盐酸四环素溶液的配制方法
《生物制药技术》实验指导-实验三、四
《生物制药技术》实验指导实验三四环素、金霉素的薄层层析鉴定（验证型）实验目的：掌握薄层层析的原理，四环素族抗生素的定性鉴定方法。
实验原理：层析（色谱，chromatograpby）是相当重要、且相当常见的一种技术，在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中（根据移动相种类的不同，分为液相层析和气相层析二种），使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。
用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体。
将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatography），在玻璃板上涂上一层薄而均的支持物（硅胶、纤维素和淀粉等）作为固定相的称为薄层层析（thin layer chromatography），或者用滤纸作为固定相的纸上层析。
层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型层析等类型。
但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。
此外，近来也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。
分配层析在支持物上形成部分互溶的两相系统。
一般是水相和有机溶剂相。
常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等亲水物质，这些物质能储留相当量的水。
被分离物质在两相中都能溶解，但分配系数不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。
一种溶质在两种互不混溶的溶剂系统中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在固定相和流动相溶剂中的浓度之比为一常数，称为分配系数。
当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。
分配系数大的移动快（阻力小）。
土霉素、金霉素和四环素的检测方法
土霉素、金霉素和四环素的检测方法1、分析目标化合物:土霉素,金霉素,四环素2、仪器设备:带荧光检测器的高效液相色谱仪,3、试剂:除下列试剂外,使用附录2所列试剂,咪唑:特级咪唑缓冲溶液:将68.08g咪唑、0.37g EDTA 和10.72g乙酸镁溶解在800mL水中,用乙酸调节pH7.2后,加水至1,000mL,含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液:第1液:将21.0g柠檬酸溶解在水中至1,000mL,第2液:将71.6g磷酸氢二钠溶解在水中至1,000mL,在1.86g乙二胺四乙酸中加入307mL第1液和193mL第2液混合的溶液溶解,苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱 (265mg):在内径8～9mm 聚乙烯管中填充265mg柱色谱用苯乙烯二乙烯苯共聚物或具有同等分离特性的物质,4、标准品:盐酸土霉素:本品1.000mg 含有土霉素0.850mg以上效价,分解点为190℃～194℃,盐酸金霉素:本品1.000mg含有盐酸金霉素0.900mg以上效价,分解点为210℃以上, 盐酸四环素:本品1.000mg 含有盐酸四环素0.900mg以上效力,分解点为214℃以上,5、试验溶液的制备:A．提取方法:①肌肉、肝脏和肾脏肌肉:尽可能除去脂肪层,搅碎混合均匀后,称取其5.00g,肝脏和肾脏:搅碎混合均匀后,称取其5.00g,加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,搅拌1分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,水层移入100mL分液漏斗中,离心分离管的残留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,用振荡器激烈振荡1分钟后,按上述同样条件离心分离,合并水层于上述分液漏斗中,加入20mL正己烷, 