螺旋藻藻蓝蛋白的分离
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度谭一心一、实验目的学习并掌握提取、纯化藻蓝蛋白及紫外可见光谱仪检测纯度的方法。
二、实验原理1冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。
如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀破碎。
2盐析法：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。
盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集，并从溶液中析出。
3DEAE—纤维素：二乙基胺乙基纤维素，总交换量0.9meq/g功能基：二乙基胺乙基，弱碱性阴离子交换剂。
原理：含有某些功能基团，可以进行离子交换，性能比一般离子交换树脂温和，适用于分离具有生物活性的大分子，可以将性质相近的大分子物质分开。
1.装柱：装柱前先将层析柱垂直固定在支架上。
装柱的方法分干装和湿装两种。
干装是直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将气泡排尽。
湿装法是先加适量溶剂到柱中，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液缓缓下降到需要的高度，吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，以防气泡产生。
2.加样：经过平衡的层析柱当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。
加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2（体积越小越有利于提高分辨率）。
3.洗脱：待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂（5cm），并在柱上端与装有洗脱剂的储液瓶连接开始洗脱。
同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集（按体积或时间分管收集）。
4.测定：随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度-2
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度-23.结果分析:实验测得的藻蓝蛋白纯度只有0.509，比较我们班其他组的结果相差不算太大，但其他班有的组测得藻蓝蛋白得纯度可达到 1.7左右，相对于这个纯度，我们所提取得藻蓝蛋白纯度时偏低的，影响藻蓝蛋白纯度的原因主要有以下几个：1)冻融次数:本实验时采用冻融法破碎细胞，冻融法破碎细胞主要是因为藻体在冻结过程中，细胞内外的液态水形成冰晶体，造成体积膨大，对藻体细胞壁和细胞膜产生破坏作用，使其通透性加大，内容物流出。
藻体冻结过程中首先是从最容易生成细小冰晶体的地方开始，然后冰晶体逐渐变大，向四周扩展，将距这些地方比较近的细胞壁和细胞膜胀破，压破。
每次冻融最容易生成细小冰晶体的地方是不一样的，即在细胞内外形成冰晶的部位是不同的，这样就能对细胞不同部位的细胞壁和细胞膜产生破坏，因而多次冻融能使破碎效果提高。
冻融时间增加随能使冰晶体变大，但由于受细胞内外水分含量的限制，冰晶的长大使有限度的，因而对细胞壁和细胞膜破坏只是在原有基础上的破坏，破坏区域较少，效果较差，所以冻融时间对冻融效果影响不大。
可见，在冻融法中次数对藻蓝蛋白得率得影响比时间对它得影响大，多次反复冻融的细胞破碎效果比较好。
我们自己只冻融了一次，其余是老师整体冻融的，所以我们冻融方面应与其他组没有多大区别。
2)不同饱和度硫酸铵的盐析效果：实验过程中，饱和度在20％时，没有明显的沉淀，查资料得知，当饱和度在25％以下时，没有明显的沉淀，在25％以上后，随着硫酸铵饱和度的增加，提取率逐步升高。
