细胞生物学研究方法专题讲座讲解材

• 因为物镜的焦平面很薄（只有0.5皮米）所以能够获得试样的真正光学断面。 所有在焦平面以上或以下的图像数据都到不了探测器。随着焦平面的上升或者 下降（Z轴），可以得到试样的分层图像并存储起来，这些分层图像就由计算 机重构成三维图像。
• 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 • 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像, 研究亚细胞结构与组分。
• 有两个特殊的滤光片；可观察 活细胞.
什么是荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量由低能状态 转变为高能状态，再回到低能状态时释 放出的光。
。 即：物质吸收短波光，发射出的紫外长线波发生光装置(如弧光灯、水银灯等 )
a18aຫໍສະໝຸດ 19荧光显微镜的光通路
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• 荧光显微镜的特殊用途: • 用于观察能激发出荧光的结构 • 免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断 • 细胞与组织中物质的吸收与运输 • 化学物质的分布与定位等 • 荧光现象有两种: • 自发荧光（叶绿素） • 诱发荧光（加荧光素）
第三章 细胞生物学研究方法
STUDY METHODS OF CELL BIOLOGY
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本章内容提要
细胞生物学研究方法多种多样,总的 说来,可分为四个大类:
显微技术 细胞组分分析与原位检测技术 细胞培养与细胞工程 分子生物学技术
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第一节 细胞形态结构的观察方法
• 显微镜是观察细胞的主要工具。 • 根据光源不同可分为:
• 共聚焦?
物镜与聚光镜同时a 聚焦到同一个小点。
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laser confocal scanning microscope, LCSM
LCSM Image of a Xenopus Melanophore
microtubule cytoskeleton (green) and
the nucleus (blue)
– sin α /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一 般为0.05~0.95；其中低倍镜0.28，高倍镜0.65，油镜 1.25，油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。
– 普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于 0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm, 因此光学显微镜的 最大设计倍数为1000X。
光学显微镜和电子显微镜两大类。
•前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为 光源，后者则以电子束为光源
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显微镜的发明打开了微观世界的大门
光学显微镜
透射电子显微镜
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扫描电子显微镜
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—、光学显微技术
• 普通复式光学显微镜 • 荧光显微镜 • 激光共聚焦扫描显微镜 • 暗视野显微镜 • 相差和微分干涉显微镜 • 倒置显微镜
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原理
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用途：观察未经染色的标本和活细胞。
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（六）微分干涉显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC）
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.普通光镜样品的制作:
固定剂(甲醛)固定：杀死细胞，稳定细胞的 化学成份； 包埋剂(石蜡)包埋; 切片(5μm )； 染色:如苏木精对负电荷分子有亲和性，能 显示出细胞内核酸的分布；酸性染料如伊红 可使细胞质染色；苏丹染料的乙醇饱和溶液 能使脂肪着色。
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• 特点：光源为紫外线，波长较 短，分辨力高于普通显微镜 (0.1μm )；
•如何提高显微镜的分辨能力？
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• 增加分辨率的二个必备条件: • 增大镜口率---有一定限度 • 缩短波长---为可靠办法
• 普通光镜的最大分辨率为0.2μm, 大于0.2μm的结 构为显微结构, 而小于0.2μm的称为亚显微结构.
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几种介质的折射率
介质 折射率
空气 水 1 1.33
香柏油 α 溴萘 1.515 1.66
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（一）普通光学显微镜 Light microscopy
1.显微镜的发明
➢ 300多年前 Leeuwenhoek 世界上最早的显微镜
Robert Hooke
软木 蜂窝状的小格 子“细胞”
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• 2.光学显微镜构成： ①照明系统: 光源、折光镜、聚光镜
②光学放大系统:
目镜与物镜(玻璃透镜) ③机械装置:镜座.镜柱等
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（四）暗视野显微镜 dark field microscope
• 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进 人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线 进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体 的边缘是亮的。
• 可观察 4~200nm的微粒子，分辨率比普 通显微镜高50倍。
用以观察未经染色的活体或胶体粒子
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光学显微镜
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经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。
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显微镜的物像是否清楚主要决定了哪些因素？
•
4.
分辨力：
•指分辨物体最小间隔的能力. 最重要参数.
是显微镜的
•
D=0.61λ/N．A．
– 其中λ为入射光线波长；N．A＝ｎsin(α/2
)，为镜口率 , n=介质折射率；α=镜口角（样品 对物镜镜口的张角） 。
为什么使用油镜能提高分辨率?
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不同光线的波长
电子束
名
称 可见光 紫外光 X 射线 α 射线
0.1Kv 10Kv
波长（nm） 390~760 13~390 0.05~13 0.005~1 0.123 0.0122
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• 光学显微镜的几个光学特点：
– 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介 质的折射率越接近玻璃的越好。
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暗视野显微镜光路
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由P．Zernike 于1932年发明，并因此获1953 年 诺贝尔物理奖。
• 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，明者更明，暗 者更暗，立体感增强。从而提高了各种结构间的对比度， 使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同 于普通光学显微镜的特殊之处:
1. 物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的 相位推迟1/4λ.光源聚光器中增加一环形光阑。
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Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green
微管呈a 绿色、微丝红色、核蓝色 22
• 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。一束光线通过聚焦成点，在样品表面 扫描后成象。它是一个扫描光学显微镜，因为在一个时间试样上只有一个点被 照亮。随着试样被扫描，像素的积累便构成了图像。