用振荡器激烈振荡5分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,分取水层,②脂肪脂肪:尽可能除去肌肉层,搅碎混合均匀后,称取其20.0g,加入200mL正己烷,搅拌1分钟后,加入40mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,再搅拌1分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,分取水层,正己烷层中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,用振荡器激烈振荡1分钟后,按上述同样条件离心分离,分取水层,合并于先分取的水层中,③奶称取5.00g样品,加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液和20mL正己烷,用振荡器激烈振荡5分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,分取水层,④蛋除去蛋壳,充分均匀后,称取其5.00g,加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,均匀后,加入100mL正己烷,搅拌1分钟后,以每分钟3000 转离心分离10分钟,水层移入100mL 分液漏斗中,离心管的残留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,用振荡器激烈振荡1分钟后,按上述同样条件离心分离,合并水层于分液漏斗中,加入20mL正己烷, 用振荡器振荡5分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,分取水层,⑤鱼贝类有壳贝类:除去壳,搅碎混合均匀后,称取其5.00g,其它的鱼贝类:搅碎混合均匀后,称取其5.00g,加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,搅拌1分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,水层移入100mL分液漏斗中,离心管的残留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,用振荡器激烈振荡1分钟后,按上述同样条件离心分离,合并水层于分液漏斗中,加入20mL正己烷, 用振荡器激烈振荡5分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,分取水层,B．净化方法:在苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱（265mg）中,顺次注入 10mL甲醇、10mL水和5mL饱和EDTA 溶液,弃去流出液,柱中注入a提取方法所得的溶液后,注入10mL水,弃去流出液,注入10mL 甲醇,收集流出液于磨口减压浓缩器中,40℃以下除去甲醇,残留物中加入1.0mL 1.36％磷酸二氢钾溶液溶解,此为试验溶液,6、操作方法:A．定性试验按下列操作条件进行试验,试验结果必须与标准品的一致,操作条件:柱填充剂:十八烷基甲硅烷基化硅胶(粒度5μm),柱:内径4.0～6.0mm,长150mm不锈钢管,柱温: 40℃检测器:激发波长380nm,发射波长520nm,流动相:土霉素和四环素试验时,用咪唑缓冲溶液:甲醇(17:3)的混合溶液,调整流速使土霉素约5分钟流出,金霉素试验时,用咪唑缓冲溶液:甲醇(3:1)的混合溶液,调整流速使金霉素约7分钟流出,B．定量试验根据与A定性试验相同操作条件所得的试验结果,峰高法或峰面积法定量,7、定量限:A．肌肉,肝脏,肾脏,奶,蛋和鱼贝类土霉素:0.02mg/kg金霉素:0.03mg/kg四环素:0.02mg/kgB．脂肪土霉素:0.005 mg/kg8、注意事项:(1)试验溶液的制备:①离心分离温度保持在室温,②抽滤后滤液混浊时,滤液再次进行离心分离,③在苯乙烯/二乙烯苯共聚物柱色谱中,注入试验溶液后,30mL水分数次加入效果较好地洗浄柱中残留的乙二胺四乙酸,(2)标准溶液的配制:①称取相当于10.0mg土霉素的标准品,溶解在甲醇中至10mL,作为土霉素的标准原液（土霉素1,000mg（效价）／L,1,000mg／L）,本标准原液保存在-20℃,1年内稳定,②称取相当于10.0mg金霉素的标准品,溶解在甲醇中至10mL,作为金霉素的标准原液（金霉素1,076mg（效价）／L,1,000mg／L）,本标准原液保存在-20℃,1年内稳定,③称取相当于10.0mg四环素的标准品,溶解在甲醇中至10mL,作为四环素的标准原液（四环素1,082mg（效力）／L,1,000mg／L）,本标准原液保存在-20℃,1年内稳定,④用1.36%磷酸二氢钾溶液将土霉素,金霉素和四环素各标准原液递减稀释,作为制作标准曲线用的标准溶液,(3)其它:①同时进行很多样品试验的筛选试验法提高判断効率时,用「土霉素,金霉素和四环素的筛选法（参照117 页）」判断为陽性的,不妨用本检测方法实施试验,②使用本检测方法检出土霉素,金霉素和四环素时,最好用带质量检测器的高效液相色谱仪确证.。