从纯度看，随着饱和度的升高，纯度先降后升。
实验测得的结果偏低，可能是加入硫酸铵过程中，随着饱和度的增大，杂蛋白，藻红蛋白和别藻蓝蛋白沉淀出的量都在增大，藻蓝蛋白所占的比例减小，所以纯度减小。
由于我们过柱时取的样不是我们组的，所以无法考证是这两种原因引起我们结果偏低，只能说这两种原因对我们所得的藻蓝蛋白纯度会有影响。
螺旋藻中藻蓝蛋白提取的工艺流程
螺旋藻中藻蓝蛋白提取的工艺流程王艺生物技术二班20100404071、预处理将螺旋藻洗净晾干2、细胞破碎利用超声波破碎发破碎细胞，藻胆蛋白属于胞内蛋白质，要提取分离藻胆蛋。
首先必须要破坏藻类细胞的细胞壁、细胞膜，使藻胆蛋白以溶解的状态释放出来，并保持其活性。
超声波细胞粉碎仪破碎鱼腥藻细胞的最佳处理条件是超声仪的功率为600 W，超声时间为9min，固液比为1：8，破壁容量为20 mL。
也可与其他方法合用最大限度的破碎细胞。
3、提取（初步分离）（1）用超滤膜过滤藻胆蛋白提取液，获得藻胆蛋白粗制品。
用NaNO3，高渗一超滤法分离提纯藻胆蛋白，超滤时选用聚砜膜，在超滤过程中，无机盐和小分子蛋白质，包括小分子的藻毒素透过滤膜而去掉，特别适用于易产生水华的微囊藻脱毒，提高产品的安全性。
NaNO3高渗．超滤法是提取藻胆蛋白的简单易行的方法，用此法提取的藻胆蛋白是安全无毒的，且易于纯化，脱水方便，产品易于干燥。
（2）也可利用沉淀法将大量盐加到蛋白质溶液中，蛋白质胶粒凝结并沉淀析出，因此向细胞破碎液中加入盐溶液使蛋白质沉淀析出。
用25％硫酸铵可将藻红蛋白沉淀出，用30％硫酸铵可将藻蓝蛋白沉淀出，再用50％硫酸铵可将蓝藻蛋白沉淀出。
4、精制（高度纯化）离子交换层析法，用 DEAE一步纯化藻蓝蛋白；改变传统以离子强度作梯度洗脱的方法，根据藻红蛋白的等电点进行pH梯度洗脱，仅用DEAE一步层析，就将藻红蛋白纯度从1.042提高至5.6，回收率达67.33％。
用硅藻土545柱分级洗脱，再用该法纯化，从螺旋藻中获得初度为4.1的藻蓝蛋白和纯度为4.6的别藻蓝蛋白；将提取液上DE。
AE一52纤维素柱，提取纯度只有1.9，在上葡聚糖凝胶柱，则得到了纯度较高的蓝藻蛋白。
5、成品制作随着藻蓝蛋白制品的应用范围的不断扩大，对提取分离工艺的要求也逐渐提高。
不仅要有高的提取率、好的产品质量，而且要考虑省时、省力、自动化程度高。
利用缓慢冷却加晶种的方法使藻蓝蛋白结晶，干燥后进行保存。
藻蓝蛋白的提取
藻蓝蛋白的提取方法1.PBS 缓冲液直接提取法(1)配制pH=6.0 的PBS 缓冲溶液。
(2)称取20 g 螺旋藻粉, 加入步骤( 1) 配制的缓冲溶液200 mL, 然后将其放在磁力搅拌器上搅拌 4 h, 将搅拌后的溶液置于离心机中10 000 g 离心10 min, 收集蓝色上清液。
(3) 将离心得到的上清液加洗涤剂洗涤, 再将洗涤后溶液进行过滤。
(4)将滤液用旋转真空蒸发仪蒸干, 可得蓝色固体,将固体置于干燥器中 1 h, 待完全干燥后取出, 将其研磨成蓝色粉末样品。
2藻蓝蛋白的富集分离2 .1螺旋藻细胞的破碎准确称取0 .5 g 螺旋藻粉, 加入100 mL 的pH =7 .0 、0 .01 mol/L 的H3PO4 缓冲液, 采用反复冻融(3 次)的方法对藻体细胞进行破碎, 在显微镜下观察计数细胞破碎率在90%以上即可.将破碎的螺旋藻细胞悬浊液于4 000 r/min 离心20min , 倾倒上清液可得到含藻蛋白的粗提液.在568 、620 和650 nm处测粗提液的吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量.2.2 盐析法沉淀藻蓝蛋白在装有固定体积藻蛋白粗提液的烧杯中加入一定量的(N H4)2SO4 溶液, 边加边搅拌, 以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性, 最终(NH4)2 SO4 溶液的质量浓度分别为20 %、40 %、50 %和60 %, 然后分别在20 ℃和40 ℃下对(NH4)2 SO4 盐析法沉淀藻蓝蛋白进行实验研究.