高效液相色谱法
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高效液相色谱简介.pptx
HPLC组成示例
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高效液相色谱法的特点
高压：一般可以达到150~300kg/cm2高速：一般可以达到1~10mL/min高效：一般可以达到60000理论塔板/页
分类： 选择：
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高效液相色谱的应用
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THE END
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色谱流出曲线示意图
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有关术语 1）色谱流出曲线和色谱峰 2）基线 3）峰高 4）保留值（死时间、保留时间、调整保留时 间、死体积、保留体积、调整保留体积、相对保留值） 5）区域宽度（标准偏差σ,半峰宽W1/2，峰底宽度W）
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样品所含组分的最少个数； 定性分析（保留值）； 定量分析（峰高或面积）； 分离效能（保留值及区域宽度）； 两相选择的依据（峰间距离）论文内容
从色谱流出曲线中可以得出许多重要信息：
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高效液相色谱(HPLC)流程示意图
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HPLC组成图
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分配系数 K和分配比k K=(溶质在固定相中的浓度)/(溶质在流动相中的浓度) =Cs / Cm K为每一溶质的特征值，仅为固定相和温度有关，与两相体积论文内容、柱管特性及仪器无关。 k=(组分在固定相中的质量)/(组分在流动相中的质量) =Ms / Mm两峰间的距离由组分在两相间的分配系数决定；峰宽由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定。 两个理论（塔板理论和 速率理论）论文内容
1903年 Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分离了叶绿素） 20世纪四五十年代 出现了纸色谱（PC)和薄层色谱法（TLC)1952年 James和Martin提出了气相色谱法（GC)20世纪60年代后期 液相色谱法得到了快速发展 论文内容
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高效液相色谱法的特点
高压：一般可以达到150~300kg/cm2高速：一般可以达到1~10mL/min高效：一般可以达到60000理论塔板/页
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高效液相色谱的应用
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色谱流出曲线示意图
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有关术语 1）色谱流出曲线和色谱峰 2）基线 3）峰高 4）保留值（死时间、保留时间、调整保留时 间、死体积、保留体积、调整保留体积、相对保留值） 5）区域宽度（标准偏差σ,半峰宽W1/2，峰底宽度W）
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样品所含组分的最少个数； 定性分析（保留值）； 定量分析（峰高或面积）； 分离效能（保留值及区域宽度）； 两相选择的依据（峰间距离）论文内容
从色谱流出曲线中可以得出许多重要信息：
第8页/共16页
高效液相色谱(HPLC)流程示意图
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HPLC组成图
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分配系数 K和分配比k K=(溶质在固定相中的浓度)/(溶质在流动相中的浓度) =Cs / Cm K为每一溶质的特征值，仅为固定相和温度有关，与两相体积论文内容、柱管特性及仪器无关。 k=(组分在固定相中的质量)/(组分在流动相中的质量) =Ms / Mm两峰间的距离由组分在两相间的分配系数决定；峰宽由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定。 两个理论（塔板理论和 速率理论）论文内容
1903年 Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分离了叶绿素） 20世纪四五十年代 出现了纸色谱（PC)和薄层色谱法（TLC)1952年 James和Martin提出了气相色谱法（GC)20世纪60年代后期 液相色谱法得到了快速发展 论文内容
高效液相色谱法