盐酸四环素溶液的配制方法
盐酸四环素干粉/盐酸四环素溶液--------------------------------------------------------------盐酸四环素溶液特点：华越洋盐酸四环素溶液是浓度为50mg/ml的四环素（硫酸盐）溶液，可以加到细菌液体或者固体培养基中培养含四环素抗性基因的细菌。
四环素盐酸盐的水溶性好，生物利用度比四环素碱好，故常用于临床及研究领域。
作用机制：主要是与细菌核糖体30S亚单位的A位特异性结合，阻止tRNA在该位置上的联结，阻止肽链延伸，从而抑制细菌蛋白质合成。
四环素类还可引起细胞膜通透性改变，使得重要成分外漏，从而抑制细菌生长繁殖。
抗性机制：抗性基因str特异性表达一种长度为399aa的膜结合蛋白，可将四环素分子从细胞内转移到细胞外，从而使细胞免去被四环素伤害。
运输及储存：低温运输，-20℃保存，有效期六个月。
盐酸四环素干粉简介：盐酸四环素分子式为：C22H24N2O8·HCl，分子量为480.91,。
黄色结晶，无气味。
味苦。
易吸湿。
遇光色渐变深。
易溶于水，溶于甲醇。
乙醇，不溶于乙醚，羟类。
它是从放线菌金色链丛菌（Streptomycesaureofaciens）的培养液中分离出来的抗菌物质，对革兰氏阳性菌、阴性菌、立克次体、滤过行病毒、螺旋体属乃至原虫类都有很好的抑制作用，对结核菌、变形菌等则无效。
分子结构：特点：通过特异性地抑制原核及真核核糖体上的氨酰转运，使未成熟链合成种植，从而阻碍蛋白质合成。
注意事项：镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含酶盐的培养基（如LB培养基）。
运输及储存：低温运输，4℃干燥避光保存，有效期一年。
加速法测定药物的有效期
实验四：加速实验法测定药物的有效期4 实验学时：实验类型：综合实验要求：分光度计法测定药物有效期一、实验目的应用化学动力学的原理和方法，采用加速实验法测量不同温度下药物的反1.应速率，根据阿伦尼乌斯公式，计算药物在常温下的有效期。
掌握分光光度计的测量原理及应用。
2.二、实验内容 1. 加速法测定不同温度下药物反应速率。
根据动力学方法计算药物在常温下的有效期。
2.三、实验原理、方法和手段6），特别是在加热情况下易产生脱水四环素。
四环素在酸性溶液中（PH＜四环素脱水四环素在脱水四环素分子中，由于共轭双键的数目增多，因此其色泽加深，对光的吸收程度也较大。
脱水四环素在445nm处有最大吸收。
四环素在酸性溶液中变成脱水四环素的反应，在一定时间范围内属于一级反应。
生成的脱水四环素在酸性溶液呈橙黄色，其吸光度A与脱水四环素的浓度呈函数关系。
利用颜色反应可以测定四环素在酸性溶液中变成脱水四环素的动力学性质。
按一级反应动力学方程式：.c (1) 0ln=kt cc1(2) 则0lnk=ct-1mol.L＝0时反应物的浓度，式中：c为t0-1mol.L时反应物的浓度，c为反应到时间t可(2)－x，带入式为经过t时间反应物消耗掉的浓度，因此，有c＝c设x0得：x-c (3) 0ktln-=c表示四环素完全脱水变成脱在酸性条件下，测定溶液吸光度的变化，用A￥时部分四环素变成脱水四环素的吸光度。
则t水四环素的旋光度，代表在时间A t）－x代替（，，即c代替公式中可用c A)(A-A00￥￥t AA-(4) ￥t kt=-ln A ￥根据以上原理，可用分光光度计测定反应生成物的浓度变化，并计算反应的值。
依据。
实验可在不同温度下进行，测得不同温度下的速率常数k速率常数k1处）25℃（即1/Tlnk对作图，得一直线，将直线外推阿伦尼乌斯公式，K15298.值。
据公式：即可得到该温度时的速率常数k1054.0(5) =t9.0 k25可计算出药物的有效期四、实验组织运行要求根据实验室可以提供的实验仪器条件，有两种方式组织实验。
盐酸四环素检验操作规程
目的：检验为检验盐酸四环素规定一个标准的程序，以便获得准确的实验数据。
范围：适用于盐酸四环素的检验。
职责：检验室主任、检验员。
规程：1.性状：本品为淡黄色结晶性粉末；无臭；味苦；有引湿性,遇光色渐变深，在碱性溶液中易破坏失效。
本品在水中溶解，在乙醇中略溶，在氯仿或乙醚中不溶。
1. 1 比旋度：取本品，精密称定，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释成每1ml中含10mg的溶液，按旋光度测定法(SOP-QC-310-00)测定，比旋度为－240°至－258符合规定。