在设置的温度和盐浓度下静置过夜, 再于-4 ℃离心机中以10 000 r/min 离心20 min , 将离心得到的沉淀用1/4 上清液体积的H3PO4 缓冲液(pH =7 .0)溶解, 并倾倒于透析袋中, 再置于去离子水中透析24h(每隔4 h 更换一次去离子水);透析结束后, 再于-4 ℃离心机中以10 000 r/min离心25 min ;用移液管抽取上清液,在568 、620 和650 nm 下测吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量.2 .3 等电点法沉淀藻蓝蛋白在装有固定体积藻蛋白粗提液的烧杯中加入0 .1 mo l/L 稀H2 SO4 溶液, 边加边搅拌,以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性, 将藻蛋白粗提液pH调节为3 .0 、4 .0 和5 .0 , 即藻蓝蛋白的等电点附近,静置过夜, 于-4 ℃离心机中以10 000 r/min 离心20 min ;将离心得到的沉淀用1/4 上清液体积的H3PO4 缓冲液(pH =7 .0)充分溶解, 再于-4 ℃高速离心机中以10 000 r/min 离心25 min ;用移液管抽取上清液,在568 、620 和650 nm 下测吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量.2 .4 藻蓝蛋白的收率和分离因数分别计算藻蓝蛋白的收率(Y )、浓缩率(m)和分离因数(β):式(3)-(5)中, N(g/L)为藻液比, 0 和t 分别代表冷冻-融化后藻蛋白粗提液和经过盐析法沉淀或等电点法沉淀最终得到的藻蓝蛋白上清液.双水相萃取（1）藻蓝蛋白的初步提取。
藻蛋白提取实验报告
一、实验目的本实验旨在通过学习并掌握藻蛋白的提取方法，了解不同提取方法对藻蛋白提取效果的影响，并对提取得到的藻蛋白进行初步的纯化及鉴定。
二、实验原理藻蛋白主要存在于藻类植物中，如螺旋藻、小球藻等。
藻蛋白的提取方法主要有物理法、化学法和生物法。
本实验采用物理法中的冻融法提取藻蛋白，该方法操作简单，对藻类植物损伤小，提取效率较高。
三、实验材料与仪器材料：1. 螺旋藻粉2. 蒸馏水3. 0.1mol/L的KOH溶液4. 0.1mol/L的HCl溶液5. 95%乙醇6. 无水乙醇7. 丙酮8. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）仪器：1. 电子天平2. 磁力搅拌器3. 超声波清洗器4. 高速离心机5. 蒸发皿6. 烧杯7. 离心管8. 吸管9. 滤纸四、实验步骤1. 藻蛋白粗提1. 称取10g螺旋藻粉，置于100ml离心管中。
2. 加入50ml蒸馏水，充分搅拌，使螺旋藻粉充分溶解。
3. 将混合液置于冰浴中冷却，每隔30分钟搅拌一次，共冷却2小时。
4. 冷却完成后，以4000r/min的转速离心10分钟，收集上清液。
5. 将上清液转移至烧杯中，加入95%乙醇，使蛋白质沉淀，静置30分钟。
6. 以4000r/min的转速离心10分钟，收集沉淀。
7. 将沉淀用蒸馏水洗涤三次，以去除杂质。
2. 藻蛋白纯化1. 将洗涤后的沉淀溶于适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中。
2. 将混合液通过DEAE纤维素层析柱，用磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱。
3. 收集含有藻蛋白的洗脱液，经浓缩、冷冻干燥后得到藻蛋白。
五、实验结果与分析1. 藻蛋白粗提通过冻融法提取的藻蛋白，在95%乙醇中沉淀，经离心后得到淡蓝色沉淀，表明藻蛋白提取成功。
2. 藻蛋白纯化通过DEAE纤维素层析柱纯化后，得到的藻蛋白在紫外-可见光谱上呈现出典型的藻蓝蛋白特征峰，表明纯化成功。
