慢病毒转染细胞的操作具体方法及步骤
慢病毒转染
慢病毒转染
1、实验前一天，以每毫升3-5×10 4个目的细胞接种96孔培养板中的12孔，体积为90ul。
（不使用边上的孔，保持细胞状态良好）
2、感染预实验共分为四组，每组三个不同的MOI：1×108TU/ml、1×107TU/ml、1×106TU/ml
3、实验开始，配备1×108TU/ml、1×107TU/ml、1×106TU/ml，如病毒滴度为1×108TU/ml，取5ul病毒液稀释到45ul的ENi.S.中，在进行一次10被稀释即可。
4、取2ul10mg/mlpolybrene稀释到400ul，备用。
5、将10ul三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。
6、再设定需要添加polybrene的孔中加入10ulpolybrene稀释液。
7、混匀后继续培养，8-12小时候观察细胞生长状态，并更换为新鲜培养基。
8、感染3-4天后，观察荧光表达情况。
9、通过细胞感染效果，确认目的细胞的感染条件和感染参数。
选取效果最优的一组实验条件按相同的实验方法进行正式转染实验。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体(详细信息见附录及《质粒得扩增提取》）（大肠杆菌-８0℃保存2-3年,质粒-２0℃保存2—3年,病毒液—80℃保存１年)(１)载体质粒:两端得LＴR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp 得序列及位于env序列中得RRＥ,含宿主RNＡ聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）:包含了pｏl、gａｇ包装成分（３）包膜质粒（pＭD2、G):用其她病毒得包膜蛋白代替了ｅnv基因、三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力得病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTＲEME—ＧENＥ(－20℃保存，不可分装），一种脂质与其她组份构成得混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存)：5ＸPＥG800０／NaＣｌ溶液(聚乙二醇)：NaCl ８、766 g; PEG８00050ｇ溶解在2０0mｌMilｌi-Q纯水中,高压蒸汽灭菌＊＊也可直接从公司买来病毒液（—80℃封口膜封口冻存管保存,4℃保存３天）:滴度一般为10８TU/ml6、10ｍｇ/ml polyｂreｎｅ（-20℃分装保存）:溴化己二甲铵。
就是带正电得小分子，与细胞表面得阴离子结合,提高慢病毒对细胞得感染效率,通常加入pｏｌybrｅnｅ能提高感染效率２～1０倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度(1～１0μｇ/ｍl）7、无血清培养基:ｏｐtｉmｅn8、贴壁细胞(复苏后3代以上得细胞)９、puromｙcin:嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤＜一〉病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转)第一天１、种板,10×1０５个293Ｔ细胞，加入全培养基双抗ＤMＥM４—5ml，过夜2、配制5ＸPＥG８0０0/NaCl溶液称取NaCｌ8、766 g； PEG800０ 50g溶解在200ml Miｌli-Ｑ纯水中;1２1摄氏度３０miｎ湿热灭绝 30min；保存在4℃第二天１、配管2、加入２ml全培养基DMEM3、将1加入2,孵育10ｈ，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9：00与1７：0０各收取一次5ｍｌ培养液,共20mｌ（－80℃保存)2、过滤:用孔径为０、４5mm得过滤器除去上清中得29３T细胞3、加入5ml 5ＸPEＧ８０0０/NaＣｌ溶液,每30miｎ－1ｈ上下摇匀一次4、４℃过夜第六天１、4℃,3500rｐｍ，20ｍiｎ２、弃上清,倒扣纸上静置1－2min，吸干残余液体３、加入120—１50μlＰBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶４、５0μｌ分装，—80℃保存。
慢病毒转染步骤
转染法步骤：
1分至适宜浓度的细胞到六孔板中，次日细胞应30%~50%融合
2.第二天，吸掉板中的生长培养基并加入新的含聚凝胺的培养基，加入适当数量的病毒于细胞中（见“决定慢病毒效价”部分），每孔溶液终体积为3ml
注意：考虑到细胞在自旋过程中不一定能完全被培养基覆盖，不推崇减少六孔板中的溶液终体积。
调整孔中聚凝胺的终浓度为8mg/ml.通过涡旋六孔板轻轻地混合培养基，病毒以及聚凝胺。
3.为减少自旋-转染过程中悬浮物质的形成以及孔与孔之间液体接触的情况发生，用无菌微孔密封膜封闭六孔板（直接盖在板上），封闭好后，再在密封膜上加上一层未经灭菌的密封箔，最后盖上六孔板盖。
4.在标准的组织培养离心机中，37°C，2250rpm（1200g）条件下自旋-转染细胞60min.
