TILLING技术的最新进展及其在辐射诱变育种中的应用前景
新型分子标记的开发和利用
新型分子标记的开发和利用黄磊;唐光绪;田东;何庆元【摘要】比较遗传分析中常用的随机DNA分子标记、目的基因标记、功能性分子标记.综述了近年开发的几种分子标记,并对新型分子标记(功能性分子标记)进行阐述,如何利用Tilling技术和关联分析的方法开发功能性分子标记,并介绍了功能性分子标记的优点和利用前景.【期刊名称】《安徽农学通报》【年(卷),期】2010(016)023【总页数】4页(P43-45,61)【关键词】功能性分子标记;目的基因标记;Tilling;关联分析【作者】黄磊;唐光绪;田东;何庆元【作者单位】安徽科技学院生命科学学院,安徽凤阳,233100;安徽科技学院生命科学学院,安徽凤阳,233100;安徽科技学院生命科学学院,安徽凤阳,233100;安徽科技学院生命科学学院,安徽凤阳,233100【正文语种】中文【中图分类】Q75长期以来，植物育种选择都是基于植物的表型性状进行的，当性状的遗传基础较为简单或即使较为复杂但表现加性基因遗传效应时，表型选择是有效的。
但许多数量性状难以准确鉴定，根据表型提供的性状遗传潜力的度量是不确切的，因而选择是低效的。
遗传育种家们很早就提出了利用标记进行辅助选择以加速育种改良进程的设想。
但形态标记和常规遗传标记数量少、遗传稳定性差、且常常与不良性状连锁，因而利用受到很大限制。
分子标记是近年迅速发展起来的一种技术手段，它的出现使人们对于基因的准确检测，目标基因的分离，克隆和转移更为方便。
自1974年Grodzicker创立RFLP技术以来，目前已发展起了多种分子标记，按其技术基础主要可分为3类:(1)依赖杂交技术手段的分子标记，如RFLP;(2)依赖于PCR为基础的分子标记，如RAPD，SSR等;(3)一些新型的分子标记，如SNPs等［1］。
按其作用分为随机DNA分子标记(random DNA markers，RDMs)、目的基因分子标记(gene targeted makders，GTMs)和功能性分子标记(functional markers，FMs)［2］。
基因创新技术在育种中的应用与展望
基因创新技术在育种中的应用与展望近年来，随着科技的不断发展，基因创新技术在育种领域中得到了广泛的应用。
通过基因创新技术，我们可以对作物的特性进行精确、高效的改良，大大提高了作物产量、品质和抗病性。
本文就基因创新技术在育种中的应用和未来展望进行阐述。
一、基因编辑技术基因编辑技术是目前育种中的一项最为前沿的技术之一。
它可以对特定的基因序列进行定向改变和修复，从而达到精确育种的目的。
目前最常用的基因编辑技术是CRISPR/Cas9技术，该技术具有定向性、高效性、简便性等优点，已经广泛应用于农业领域。
在玉米、水稻、番茄等作物的育种中，利用CRISPR/Cas9技术改变目标基因序列，可以实现提高产量、改善口感、增强抗病性等目的。
例如，美国农业部科学家利用CRISPR/Cas9技术实现了玉米中一个有害的基因NPR1的精确编辑，从而增加了玉米的抗病性。
此外，基因编辑技术还可以应用于无公害农业和无公害畜牧业的发展，从而推动了可持续农业的发展。
二、基因组学技术基因组学技术是一种较为高级的基因创新技术，它可以通过测序和分析生物的基因组序列，探寻特定因果关系并发现潜在的目标基因序列，从而进行育种。
目前，基因组学技术的应用已经拓展到了所有生物体，包括植物、动物、微生物等。
在植物育种中，基因组学技术通常可以通过对不同品种的基因组进行比较，以找到一些与特定生长条件相关的基因，用于普及农作物生长等情况。
基因组学技术的应用可以降低育种周期和成本，从而可以大大提高作物的育种效率和效果。
此外，基因组学技术还可以用于动物育种，如猪、牛、鸡等，旨在节约资源、改善肉品品质、提高生产效率。
三、表观遗传学技术表观遗传学技术是近年来快速发展的基因创新技术之一，它可以通过DNA甲基化修饰、组蛋白修饰等方式，从而影响基因表达，从而参与调整生物个体的发育、繁殖、代谢等过程。
表观遗传学技术还可以通过对DNA序列的改变，从而控制基因表达，这样就可以达到育种的目的。
我国作物遗传育种学科的发展现状与“十三五”发展重点
作物遗传育种学科在农业科学中占有核心地位[1]，其根本任务是从基因型和环境2个层面研究并形成作物持续高产、优质、高效的理论、方法和技术，是关于大田作物生产与品种遗传改良的学科。