六、实验结论本实验采用冻融法和DEAE纤维素层析柱法成功提取并纯化了藻蛋白。
实验结果表明，冻融法是一种简单、高效的藻蛋白提取方法，而DEAE纤维素层析柱法可以进一步纯化藻蛋白，提高其纯度。
钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特性研究
ISSN 100020054CN 1122223 N 清华大学学报(自然科学版)J T singhua U niv (Sci &Tech ),1999年第39卷第6期1999,V o l .39,N o .66 3520～22钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特性研究3殷 钢, 刘 铮, 刘 飞, 李 琛, 丁富新, 袁乃驹清华大学化学工程系,北京100084 收稿日期:1998208206 第一作者:男,1973年生,博士研究生 3基金项目:国家“九五”科技攻关项目,962C 03204205文 摘 为发展新型海洋药物,采用Sephacryl S 2200凝胶层析和羟基磷灰石柱层析对人工养殖钝顶螺旋藻中的藻蓝蛋白进行了分离和纯化,得到了藻蓝蛋白纯品。
测定了藻蓝蛋白的氨基酸组成和含量。
藻蓝蛋白的紫外、可见吸收光谱表明其最大特征吸收波长为278,360,620nm 。
得到的藻蓝蛋白经等电聚焦显示为一条带,其等电点为pH =4.3。
还测量了藻蓝蛋白红外吸收光谱。
研究所获得的藻蓝蛋白为后续开展临床应用提供了可靠的样品。
关键词 钝顶螺旋藻;藻蓝蛋白;分离;纯化分类号 Q 51 螺旋藻是一种丝状多细胞螺旋形藻类生物,藻体由于含有藻蓝素而使外观呈蓝绿色。
现已发现的螺旋藻共有36个个种,多数为淡水种。
它含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、矿物质、叶绿素、Β2胡萝卜素及多糖类物质,是人类理想的食物及药物资源[1]。
目前用于工厂化生产的主要是钝顶螺旋藻和极大螺旋藻。
螺旋藻作为新型药物资源成为当前海洋药物研究的焦点之一。
螺旋藻中含有丰富的藻胆蛋白,藻胆蛋白中又包含藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白以及藻红蛋白等蛋白。
藻蓝蛋白是螺旋藻中重要的捕光色素蛋白,它以近乎100%的高效率把光能优先地传递给光系统 [2]。
研究表明,藻蓝蛋白具有提高人体免疫力,促进动物血细胞再生,抑制某些癌细胞等作用[3]。
临床实验证明藻蓝蛋白—铜激光对大肠癌细胞株有很强的杀伤效应[4],同时藻蓝蛋白还是一种无毒、无副作用的理想光敏剂[5]。
宾美生物——螺旋藻C_藻蓝蛋白亚基分离及抗肿瘤活性研究_张昕
第37卷第3期2010年5月浙江大学学报(理学版)Journal of Zhejiang University(Science Edition)http://ww /sciVol.37No.3M ay2010收稿日期:2009-04-02.基金项目:浙江省重大科技专项重点项目(2006C12084).作者简介:张昕(1985-),女,硕士,主要从事生物化学与分子生物学研究. *通信作者,E-mail:gongxg@.DOI:10.3785/j.issn.1008-9497.2010.03.016螺旋藻C-藻蓝蛋白亚基分离及抗肿瘤活性研究张昕,郦剑勇,龚兴国*(浙江大学生命科学学院,生物化学研究所,浙江杭州310058)摘要:为解决C-藻蓝蛋白分子较大,难以直接与细胞发生作用的问题,对藻蓝蛋白亚基的分离纯化方法进行研究,并初步探讨了其对肿瘤细胞的抑制作用.对通过热变性、盐析和自制的羟基磷灰石吸附层析,从钝顶螺旋藻中获得高纯度的藻蓝蛋白(C-PC,A620/A280>4.5).C-PC用8mol#L-1的尿素溶液变性,过CM-Sephar ose F.F.阳离子交换层析、透析、复性,获得具活性的C-P C亚基.