公式：a×100[a] =W/50×100×（1－B）式中：a：旋光仪读数；W：样品称重量（g）；B：水分含量（%）；2. 鉴别2.1 试剂与仪器2.1.1 硫酸 2.1.2 三氯化铁试液2.1.3 硝酸 2.1.4 硝酸银试液2.1.5 氨试液 2.1.6 二氧化锰2.1.7 碘化钾淀粉试纸 2.1.8 试管2.1.9 刻度移液管 2.1.10 电子天平（万分之一克）2.2项目与步骤2.2.1 称取本品约0.5mg，加硫酸2ml，即显深紫色；再加三氯化铁试液1滴,溶液变为红棕色为符合规定。
2.2.2 在含量测定项下记录的色谱中，供试品主峰的保留时间应与盐酸四环素对照品主峰的保留时间一致为符合规定。
2.2.3 氯化物的鉴别：（1）取供试品溶液，加硝酸使成酸性后，加硝酸银试液，即生成白色凝乳状沉淀，分离，沉淀加氨试液即溶解，再加硝酸，沉淀复生成为符合规定。
（2）取供试品少量，置试管中，加等量的二氧化锰，混匀，加硫酸湿润，缓缓加热，即发生氯气，能使湿润的碘化钾淀粉试纸显蓝色为符合规定。
3. 检查3.1 试剂与仪器3.1.1 1号浊度标准液 3.1.2 0.01 mol/L盐酸溶液3.1.3 氯化钠注射液 3.1.4 0.8% 氢氧化钠溶液3.1.5 0.9%无菌氯化钠溶液 3.1.6 烧杯3.1.7 精密酸度计 3.1.8 容量瓶3.1.9 微量进样器 3.1.10 高效液相色谱仪3.1.11 称量瓶 3.1.12 恒温干燥箱3.1.13 紫外分光光度计 3.1.14 电子天平(万分之一克)3.2 项目与步骤3.2.1 酸度: 称取本品0.5g,置烧杯中,加水稀释,溶解至50ml,按PH值测定法(SOP-QC-312-00)测定，PH值应为1.8-2.8为符合规定。
盐酸四环素溶液的配制方法
盐酸四环素干粉/盐酸四环素溶液-—-———－————--—－－———-———-—--—————--—--—————-—---————--———-—-——－盐酸四环素溶液特点:华越洋盐酸四环素溶液是浓度为50ｍg/ｍｌ的四环素(硫酸盐）溶液，可以加到细菌液体或者固体培养基中培养含四环素抗性基因的细菌。
四环素盐酸盐的水溶性好,生物利用度比四环素碱好,故常用于临床及研究领域．作用机制：主要是与细菌核糖体３0S亚单位的A位特异性结合,阻止tRＮA在该位置上的联结,阻止肽链延伸,从而抑制细菌蛋白质合成。
四环素类还可引起细胞膜通透性改变,使得重要成分外漏,从而抑制细菌生长繁殖。
抗性机制:抗性基因ｓｔr特异性表达一种长度为39９aa的膜结合蛋白，可将四环素分子从细胞内转移到细胞外,从而使细胞免去被四环素伤害。
运输及储存:低温运输,-２0℃保存,有效期六个月。
盐酸四环素干粉简介：盐酸四环素分子式为：C２２H２４Ｎ2O８·HCl,分子量为４80．91,。
黄色结晶，无气味。
味苦。
易吸湿。
遇光色渐变深.易溶于水,溶于甲醇。
乙醇,不溶于乙醚，羟类.它是从放线菌金色链丛菌(Sｔreptomyceｓaureｏfaciens)的培养液中分离出来的抗菌物质,对革兰氏阳性菌、阴性菌、立克次体、滤过行病毒、螺旋体属乃至原虫类都有很好的抑制作用,对结核菌、变形菌等则无效.分子结构：特点：通过特异性地抑制原核及真核核糖体上的氨酰转运，使未成熟链合成种植，从而阻碍蛋白质合成.注意事项:镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含酶盐的培养基(如ＬＢ培养基）.运输及储存:低温运输，4℃干燥避光保存,有效期一年。
分子生物学常用试剂配制抗生素溶液配制
分子生物学常用试剂配制抗生素溶液配制分子生物学常用试剂配制方法庆大霉素盐酸壮观霉素1．称取1g粉末置于10ml塑料离心管中。
2．加入9ml灭菌水，充分混合溶解之后定容至10ml。
3．0.22μm滤膜过滤除菌，小份分装（1ml一管）后，置于－20℃保存。
100ml培养基加100ul。
（在培养基中浓度为100ug/ml）Ampicillin(氨苄青霉素)﹡组分浓度 100mg/ml 氨苄青霉素﹡配制量 50ml﹡配制方法1．称取5g Ampicillin置于50ml塑料离心管中。
2．加入40ml灭菌水，充分混合溶解之后定容至50ml。
3．0.22μm滤膜过滤除菌，小份分装（1ml一管）后，置于－20℃保存。
100ml培养基加100ul。
（Amp在培养基中浓度为100ug/ml）Kanamycin（卡那霉素）﹡组分浓度 50mg/ml卡那霉素﹡配制量 50ml﹡配制方法 1．称取2.5g 卡那霉素置于50ml塑料离心管中。
2．加入40ml灭菌水，充分混合溶解之后定容至50ml。
3．0.22μm滤膜过滤除菌，小份分装（1ml一管）后，置于－20℃保存。
100ml培养基加100ul。
IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(24 mg/ml)﹡组分浓度 24mg/ml IPTG﹡配制量 50ml﹡配制方法 1．称取1.2g IPTG置于50ml塑料离心管中。