学科的创新发展，对保障国家粮食安全具有重大的意义。
粮食产量的“十一连增”[2]离不开作物遗传育种学科的创新和进步。
近年来，随着生物技术、信息技术和新材料技术的快速发展，我国的传统作物遗传育种学科迎来了新的发展机遇，成为生命科学领域具有发展潜力的学科之一，在基础、应用基础和应用研究方面取得了突破性进展，研发了1批重大的科技成果，对国家粮食安全和农业可持续发展做出了显著贡献。
1我国作物遗传育种学科的主要研究进展1.1基因组学等新技术广泛渗透近10a ，由“Next Generation Sequencing （NGS ）”技术引领的基因组学技术正在一个空前的高速度推动下迅猛发展。
目前，高通量NGS 技术已经成为生命科学领域中应用最为广泛的研究手段。
例如，完成了小麦A 、D 基因组等图谱的绘制[3，4]；构建了第2代玉米单体型图谱，其中包含了5500万个SNP 标记[5]；对二倍体棉花———雷蒙德氏棉全基因组进行测序，并阐述了棉花基因组的多倍化及其纤维发育[6]。
此外，基DOI ：10.16318/ki.hbnykx.2015.06.018河北农业科学，2015，19（6）：66-70Journal of Hebei Agricultural Sciences编辑蔡海燕我国作物遗传育种学科的发展现状与“十三五”发展重点张江丽1，董文琦2，杜晓东3*（1.中国农业科学院科技管理局，北京100081；2.河北省农林科学院，河北石家庄050051；3.河北省农林科学院农业信息与经济研究所，河北石家庄050051）摘要：作物遗传育种学科的创新发展，对促进现代农业的健康发展和保障我国粮食安全具有重大的意义。
作者总结了近年来我国在作物遗传育种学方面取得的主要进展，从基因组学、种质资源保护与利用、新基因挖掘、作物杂种优势机理及利用、分子标记育种、分子设计育种、作物细胞工程和诱变育种等方面分析了“十三五”重点发展的方向。
CRISPR技术的进展与未来展望
CRISPR技术的进展与未来展望近年来，CRISPR技术成为了生命科学领域的热点话题。
CRISPR是一种基因编辑技术，能够精确地改变DNA序列。
它的诞生标志着生命科学领域的一个巨大飞跃，对疾病治疗、新药开发等有着深远的影响。
本文将探讨CRISPR技术的进展与未来展望。
一、CRISPR技术的背景CRISPR技术源于自然界中细菌免疫系统的一种特殊机制，可将外来病毒基因特异性地剪切并摧毁。
如何将这一机制应用到人类基因领域，则是CRISPR首要面临的问题。
许多科学家在CRISPR上投入了大量时间和精力，致力于寻找新的方法和实践，以便能更好地应用CRISPR技术。
人们解锁了生命科学的新奥秘，启动了新的基因编辑革命的源头。
二、CRISPR技术的进展CRISPR技术的进展无处不在。
截至目前，全球已经有超过50个国家和地区的400多家学术机构和企业，开展了与CRISPR相关的科研工作。
下面，将从四个方面进行具体阐述。
1、基因诊断CRISPR技术可用于诊断基因突变等人类基因缺陷。
科研人员可以通过不到10美元的成本检测千兆碱基，并对其进行编辑。
CRISPR技术在基因诊断领域可谓是一个巨大的进展，有望缩短疾病的初期诊断时间。
2、基因治疗基因治疗是指通过基因编辑技术，对特定基因进行修正或加工，从而治疗一系列人类疾病。
CRISPR技术的出现使得基因治疗成为可能。
一些重大的疾病，比如癌症，可以被CRISPR技术治愈。
3、农业科技CRISPR技术在农业科技领域也有着有捷径的应用。
通过改变植物的基因，可以使其生长更快更健康，从而提高农业产量。
这对解决全球日趋严重的食品短缺问题是非常重要的。
4、新药开发新药的开发需要花费巨额的时间和成本。
CRISPR技术的出现为新药的开发带来了新的思考方式。
CRISPR技术可以帮助科学家更好地理解疾病发病机理，从而研发出更安全有效的药物。
三、CRISPR技术的未来展望CRISPR技术创造了一种全新的生命科学生态系统。
植物物理(辐射)诱变育种
植物物理（辐射）诱变育种物理诱变又称辐射诱变，是指通过各种辐射源对生物进行辐射诱变，常见辐射诱变源有中子、γ射线、Ｘ射线、电子束、离子束、紫外线等。
植物辐射诱变育种材料包括植物种子、小鳞片、活体植株、花粉、幼穗、幼胚及组织培养物等，由于处理方法、时间的不同，可分为内照射、外照射、急性照射、慢性照射。