用CCK-8试剂盒分别研究了C-P C、A和B亚基对一个肺腺癌细胞株SPC-A-1的生长的影响,结果表明藻蓝蛋白及其亚基对该细胞株的生长具有抑制作用,B亚基效果最好,预示着它们具有一定的抗肿瘤潜力.关键词:柱层析;复性;亚基;肺腺癌细胞株SPC-A-1;生长抑制作用中图分类号:Q51文献标志码:A文章编号:1008-9497(2010)03-319-05ZHA N G X in,LI Jian-yong,GO NG X ing-g uo*(I ns titute of Biochemistr y,College of lif e Sciences,Zhej iang Uni-vers ity,H angz hou310058,China)Isolation of C-PC subunits from spirulina platensis and inhibitory effect on SPC-A-1cell line.Journal o f Zhejiang U niversit y(Science Edit ion),2010,37(3):319-323Abstract:In order to solve the difficult y of interactio n betw een C-phycocyanin(C-PC)and cells,the metho ds o f isolating and purif ying C-PC subunits w ere investig ated and the ant-i t umo r effects of them o n the SPC-A1cells wer e studied also.A hig h efficiency and relat ively convenient pur ificatio n sy stem w ith tw o-step self-composed H A chr omatog ram w as dev ised in the research,and obtained pure C-PC with OD620/OD280of4.5.A fter denatur ing the purified C-P C by so dium acetate buffer containing8mol#L-1urea,the subunits w ere isolated by cat ion ex chang e chr omatog ra phy by using CM-sephar ose F.F,t hen the subunits wer e r enatured separately.Both o f the t wo subunits had stro ng fluo rescence activ ity.T he ant-i tumor effect of highly purified C-PC、A and B subunit was t ested o n gr ow th and multiplication of human lung adenocar cino ma cell line(SPC-A-1).T he results indicated t hat the B subunit o f C-P C w as the po tentest ant-i cancer frag ment under the same concentr atio n conditio n in v itr o.Key Words:chr omato gr aphy;renature;act ivity;inhibitor y effect;subunits藻蓝蛋白是蓝藻、红藻等藻类的主要集光分子,传光效率极高[1].大量研究表明,藻蓝蛋白具有抗氧化[2]、清除自由基[3]、抗炎症、抗肿瘤[4]等作用,能有效预防和治疗多种疾病.藻蓝蛋白已广泛应用于食品、化妆品、医药等领域.根据其来源不同,可将藻蓝蛋白分为C-藻蓝蛋白(C-PC)和R-藻蓝蛋白(R-PC).