2．高效液相色谱法与气相色谱法的比较
（l）气相色谱法：分析对象仅占有机物总数的20％。 高效液相色谱法：分离和分析占有机物总数近80％的那些 高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质。
（2）气相色谱：流动相与组分不产生相互作用力，仅起运 载作用。 高效液相色谱法：流动相对组分可产生一定亲和力，并参与 固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用， 相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数；
高压输液泵应符合下列要求：密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速 更换溶剂及耐腐蚀。
高压输液泵
常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱 柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差。 目前主要使用恒流泵，又称机械泵，它又分机械注射泵和机械 往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
（四）检测系统
两种基本类型的检测器： 溶质型检测器：它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应， 属于这类检测器的有紫外、荧光、安培检测器等。 总体检测器：它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应， 属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 （l）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）示差折光率检测器 （4）电化学检测器
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography，HPLC
§1
概 述
Introduction
一、高效液相色谱法概述
高效液相色谱法（HPLC）吸取了气相色谱与经典液相色谱优 点，并用现代化手段加以改进。
引入了气相色谱的理论;
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器; 具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点;
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
高效液相色谱法教学【全】精选全文
P307~311
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
高效液相色谱法
（2）化学键合固定相 ） B. 极性键合相 极性键合相指键合有机分子 中含某些极性基团，与空白硅胶相比， 中含某些极性基团，与空白硅胶相比，其极性 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 常用的极性键合相有氨基、氰基等。 常用的极性键合相有氨基、氰基等。氨基键合 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈-水 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈 水
二、液相色谱的流动相
1. 流动相特性
（mobile phases of LC） ）
（2）化学键合固定相 ）
化学键合固定相是应用最广的色谱法。 化学键合固定相是应用最广的色谱法。将固定液的官能团键
合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 一般认为有分配与吸附两种功能。 一般认为有分配与吸附两种功能。 a. 硅氧碳键型： 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 硅氧硅碳键型： 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂， c. 硅碳键型： 硅碳键型： d. 硅氮键型： 硅氮键型： ≡Si—C ≡Si—N
4.6
高效液相色谱法
高效液相色谱法(high pressure Liquid 高效液相色谱法 chromatography，HPLC)是利用物质在两 ， 是利用物质在两 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 当两相作相对移动时， 当两相作相对移动时，被测物质在两相之间做 反复多次的分配， 反复多次的分配，这样使原来微小的差异产生 了很大的分离效果，达到分离、 了很大的分离效果，达到分离、分析和测定一 些理化常数的目的。 些理化常数的目的。
高效液相色谱HPLC简介.ppt
种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不
同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
2
操作过程图示
3
色谱分离的机理