辐射可以通过使相关材料在细胞、分子、生理和形态等方面发生变异，人们则通过对产生的突变体的选择和鉴定，直接或间接培育可供农业生产的新品种。
1植物物理（辐射）诱变育种特点遗传变异是生物进化和新品种选育的基础，植物物理诱变育种可以从以下几个方面为育种工作提供区别于自然变异产生的更多的材料。
（1）丰富种质资源：植物物理诱变育种可以通过诱导植物体产生变异，从而提高植物体变异频率，诱导产生具有自然界原本没有的新性状的突变体，在一定程度上极大地丰富了种质资源，直接或间接地为人们的育种工作的进行提供材料。
（2）打破基因连锁：通过基因重组，使基因进行重组是植物物理诱变育种工作中诱发突变体的表现之一，可以将一些伴随不良性状的有利性状间的紧密连锁打破，从而使育种工作者有更多的机会和选择。
（3）保持优良特性：物理诱变往往只是个别位点的基因产生突变，可以基本保持品种原有遗传特性基础上，对某个或某些性状进行改良，从而品种品质。
（4）缩短育种年限：诱变育种可以提高植物变异频率，且多为隐形突变，稳定快，育种年限短。
（5）改良植物育性：将远缘材料的花粉进行辐照处理，可促进受精结合，克服杂种不育；还能使正常植株产生雄性不育，为育种提供雄性不育材料；可以改良植物自交不亲和性。
2 植物物理（辐射）诱变育种不足之处辐射诱变可以为人们育种工作带来诸多便宜之处，但相对应的，也存在着一些缺点。
虽然辐射处理育种材料可以诱导其变异频率大幅度提升，但是诱导突变的方向却是难以控制的；虽然可以保持优良特性，但是难以在一次辐射后代中得到多种性状都优秀的突变体，同时改良多个或综合性状较为困难；有的辐射诱变，如快中子诱变，虽然可以大规模产生突变株系，但存在操作复杂和不可控的缺点，这是其在育种工作中的难题；此外，辐射诱变不随机、不可控的突变特点会使育种工作者投入更多的时间和资金。
tilling技术的原理与方法述评
tilling技术的原理与方法述评
Tilling技术是一种基因组高效筛选方法，其原理是利用化学或物理学手段随机诱导出基因组的点突变，并利用高通量测序技术对突变个体进行全基因组测序。
然后，将突变个体与野生型对照组的基因组序列进行比较分析，以鉴定和定位突变，从而快速识别相关基因和突变位点。
通常使用化学诱变剂例如EMS (ethyl methanesulfonate) 或物理诱变剂比如gamma射线，通过随机的方式改变DNA序列，从而导致突变。
突变后生成的杂种子代可以直接用于筛选目标基因，避免了常规定向构建突变库的过程。
Tilling技术的优点是能够快速、高效地筛选出多个基因组突变，而且无需构建特定基因的突变库，因此可以广泛应用于各种生物体中的基因功能分析和基因改良。
总体而言，Tilling技术是一种可靠、快速、高通量的基因组突变筛选方法，应用前景广阔。
TILLING技术原理及其路线
• 玉米
3）斑马鱼
参考文献
1.High-Throughput Screening for Induced Point Mutations. Plant Physiol.2019,126：480
2.TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Mol Breeding . 2019,37: 14
5.Discovery of induced point mutations in maize genes by TILLING. BMC Plant Biology 2019, 4:12
6.TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery. The Plant Journal (2019) 45, 684–694
• 但需要预先知道所研究基因的序列。
操作流程
操作流程
1）用甲基磺酸乙酯处理种子诱导位点突变；
2）播种诱变处理种子，按单株种植得到诱变 M1代植株；
3）播种M1代种子得到诱变M2代植株，自交获 得M2代种子并保存建库；
4）按单株提取M2代组织DNA，存放于96孔微孔 板建库；
5）5-8倍混合单株DNA库，构建DNA样品池以增 加扫描通量；
TILLING（定向诱导基因组局部突变） 技术原理及其路线
中国农业大学 齐孟文
TILLING是后基因组时代出现的，一种 将烷基化试剂EMS或辐射诱导的位点突变技 术，与特定基因的PCR扩增技术和突变单核 苷酸多态性检测技术或下一代基因俘获高 效测序技术相结合的反相遗传学方法。提 供了一种几乎对所有物种都适应的、低成 本、高通量和自动化的诱发突变筛选技术。 该技术也可用于天然群体自发突变的筛选， 称之为Eco-TILLING。