5.一自旋-转染后就移走密封膜和密封箔，将孔中原有的培养基换为新鲜的生长培养基（每孔2ml就足够）
6.转染24h后，吸掉孔中的培养基并每孔加入新鲜的含有嘌呤霉素的2ml生长培养基。
注意：嘌呤霉素的浓度应被每个细胞株充分利用，一般规定在1-5μg/mL
7.进一步的培养时间主要取决于细胞株的类型以及转染后的实验分析。
通常，嘌呤霉素筛选细胞需要大约48h。
下面推荐的是结合给定的细胞株和分析实验来得到的嘌呤霉素筛选
时间
>转染后实验分析嘌呤霉素筛选细胞时间> mRNA knockdown (qPCR) 2+ days
> Protein knockdown (Western) 3+ days
> Phenotypic assay 表型分析3+ days
8.检测目的感染细胞的表面分子。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。
慢病毒感染细胞实验原理及步骤
慢病毒感染细胞实验原理及步骤1. 实验原理慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。
所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。
2. 主要材料细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、青霉素-链霉素溶液、慢病毒、Polybrene助转染试剂3. 主要试剂配制（1）PBS磷酸盐缓冲液：PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min，高压灭菌，4℃保存备用。
（2）细胞生长培养液：临用前根据需要在培养基中加入10%胎牛血清，再按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 ug/mL，置于4℃冰箱保存。
4. 实验步骤（1）胰酶消化细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为0.5~1×105/ml（根据情况酌情调整），每孔200ul细胞悬液接种至24孔板，培养箱培养过夜。
次日进行慢病毒感染，此时细胞的融合度约为70%左右。
（2）准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用瞬时离心机离心20秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。
根据实验按照MOI准确计算慢病毒用量，将其稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。
慢病毒转染实验流程
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1. 病毒液与靶细胞准备。
将慢病毒液从-80℃冰箱中取出，置于冰上融化。
贴壁细胞慢病毒转染步骤及方法
贴壁细胞慢病毒转染步骤及方法
一、细胞培养Panc-1 细胞，常规培养使用含10% FBS (GIBCO) 的DMEM 培养基（含1.5 mg/L-Glutamine，100 U/mL penicillin，100 μg/mL Streptomycin) 中，37ºC 5% CO2饱和湿度培养箱中培养。
二、病毒侵染实验材料及试剂DMEM培养基+ 10% FBSPBS（Life Science Products&Services）Trypsin-EDTA Solution (Gibco)24孔板（Corning）Lentivirus-NC 病毒液（GenePharma，1×109 TU/mL）
三、步骤
1. 将状态良好的Panc-1 消化后重悬，取适量细胞接种至24 孔板中，37°C培养箱中过夜；
2. 取阴性对照病毒，按1:10、1:100、1:1000 与DMEM培养基混合稀释，总体积约500 μL，并加入终浓度5 μg/mL Polybrene；
3. 吸去24 孔板中原培养基，换入阴性对照病毒梯度稀释液，37°C培养箱中培养；
4. 24h 后吸去阴性对照病毒稀释液，换入500 μL新鲜培养基，37°C培养箱中培养；
5. 48-96h 于荧光倒置显微镜下观察并记录结果。
悬浮细胞慢病毒转染步骤及方法
悬浮细胞慢病毒转染步骤及方法
实验材料与方法
一、细胞培养人红白血病细胞Kasumi-1，常规培养使用含10% FBS(GIBCO)的RPMI 1640 培养基（Hyclone）（含1.5 mg/L-Glutamine，100 U/mL Penicillin，100 μg/mL Streptomycin) 中，37ºC 5% CO2饱和湿度培养箱中培养。
二、病毒侵染实验材料及试剂
DMEM培养基+ 10% FBSRPMI 1640培养基+10% FBSD-Hank’s Solution96孔板（Corning）24孔板（Corning）Lentivirus-病毒液（GenePharma，1×108 TU/mL）步骤1. 稀释病毒：稀释液（靶细胞维持液培养基）400 μL + 终浓度5 μg/mL Polybrene，将慢病毒原液按1:20、1:10、1:5 加入到稀释液中；
2. 24-well，按4×105 cells/well（根据细胞种类调整），1000 RPM 3min，取细胞沉淀。
将Step 1 中各份病毒稀释液分别与每份细胞沉淀重悬，同时建立对照（blank、negative），37°C 5% CO2中培养；
3. 12~24h 后离心移去细胞侵染后的病毒液，加入0.5 mL 完全培液，37°C 5% CO2过夜
4. 根据细胞状态和类型，如果必要分出1/3~1/5，加入0.5 mL完全培养，继续培养24~48h；荧光倒置显微镜下观察结果。
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慢病毒转染细胞的操作步骤
一、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10^5/孔铺到24孔板中。
使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。
37℃孵育。
3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml 新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。
如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。
如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。
如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
二、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×10^5/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。
37℃孵育。
或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。
2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。
中间视细胞生长情况可传代或换液。