分离是一个 物理的过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 样品 (溶解于流动相中的溶质)
4
项目 进样方式 流动相 分离原理 检测器
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液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定 液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性 （反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的 游离羟基上。反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。
15
液相色谱类型
• 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 • 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。
16
色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2） 和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离 的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色 谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯 甲烷等。
9
检测器简介（二）
◆ 电导检测器（ECD） 原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、 灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。
高效液相色谱法
31
特点： 特点： 氰基键合相选择性与硅胶类似 键合相选择性与硅胶类似， ① 氰基键合相选择性与硅胶类似， 但极性更小。相同流动相， 但极性更小。相同流动相，组分保留 时间小于硅胶。 时间小于硅胶。 氨基键合相 主要用于糖类分析， ② 氨基键合相 主要用于糖类分析， 糖类分析专用柱 分析专用柱。 是糖类分析敏度： 紫外、荧光、电化学、 紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏 度检测器使用。 度检测器使用。 最小检测量： 最小检测量： 10-9 ~10-11 g 4. 高度自动化： 高度自动化： 采用色谱专家系统为核心的色谱智 能化和仿真优化技术， 能化和仿真优化技术，使 HPLC不仅能 不仅能 自动处理数据，绘图和打印分析结果， 自动处理数据，绘图和打印分析结果， 而且还可以自动控制色谱条件。 而且还可以自动控制色谱条件。
32
2. 流动相极性与容量因子的关系 流动相极性大，洗脱能力增加， 流动相极性大，洗脱能力增加， k 减小，tR 减小；反之， k 与 tR 均 减小， 减小；反之， 增加。 增加。 极性小的组分先出柱
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四、正、反相色谱法 正相HPLC（normal phase HPLC） （ 正相 ） 固定相： 固定相：极性 常用：改性硅胶 硅胶、 常用：改性硅胶、氰基柱 流动相: 非极性（或弱极性） 流动相 非极性（或弱极性） 常用： 正己烷 常用： 流动相极性小于固定相极性
11
第二节 分离机制 一、液-固吸附色谱法 固吸附色谱法
(Liquid-Solid Chromatography)
（一）吸附机理 根据吸附剂对样品中各组分的吸 根据吸附剂对样品中各组分的吸 附能力差异而分离 而分离。 附能力差异而分离。 吸附过程是被分离组分的分子 与流动相分子争夺吸附剂表面活性 中心(active center)的结果。 的结果。 中心 的结果
高效液相色谱法
60年代研制出气动放大泵、注射泵及低流量往复式 柱塞泵，但后者的脉冲信号很大，难以满足高效液 相色谱的要求。1970年代，往复式双柱塞恒流泵， 解决了这一问题1970年代后，科克兰制备出全多孔 球形硅胶，平均粒径只有7μm，具有极好的柱效， 并逐渐取代了无定形微粒硅胶。之后又制造出的键 合固定相使柱的稳定性大为提高，多次使用成为可 能。1970年后，适合分离生物大分子的填料又成为 研究的热点。1980年后，改善分离的选择性成为色 谱工作者的主要问题，人们越来越认识到改变流动 相的组成是提高选择性的关键
• 流程：如左图所示，流 动相贮器⑴中的流动相 被泵⑵吸入，经梯控制 器按一定的梯度进行混 合然后输出，测其压力 和流量，导入(3）进样 阀（器）经（4）色谱柱 后到（5）检测器检测， 由（7）记录仪记录色谱 图，（6）为废液。
特点（高效液相色谱法有“四高一广”的特点）：
①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受 到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必 须对载液加高压。 ②高速：分析速度快、载液流速快， 较经典液体色谱法速度快得多，通常 分析一个样品在15～30分钟，有些样 品甚至在5分钟内即可完成，一般小于 1小时。