诱变育种的发展趋势
诱变育种是指用物理、化学因素诱导动植物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株/个体，进而培育成新的品种或种质的育种方法。
它是继选择育种和杂交育种之后发展起来的一项现代育种技术。
通过近几十年的研究人们对诱变原理的认识也逐步加深。
常规助杂交育种是染色体的重新组合，一般并不引起染色体变异，更难以触及到基因。
而辐射会对染色体的数目、结构等都会产生影响，使染色体发生缺失、断裂、倒位移位等变化。
诱变育种也有自身的弱点：一是诱变产生的有益突变体频率低；二是还难以有效地控制变异的方向和性质；另外，诱发并鉴定出数量性状的微突变比较困难。
因此，诱变育种应该与其它技术相结合，同时谋求技术上的自我完善。
而提高诱变效率，迅速鉴定和筛选突变体以及探索定向诱变的途径，是当前研究的重要课题。
空间诱变是20世纪80年代发展起来的助航天技术手段的诱变新技术，是空间技术、生物技术和农业育种技术相结合的产物。
生物体在空间特殊的环境下,产生可遗传的变异,从而获得有利的突变体。
空间诱变育种迄今已在农作物、蔬菜、花卉、微生物和昆虫卵等上进行了研究应用，特殊的的太空环境, 对植物生长、发育、生殖、遗传、癌变及衰老等方面有强烈的影响，很容易引起生物体的变异，通过对有益的变异体进行筛选，从而培育出作物的优良新品种，在生产上应用将产生巨大的社会经济效益。
空间诱变育种突变频率高、突变谱广、变异幅度大，良性变异多，有益突变率高，变异性状稳定较快，育种周期缩短，生物安全性高。
空间诱变既能明显改良作物的某些农艺性状,又可获得地面育种所难以得到且在重要经济性状上产生突破性影响的罕见突变。
因此，在生物品种改良上具有重要的现实意义。
我国政府十分重视空间诱变育种技术的研究与应用，并加大投入。
空间诱变作为产生新基因源和创造新种质的重要途径之一，已选育出的太空作物、太空蔬菜、太空花草、太空林木等越来越多。
空间诱变育种已成为我国空间生命科学研究的重要方面我国“神舟”号飞船的成功发射,为利用宇宙空间研究诱变育种开拓了广阔的前景。
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2001 发现了一种更经济
快速的 T IL L IN G 方法 , 它采用双色红外荧光检测 CEL I 酶切产物。CEL I 是一种对错配碱基( 异源双 链位点) 特异性切割的芹菜核酸酶。目前, 该技术 平台在国内外应用最为广泛。这一技术平台能够有 效排除假阳性条带, 因为杂质和干扰分子在红外光 区几乎不发光 , 用红外荧光检测不仅背景非常低 , 灵敏度也很高, 能够有效排除假阳性条带, 同时也 使得 T ILL ING 技术的高通量得以体现 : 筛选每块 96 孔微量滴定板相当于筛选了 768 个 M 2 单株 ( 8
图 1 植物中 T IL L IN G 的技术路线 [ 4]
3
TILLING 技术平台的发展
最初 T IL LING 技术是结合 EMS 诱导 突变以
96) , 每个目标筛选区段大约为 1000 bp, 那么每块 胶大约可以检测 750 kb 的基因组序列[ 7] 。 随着各种筛选技术的不断革 新, T IL LING 技 术平台日趋多元化 , 各种技术平台的区别主要体现 在异源杂合双链的检测手段方面。虽然, 目前以基 于酶切和双色红外检测系统的技术最为成熟和应用 最为广泛, 但是由于 CEL I 酶的分离步骤繁多和耗 时长, 而商品化的 CEL I 酶价格昂贵, 使得大规模 应用的成本难以承受。于是 , 近年来越来越多的筛 选技术逐渐引入 T IL L ING 技术平台中, 如焦磷酸 测序技术 ( pyr osequencing ) [ 8] 、基质辅助激光解吸 电离飞行时间质谱 ( M atr ix- Assist ed Laser Desorp t ion/ Ionizat io n T ime of Flig ht M ass Spect ro me t ry, 简称 M AL DI - T OF - MS ) 技术[ 9] 、构象 敏感毛 细凝胶电 泳技术 ( Conf orm ation - sensitive capillary elect rophoresis, 简称 CSCE) 以及高分辨率溶解曲 线 ( hig h resolut ion melt ing, 简 称 H RM ) 技