2．加入40ml灭菌水，充分混合溶解之后定容至50ml。
3．用0.22μm滤膜过滤除菌，小份分装（1ml一管）后，置于－20℃保存。
X-Gal (20 mg/ml)﹡组分浓度 20mg/ml X-Gal﹡配制量 50ml﹡配制方法 1．称取1g X-Gal置于50ml塑料离心管中。
2．加入40ml DMF(二甲基甲酰胺)，充分混合溶解之后定容至50ml。
3．小份分装（1ml一管）后，置于-20℃避光保存。
RNase A ﹡组分浓度 10mg/ml RNase A﹡配制量 50ml﹡配制方法 1．取0.5g RNase A置于50ml塑料离心管中。
药剂学实验指导——药物制剂的配伍变化
实验二十六药物制剂的配伍变化实训目的通过液体药剂和注射剂配伍变化的观察，进一步了解配伍变化的发生原因，并初步掌握配伍变化处方的处理方法实训器材药品氨茶碱、磺胺嘧啶钠、盐酸四环素注射液、氯霉素、维生素C、碘解磷定注射液、羟苯乙酯、胭脂红、活性炭、滑石粉、盐酸肾上腺素、双氧水、亚硫酸钠、EDTA 器材试管，烧杯，滤纸实训指导（一）物理性配伍变化1．方法步骤（1）取5％羟苯乙酯的乙醇溶液1ml，加纯化水4m1，观察现象。
取5％羟苯乙酯1ml搅拌下逐滴加入100m1纯化水中，观察现象。
（2）取胭脂红溶液1滴，加纯化水至50ml，观察此溶液显色情况。
另取上述溶液20ml加活性炭0.5g，搅匀后用干燥滤纸过滤，观察滤液显色情况。
另取20ml上液加滑石粉0.5g搅匀，干燥滤纸过滤，观察滤液显色情况。
2．注意事项（1）羟苯乙酯中加入纯化水时要边搅拌加滴。
（2）加活性炭加入的量不能太多，否则影响显色。
（二）化学性配伍变化1．方法步骤（1）取5支试管编号。
（2）分别按表26-1进行操作与记录。
表26-1化学性配伍变化操作及结果记录1号管2号管3号管4号管5号管加0.1％盐酸肾上腺素2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 加蒸馏水2ml 2ml －－－加3％双氧水－－2ml －2ml 加1％亚硫酸钠－－－2ml 2ml 加热至沸－＋－＋－出现的现象2．注意事项试管编号不能错，操作时尽量注意平行操作。
（三）注射剂配伍变化1．方法步骤取6支试管，按表26-2进行配伍操作，将两种注射液配伍的结果记入表中。
2．注意事项同化学性配伍变化。
表26-2 注射剂配伍变化组号A注射液B注射液A注射液和B注射液混合后现象2.5％氨茶碱5ml 20％磺胺嘧啶钠5ml12.5％氨茶碱5ml 5％盐酸四环素5ml12.5％氯霉素1ml 5％葡萄糖1ml212.5％氯霉素1ml 5％葡萄糖10ml2％维生素C 2ml 0.25％碘解磷定1ml30.25％碘解磷定、1％亚硫酸氢钠、2％维生素C 2ml1％EDTA各1ml实训报告实验二十六药物制剂的配伍变化实训目的实训结果（一）物理性配伍变化1．按操作顺序，先后出现现象一；现象二。
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盐酸四环素干粉/盐酸四环素溶液
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盐酸四环素溶液
特点：
华越洋盐酸四环素溶液是浓度为50mg/ml的四环素（硫酸盐）溶液，可以加到细菌液体或者固体培养基中培养含四环素抗性基因的细菌。
四环素盐酸盐的水溶性好，生物利用度比四环素碱好，故常用于临床及研究领域。
作用机制：
主要是与细菌核糖体30S亚单位的A位特异性结合，阻止tRNA在该位置上的联结，阻止肽链延伸，从而抑制细菌蛋白质合成。
四环素类还可引起细胞膜通透性改变，使得重要成分外漏，从而抑制细菌生长繁殖。
抗性机制：
抗性基因str特异性表达一种长度为399aa的膜结合蛋白，可将四环素分子从细胞内转移到细胞外，从而使细胞免去被四环素伤害。
运输及储存：
低温运输，-20℃保存，有效期六个月。
盐酸四环素干粉
简介：
盐酸四环素分子式为：C22H24N2O8·HCl，分子量为480.91,。
黄色结晶，无气味。
味苦。
易吸湿。
遇光色渐变深。
易溶于水，溶于甲醇。
乙醇，不溶于乙醚，羟类。
它是从放线菌金色链丛菌（Streptomycesaureofaciens）的培养液中分离出来的抗菌物质，对革兰氏阳性菌、阴性菌、立克次体、滤过行病毒、螺旋体属乃至原虫类都有很好的抑制作用，对结核菌、变形菌等则无效。
分子结构：
特点：
通过特异性地抑制原核及真核核糖体上的氨酰转运，使未成熟链合成种植，从而阻碍蛋白质合成。
注意事项：
镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含酶盐的培养基（如LB培养基）。
运输及储存：
低温运输，4℃干燥避光保存，有效期一年。