫酸盐还原菌6个主要类群的16S rRNA基因特征性序列而设计的,也有利用PCR对硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶基因分析的报道[8,9],Michael Wagner等对多种属于真细菌和一种属于古细菌的硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶基因进行PCR扩增,对扩增产物进行碱基序列分析,并进一步推导出亚硫酸盐异化酶氨基酸序列进行比较,结果表明硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶氨基酸序列有高度相似性(49%～89%),从而推断出属于真细菌和古细菌的硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶可能起源于同一个保守的酶。
PCR敏感性高、实验方法较为成熟,近几年被广泛应用。
但如何解决环境样品核酸提取和PCR对混合DNA样品中某些模板的优先扩增[10]等问题是成功应用PCR于硫酸盐还原菌鉴定和检测的关键。
2.2 PCR2RFLP(polymerase chain reaction re2 striction fragment length polymorphisms) RFL P即限制性片段长度多态性,是根据限制性核酸内切酶具有识别并切割目的DNA特殊碱基序列的特性,利用特定限制性核酸内切酶对目的DNA进行消化。
由于目的DNA碱基的突变或种属之间的差异可能会使酶切位点增加或减少,从而使酶切片断的数量和大小发生改变,可以在一定程度上反映出目的DNA分子的序列信息。
得出的限制性酶谱亦可以与标准菌株比较,进行微生物的鉴定。
RFL P常和PCR合用,利用RFL P对PCR产物进行消化,即所谓的PCR2 RFL P。
常选用硫酸盐还原菌SRB385基因片段和dsr AB基因片段进行PCR2RFL P,来进行硫酸盐还原菌特定基因的多态性分析或类群鉴定。
SRB385基因是δ群变形杆菌纲的微生物(包含大多数硫酸盐还原菌)16Sr RNA基因385～402bp 保守核酸序列,依据该基因建立的分子生物学方法所检测的微生物常特指硫酸盐还原菌所有类群。
dsr AB基因编码硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶,同一类群的硫酸盐还原菌中相当保守,在不同类群中却有较大差别,可以作为硫酸盐还原菌的分类与进化的指标。
Xueduan Liu[11]等利用PCR2RFL P分析了东太平洋海洋沉积物中的硫酸盐还原菌dsr AB基因多态性,表明该基因的分子多态性即硫酸盐还原菌类群多态性与海洋的深度、碳源生物利用度密切相关。
28 微 生 物 学 杂 志 25卷PCR2RFL P有很高的分辨率,结果的重复性和准确性也较高;不足之处是操作步骤繁琐,有较高的技术要求。
2.3 核酸分子杂交(hybridization) 核酸分子杂交技术是利用特异性探针对微生物的核酸序列进行检测,从而分析微生物群落结构、分布模式、丰度和特定微生物类群。
杂交所用的探针多采用依赖16S rRNA序列设计的寡核酸探针,杂交方式通常有菌落杂交、斑点印迹杂交和原位杂交,以斑点印迹杂交和原位杂交较为常用。
斑点印迹杂交(dot blot hybridization)通常是提取并点样于滤膜上的微生物16S rRNA与标记探针杂交,从而进行定性和定量分析。
定量斑点印迹杂交检测过程中常应用2种以上寡核苷酸探针,分别是测定所有微生物的通用寡核苷酸探针和特定微生物的特异性寡核苷酸探针。
样品杂交后信号强度与定量培养物制备的检测标准曲线进行比较,可以将测定信号转化为细胞数。
该法已被应用于硫酸盐还原菌定量检测中[12]。
定量斑点印迹杂交所用的探针常以放射性核素进行标记,具有较高的敏感性;同时16S rRNA是细胞内的可测产物,其含量可以代表特定微生物群体的生理活性。
但不同种的微生物体内含有不同数目的核糖体(103～104),甚至是同一菌株在不同的生长阶段其核糖体含量也不相同,使该方法在运用中存在一定的问题[13,14]。
目前应用较多的核酸杂交技术是原位杂交技术(in situ hybridization),这里的原位杂交技术是指不改变细胞形态和微生物小环境进行的杂交。
利用rRNA序列探针进行原位杂交,最早的标记物是核素[15],该方法需要较长时间的曝光和环境的污染。