基金项目 : 中国科学院知识创新工程重要方向 项目 ( K JCX 2 -Y W -N 34 -3, K JCX2 -EW -N 05) ; 中国科 学院近代物理 研究所所长基 金 资助项目 ( Y 006090ZY 0) 作者简介 : 杜艳 ( 1983- ) , 女 ( 汉族 ) , 四川南充人 , 博士 , 研究实习员 , 从事植物诱变育种研究 ; E -mail: duyan@ impcas. ac. cn
T IL L IN C) 是一种全新的、高通量和低成本反向遗传学研究方法 。近年来, 随着突变筛选技术的革 新, T IL L ING 技术平台日趋多元化, 使得 T IL L ING 技术的操作更为简单、 快速 , 并广泛应用于作 物育种研究领域。简要介绍了 T IL L ING 技术平台的最新发展动态 , 并初步探讨了将辐射诱变处理 与 T IL L IN G 高通量筛选相结合在诱变育种中的应用前景 。 关 键 词: 定向诱导基因组局部突变技术; 高分辨率溶解曲线 ; 辐射; 诱变育种 中图分类号: Q691. 5; Q691. 8; Q506 文献标识码: A 是由美 国 F red H ut chinson 癌症 研究 中心 St even H eniko f 领导的研究小组发展起来的 , 一种全新的、 高通 量 和 低 成本 的 反 向 遗 传学 研 究 方 法
杜 艳1, 2 , 余丽霞1, 2 , 刘青芳1, 2 , 周利斌1, # , 李文建1,
( 1 中国科学院近代物理研究 所 , 甘肃 兰州 2 中国科学院研究生院 , 北京 730000; 100049)
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摘
要: 定 向诱 导 基因 组局 部突 变 技术 ( T arget ing Induced Lo cal L esions IN Genomes, 简 称
[ 13]
尽管 T IL LING 技术是一 种高通 量的筛 选手 段 , 但是传统的 T IL L ING 技术在构建初始的筛选 群体以及 DNA 样品的获得时依然需要投入大量的 时间 和 金 钱 , 所 以 目 前 只 有 关 于 Columbia 和 L andsberg erect a 这两个遗传背景的野生型拟南芥 的 T IL L ING 资源[ 16] 。在 H RM 技术 平台的 基础 上 , Bush 和 Kry san 于 2010 年对传统 T ILL ING 技
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通讯联系人 : 李文建 , E - m ail : w jli@ im pcas. ac. cn; 周利斌 , E -mail: libinz hou@ impcas. ac. cn
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原子核物理评论
第 28 卷
( 4) 将若干个 96 孔板 DNA 合并到一个 96 孔板( 最 多可合并 8 个) , 形成 DN A 池; ( 5) 根据感兴趣的 基因序列信息, 设计带有红外荧光标记的特异引物 进行多聚酶链式反应 ( Po lymerase Chain React ion, 简称 P CR) 扩增 ; ( 6) PCR 产物经多次变性、复性, 在含有突变位点处形成异源杂合双链 ; ( 7) 酶切, 用特异性核酸内切酶酶切异源双链 ( 一般使用 CEL I 酶, 该酶能有效识别并切开杂合双链中的不配对
位点) ; ( 8) 酶切产物电泳分析 ( 通过变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳分离 , 然后用双色红外荧光系统分析电 泳结果 , 获得突变池) ; ( 9) 利用相同方法从突变池 中筛选突变个体; ( 10) 突变个体 PCR 片段测序 ( 通 过全片段 测序 , 确 认核酸 多态 的类型、位置 和数 量) ; ( 11) 调出位点变异对应 的突变单株的种子, 种植 M 3 代, 从表 型上验证变异, 最终揭示该基因 的生物学功能。