HPLC已在环境监测中得到广泛应用,特别 适用于分子量大、挥发性低、热稳定 性差的有机污染物的分离和分析如多 环芳烃、酚类、多环联苯、邻苯二甲 酸酯类、联苯胺类、阴离子表面活性 剂有机农药、除草剂等,其中多数属于 美国环保局(EPA)清洁水法案中颁布的 114项优先有机污染物范围。
5.在药品检验中的应用: 现在,在药品质量标准中,对有关物质检查的要 求越来越高,一个药物从合成原料到制备有 关的制剂,再经过贮备、运输、使用,要经过 一段较为复杂和漫长的过程,在此期间,每一 个过程都有可能产生有关的物质,如生产中 可能带入原料、试剂、中间体、副产物和 异构体等;在贮备和运输过程中,可能产生降 解产物,聚合物等。为了保证药物的安全有 效。同时也要考虑到生产的实际情况。因 此,对药物的研究,可以允许有一定量的无害 或低毒性的有关物质液相仪器各厂家的仪 器展。还有对药品的含量测定
高效液相色谱法HPLC
VS
报告结果
整理分析数据，撰写分析报告，提供各组 分的浓度、纯度等相关信息，为科研或生 产提供决策依据。
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实验操作步骤
流动相的准备与平衡
根据实验要求配制流动相，通过泵以适宜的流速 通过色谱柱进行平衡。
洗脱与检测
流动相带着样品经过色谱柱洗脱，各个组分依次 流出并进入检测器进行检测。
ABCD
进样
将样品注入进样器，通过压力将样品送入色谱柱 进行分离。
数据处理与结果分析
对检测器输出的信号进行处理，得到各组分的峰 形和峰面积，进行定性和定量分析。
01
02
03
04
进样
将样品注入色谱柱。
分离
在流动相的带动下，样品中的 组分在色谱柱中进行分离。
检测
检测器对分离后的组分进行检 测，并记录信号。
数据处理
对采集到的数据进行处理、分 析和存储。
高效液相色谱仪的维护和保养
定期清洗色谱柱
使用适当的溶剂清洗色谱柱， 以去除残留物和杂质。
维护和检查检测器
定期检查检测器的性能和准确 性，确保其正常运行。
数据处理系统
用于采集、处理、分析和存储色谱数据，通常采用色谱工 作站。
高效液相色谱仪的操作流程
01
02
03
样品准备
将样品进行适当处理，以 便注入色谱柱。
流动相制备
根据实验要求，选择合适 的流动相，并进行过滤和 脱气处理。
系统平衡
在进样之前，确保色谱系 统达到平衡状态，以提高 分离效果。
高效液相色谱仪的操作流程
样品的预处理
分离
对于复杂样品，需要进行分离操 作以去除杂质或提取目标成分。 常用的分离方法包括离心、过滤、
高效液相色谱法
➢分配色谱法（partition chromatography） ➢吸附色谱法（adsorption chromatography） ➢离子交换色谱法（IEC） ➢空间排阻色谱法（SEC）
➢化学键合相色谱法
其他色谱类型
➢亲合色谱法（affinity chromatography； AC）
➢手性色谱法（chiral chromatography； CC）
高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操 作严格，这是它的主要缺点。
第一节 高效液相色谱仪
➢组成
➢输液系统 ➢进样系统 ➢色谱柱系统 ➢检测系统 ➢数据记录处理系统
此外还配有辅助装置：如梯度淋洗， 自动进样及数据处理等。
其工作过程如下：首先高压泵将贮 液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱 柱，然后从控制器的出口流出。当注入 欲分离的样品时，流经进样器贮液器的 流动相将样品同时带入色谱柱进行分离， 然后依先后顺序进入检测器，记录仪将 检测器送出的信号记录下来，由此得到 液相色谱图。
➢ 高压输液泵输送流动相，流速快，分析速 度快；
➢ 高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外 检测器最小检测限可达109g，而荧光检测 器最小检测限可达1012g。
高效液相色谱法与气相色谱法相比
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20 ％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、 热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采 用高效液相色谱法进行分离和分析。
➢特殊用途的键合相
（二）、键合相的性质和特点
➢(1)键合反应
➢硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅 胶进行硅烷化反应
R1 Si OH + Cl Si C18H37
R2
➢化学键合相色谱法
其他色谱类型
➢亲合色谱法（affinity chromatography； AC）
➢手性色谱法（chiral chromatography； CC）
高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操 作严格，这是它的主要缺点。
第一节 高效液相色谱仪
➢组成
➢输液系统 ➢进样系统 ➢色谱柱系统 ➢检测系统 ➢数据记录处理系统
此外还配有辅助装置：如梯度淋洗， 自动进样及数据处理等。
其工作过程如下：首先高压泵将贮 液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱 柱，然后从控制器的出口流出。当注入 欲分离的样品时，流经进样器贮液器的 流动相将样品同时带入色谱柱进行分离， 然后依先后顺序进入检测器，记录仪将 检测器送出的信号记录下来，由此得到 液相色谱图。