及变性高效液相色谱 ( denaturing hig h - perf orm ance liquid chromat ogr aphy, 简称 dH PL C) 来检测野生 型和突变型混合模板的 PCR 扩增产物中异源双链 的错配处
[ 6]
。但该技术的运行时间限制了此方法的
[ 4]
高通量运用。 Co lbert 等
第 28 卷 第 3 期 2011 年 9 月 - 4627( 2011) 03 - 0343 - 06 文章编号: 1007
原子核物理评论
N uclear P hysics Review
V ol 28, N o. 3 Sep. , 2011
TILLING 技术的最新进展及其在辐射 * 诱变育种中的应用前景
* * 收稿日期 : 2011 -01 - 06; 修改日期 : 2011 中应用以来 , 已经成功地 应用于多种生物中。随着研究的深入 , T ILL ING 技 术平台也在多样化。本文总结了近年来 T ILL ING 技术平台 的发展以 及最新 动态 , 为 拟开展 T IL L ING 研究的人员提供综合选择信息。
[ 3]
1
引言
随着多种模式生物基因组 DNA 测序的完成,
基因组学进入了以研究基因功能为目标的后基因组 时代 , 而今功能基因组学已经成为植物科学研究的 主流。反向遗传学是功能基因组学的重要组成部分 之一 , 它利用已有的序列信息, 通过加工、修饰和 改造靶基因达到研究基因功能的目的。目前, 植物 中常用的 反 向遗 传 学方 法 包括 反 义 RNA 技 术、 RNAi 和 DNA 插入突变( 如转座子和 T- DNA) 。但 是, 反义 RNA 抑制技术需要花费相当大的精力来 预先确定目标基因是否将会表达; 而 RNAi 的作用 机理并不十分清楚, 如后代表型的多样性和不可预 知性 ; 插入突变主要是通过转座子和 T- DNA 插入 在基因组中使某些基因发生突变 , 但是一些关键基 因的突变对生物是致命的 , 而且插入突变技术很难 致使每个基因都发生插入突变。同时, 因为这些技 术均需耗时的转基因和组织培养 , 从而使这些技术 在反向遗传学的应用中受到极大限制[ 1- 2] 。 定向诱导基因组局部突变技术 ( T arg et ing In duced L ocal L esions IN Genomes, 简称 T IL L ING)
台 , 成功筛选到经 N - 乙基 -N - 亚硝基脲( N - Et hyl NNit rosourea, ENU) 诱变青 鳉后 P 53 基 因发生突变 的个体。 3. 2 HRM 技术平台的改进 iTILLING 技术
在对燕麦的
T IL L ING 筛选中引入 M AL DI - T OF - MS 技 术, 并 成功鉴定出苯丙氨酸解氨酶基因的 6 个点突变以及 - 葡聚糖合成酶基因的 10 个点突变。 常用的几种筛选突变的方法 都需要经过 PCR 这一过程。 H RM 技术在 PCR 扩增后即可直接用来 分析样品, 不需要样品的分离纯化 , 因而可以降低 分离纯化过程中所带来的样品污染的可能性 , 同时 也能大大减少工作 量。而在众 多的新型检测 手段 中, 以 H RM 技术发展潜力最大 , 在近两年的研究 报道中越来越受到研究者的推崇。 3. 1 HRM 原理及特点 H RM 技术是 2002 年由美国犹他大学 和爱德 华科技公司合作开发而成 , 是应用于突变扫描和基 因分型的最新遗传学分析方法。其基本原理是 : 利 用饱和荧光染料 L C Green 标记 DNA 双链, 由于 突变位点碱基的不匹配会导致双链 DNA 在升温过 程中会先解开, 荧光染料会从局部解链的 DN A 分 子上释放 , 因而从荧光强度与 DNA 溶解曲线就可 以判断突变位点是否存在。 H RM 技术不受突变碱基位点与类型的局限 , 无需序列特异性探针 , 在 PCR 结束后直接 运行高 分辨熔解 , 即可完成对样品基因型的分析。该技术 的优点主要有: ( 1) 快速、高通量 ; ( 2) 准确性好、 灵敏度高、特异性好; ( 3) 重复性接近 100% ; ( 4) 费用低; ( 5) 染料探针在 PCR 前加入, 不需要后续 的分离纯化, 而且染料的加入不影响后续的测序工 作, 实现了真正的闭管操作 ; ( 6) 只需将 P CR 产物 ( 96/ 384 孔板 ) 放入仪器内检测即可