➢ 高压输液泵输送流动相，流速快，分析速 度快；
➢ 高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外 检测器最小检测限可达109g，而荧光检测 器最小检测限可达1012g。
高效液相色谱法与气相色谱法相比
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20 ％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、 热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采 用高效液相色谱法进行分离和分析。
➢特殊用途的键合相
（二）、键合相的性质和特点
➢(1)键合反应
➢硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅 胶进行硅烷化反应
R1 Si OH + Cl Si C18H37
R2
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（四）离子对色谱法 （五）分子排阻色谱法
二、色谱流出曲线和保留值
（一）色谱流出曲线及相关术语
（二）保留值
三、分离度
第三节 定性和定量分析
一、定性分析
（一）利用已知物对照法定性 1、利用保留特性 2、利用不同柱比较
（二）色谱法和其他方法结合定性
1、利用化学反应定性 2、利用二极管陈列检测器 3、收集峰的流出物
高效液相色谱法
第一节 概述
一、史程、专用术语
二、色谱分离过程和类型
液固吸附色谱 离子交换色谱 液液分配色谱
离子对色谱
空间排阻色谱
三、色谱流程和仪器
四、HPLC的特点
速度快，分辨率高，一、色谱分离过程
（一）液-固吸附色谱
流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸 附作用的不同来分离物质。
示例：用高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)测定重组 人肿瘤坏死因子(rh-TNF)衍生物的相对分子量
rh-TNF属基因工程药物，其相对分子量的测定 是该药质量控制的主要指标之一。
仪器与色谱条件：岛津LC-10A HPLC 色谱柱：Beckman Ultraspherogel SEC 3000 (30cm×7.5cm) 流动相 0.1mmol/L KH2PO4 :0.1mmol/L Na2SO4(1 : 1) + 0.05% NaN3
使用离子交换剂使物质分离表
样品 强酸型(磺酸型) 稀NH4OH洗脱 通过液 酸性、中性化合物 解离型、两性化合物 稀NaOH洗脱 强碱型(季铵型) 强碱型 稀HCl洗脱 通过液 通过液 酸性化合物 中性化合物 解离型物质 两性化合物 (盐、生物碱)
一、离子交换色谱的分离机理
第八节 一、分离机理 体积排阻色谱法
1、体积排阻色谱法（SEC）
或空间排阻色谱法（SEC） 或凝胶色谱法
2、凝胶过滤色谱法（GFC）
Sephadex 葡聚糖凝胶
3、凝胶渗透色谱法（GPC）
4、空间排斥理论
①
Xm
Xs
k = [Xs]/[Xm]
②
VR =V0 + K VS
Vs 色谱柱中凝胶的孔穴总体积
亲合色谱作为液相色谱的一个重要分支，对于生 物大分子的分离具有特殊的意义。原则上讲，如 果在固相载体上连接一种具有生物特异性的配基， 就可以建立一种亲合色谱方法，用于分离与配基 相对应的物质。
1、有机高分子类：多孔的硬质凝胶——交联聚 苯乙烯，交联聚甲基丙烯酸酯，亲水性高聚性 等树脂。 优点 ①具有均匀的粒度、较大的孔径、良好的刚性， 广泛的PH值的适应性 ②对于生物大分子样品都有较好的相溶性。 ③填料容易合成
lgK' = lg Kz + Zlg
1 D0
3 结论
二、离子交换色谱的固定相 1、高分子类型填料
① 优点 a填料的使用寿命长 b具有较高的色谱容量 c 很少有非特异性吸附，对于保持样品生物活性 有利。
② 结构 以交联共聚的苯乙烯-二乙烯苯为基质，同时 也出现了许多其他交联高聚物基质的固定相。 ③ 类型
3、主要用于分离极性不同的化合物，特别是 用来分离不同类型的化合物。
二、反相色谱
1、分离机理
2、固定相
3、流动相
第七节 离子交换色谱
离子交换色谱是以离子交换树脂作为固定相， 树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团， 当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时， 组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交 换，根据组分离子对树脂亲和力不同而得到分离。 按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子 交换树脂和阴离子交换树脂。
四、体积排租色谱法的流动相
在体积排租色谱法中，流动相的性质对保留值 和分离选择性无影响。 ① 溶解样品的良溶剂 ② 低黏度溶剂 ③ 柱填料不能在溶剂作用下收缩或溶胀
④ 控制流动相的PH值和离子强度 ⑤ 凝胶渗透色谱——示差折光检测器 流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率 有较大的差别。 凝胶过滤色谱——紫外吸收检测器 使用在检测波长无紫外吸收的溶剂作流动相。
Mono Beads TSK-gel DEAE-5PW SP-5PW
CM-5PW
2、无机基质型
三、离子交换色谱的流动相 1、流动相的PH值
① 离子交换容量受流动相的PH值影响
② 改变流动相PH值，也会影响弱电离的酸 性或碱性组分的电离情况，因而改变组分的 保留值。
③流动相PH值的变化也能改变分离的选择性
Kd=T-T0/(Tt-T0)
样品测定:
根据样品的保留时间T求出其分配系数Kd，由Kd 从标准蛋白相对分子质量曲线上查出相应的lgMr， 计算相对分子质量。
第九节 亲合色谱法 亲合色谱法是利用或模拟生物分子之间的专 一性作用，从复杂生物样品中分离和分析特 殊物质的一种色谱方法。 亲合色谱的概念可以理解为配位体以共价键 形式与不溶性载体连接作为色谱介质，高选择 性地吸附分离具有生物活性的物质，它将传统 亲合色谱的专一性与HPLC的快速，稳定，检测 方便等优点结合起来。
④ 对流动相PH值的控制，通常采用缓冲溶液 来实现。
2、流动相的离子强度
四、离子交换色谱的影响因素
1、填料孔径的影响 2、柱长的影响 3、流速的影响 4、PH值的影响
无论在强的还是弱的阴离子交换柱上，蛋白质 均显示不同PH值影响结果，因此决定了它的保 留选择性、分离度和回收率等因素。
5、离子强度的影响
1、
qxyP + L
PL
不足之处：忽略了在填料表面上形成复合物时 溶质被流动相中小分子饱和并不断进行计量置 换反应的重要因素。
2、
P0 + ZD0
P0：流动相中溶质的浓度 Pb：填料表面上被吸附的溶质浓度 D0：流动相中洗脱剂的浓度 Db：填料表面上洗脱剂的浓度
Pb + ZDb
Z：是蛋白质在吸附过程中从填料表面上被置换的 洗脱剂的数目。
流速: 1mL/min 检测波长:280nm
标准蛋白相对分子量曲线的制备： 选用四种蛋白：醛缩酶、血清白蛋白、碳酸酐 酶及抑蛋白酶肽制成的混合标样。考虑流速等 因素对保留时间T的影响而选用了内标法、既 在混合标样中加入右旋糖酐蓝和酪氨酸作为内 标，进样后可同时测的完全排阻和完全进入填 料孔的两种内标的保留时间T0和Tt，用分配系 数Kd对相对分子量对数作图，从而保证结果有 良好的重现性。
V0 死体积，相当于凝胶的粒间体积
二、体积排阻色谱法的特点
三、体积排阻色谱法的固定相
（一）固定相的分类 1、按固定相基质分类
2、按固定相机械强度分类
（二）凝胶固定相的特性参数
1、渗透极限 2、分离范围
3、固流相比
在SEC中常将柱中凝胶孔体积中的溶剂称为 固定相，而将柱中凝胶颗粒间空隙体积中称为 流动相，而凝胶孔体积与凝胶颗粒间空隙体积 的比值称作固流相比。 4、柱效
4、分子排阻色谱
5、亲和色谱
三、HPLC在生物大分子中的应用
在生物大分子中的HPLC中，体积排阻色谱，离 子交换、反相液相和亲和色谱是最常用的分离 模式。
第五节 液-固色谱法 液-固色谱法通常称为吸附色谱 1、载体：硅胶
2、吸附剂吸附试样的能力 3、原理
第六节 键合相色谱法
一、正相色谱法 1、在正相色谱法中共价结合到载体上的基团 都是极性基团。 2、分离机制属于分配色谱
4、HPLC-MS
二、定量分析 （一）峰面积或峰高的测量方法 1、手测峰高 2、峰高乘半峰宽 3、剪纸称重 4、积分仪测定
5、微处理机测定
（二）定量方法
1、峰面积归一法 2、外标法
3、内标法
4、内加法（或追加法）
第四节 高效液相色谱的分离模式
一、基本原理 二、分类 1、吸附色谱 2、分配色谱 3、离子交换色谱
（三）凝胶色谱柱的制备及谱图的特点 ①物理因素——影响凝胶色谱柱的性能 ② 扩大分离范围——使用两根以上的串联色谱 柱。 ③更换流动相
谱图的特点：在凝胶渗透色谱中，对不同分子量 聚合物色谱峰的谱带展宽不同于其它液相色谱。
① 在低效排租色谱法，样品分子大小随V的增加 而急剧减小，而柱效却随样品分子量的增加而增 大因此在色谱图上，不同分子量组分的谱带宽度 保持不变。 ② 在高效排租色谱法，峰宽却是个变量。
种类
强酸性
阳离子交换树脂 弱酸性 强碱性 阴离子交换树脂 弱碱性
-SO3H
COOH
-PO3 H
N (CH3)2X C2H4OH
N (CH3)3X
NR2
NHR
NH2
离子交换层析适用性
• 能在水溶液或含水极性溶剂中产生游
离离子基团的酸、碱及两性成分。可用于
氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等
水溶性成分的分离。
一、亲合色谱分离机理
亲合色谱是基于样品中各种物质与固定在载体 的配基之间的亲合作用的差别而实现分离的。
亲合色谱的过程是待分离物质与配基间的亲合 复合物形成及其解离的过程。
载体
X 待分离物质
L 配基
通过选择适当的流动相将结合在配基固定相的 组分洗脱下来：
a) 如果亲合复合物的亲合力不强
b) 当配基与被分离组分的亲合力较强
K=
Pb X (Db)z P0 X (D0)z
① Z可以小到忽略不计，反应常数变为分配系数
K d= Pb P0
② 在Z值不能忽略时
(Db)z K= Kd x (D0)z
在等度洗脱蛋白质的过程中，容量因子K’与保留 体积成比例，同时洗脱过程中，Kd， Db是常数， 用Kz表示。
1 K'= Kz x (D0)z
b) 洗脱液离子强度低增加到0.3-0.5mol/L c) 常用磷酸盐和硫酸盐进行离子强度的调节 d) 用氯化钠作离子剂，疏水作用最小 e) PH值不能太低，因为H+会腐蚀不锈钢柱