近年来,国外有大量文献报道了藻蓝蛋白的抗肿瘤活性,以及藻蓝蛋白诱发细胞调亡的原理[5],引起了国内外广泛的兴趣.但是,对藻蓝蛋白亚基的分离少见报道.本文运用热变性的方法,从钝顶螺旋藻中分离出C-藻蓝蛋白,研究获得组成其的两个亚基A和B,并考察藻蓝蛋白亚基对肺腺癌细胞的生长抑制作用,以期为藻蓝蛋白亚基的研究开发提供依据.1材料材料:钝顶螺旋藻(S p irulina p latensis)购自江苏溧阳;人源肺腺癌SPC-A1细胞株,购自中科院细胞所.试剂:CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8),日本同仁化学研究所;RPM I-1640液体培养基,吉诺生物有限公司;胰酶-EDTA,吉诺生物有限公司;超级新生牛血清,杭州四季青生物公司.仪器:Bio40紫外/可见分光光度计,美国Per-kin Elmer公司,850型荧光分光光度仪,日本H ita-chi公司,微型蛋白质电泳系统,美国Bio-Rad公司.2实验方法2.1藻蓝蛋白的分离纯化取螺旋藻藻泥100g左右,加入pH6.8的磷酸缓冲液,4e保存过夜.待其完全融解后,超声破碎.温水浴热变性后,30%~65%硫酸铵盐析,离心去上清.沉淀用PBS溶解,透析脱盐后,羟基磷灰石柱层析,使用文献报道的自制羟基磷灰石[6-7].得到1g 左右的藻蓝蛋白(A620/A280> 4.0),再次羟基磷灰石层析,藻蓝蛋白纯度进一步提高,得到A620/A280> 4.5的高纯度藻蓝蛋白,G25脱盐,冻干粉保存.2.2藻蓝蛋白亚基的分离取新鲜制备的藻蓝蛋白(A620/A280>4.5)溶液用硫酸铵盐析,4e静置过夜,冷冻离心,弃上清.沉淀溶于醋酸缓冲液中,避光低温保存1d.第2天可见藻蓝蛋白颜色由亮蓝色变为绿色.溶液用含8mol#L-1脲的醋酸缓冲液透析,直至无硫酸铵.CM-Sepharose F.F.离子交换层析,层析柱用含8M脲的醋酸缓冲液预平衡,离子强度梯度洗脱,洗脱液为0~0.2mo l#L-1N aCl的醋酸缓冲液[8-10].分别收集两个蛋白峰,采用透析复性的方法对两者复性.B亚基较易复性,直接置于2M脲的醋酸缓冲液中透析复性.A亚基复性较难,在连续脲梯度的醋酸缓冲液中进行复性,控制适当的浓度变化率,获得较好的复性效果.复性效果可以通过紫外和荧光光谱观测.2.3藻蓝蛋白及其亚基对肺腺癌细胞SPC-A-1生长的影响2.3.1肺腺癌SPC-A-1细胞的培养用含有10%的热灭活新生牛血清的RPM I-1640培养基,37e、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养至对数生长期后用于实验.2.3.2细胞毒性分析用日本同仁化学研究所的CCK-8试剂盒检测[12].取长至7~8成满的细胞消化离心,制成悬液,每孔80L L接种于96孔板,使每孔约3000~ 4000个细胞.培养24h后,加入不同浓度的20L L 的C-PC、A亚基和B亚基以获得所需的终浓度梯度,蛋白质浓度用Folin-酚法确定,每个浓度设5个复孔,并设不加药物的阴性对照和不加细胞的空白对照.分别以不同的时间梯度进行培养后,加入10L L CCK-8试剂,置饱和湿度培养箱培养2h后,用酶标仪在450nm下测吸光值.按以下公式计算抑制率:细胞抑制率=(阴性对照组-实验组)/(阴性对照-空白对照).用S统计对数据进行分析[10].3结果3.1藻蓝蛋白亚基的分离结果离子交换层析结果可见两个明显的蛋白收集峰,如图1所示.经SDS聚丙烯酰胺电泳确定,其中先出峰的是B亚基,后出峰的为A亚基,分离达到电泳单一条带.图1C-PC亚基的层析图谱Fig.1Column chro mat og raphy of C-PC subunits流速:0.5mL#min-1,洗脱梯度:0~0.2m ol#L-1NaCl的醋酸缓冲液,各150mL连续梯度洗脱3.2藻蓝蛋白及其亚基的紫外可见光谱分析变性状态下藻蓝蛋白及其亚基三者的紫外可见光谱很相似(见图2).复性后三者的区别较明显(见图3),可见区藻蓝蛋白的最大吸收峰为620nm,而且在600nm处还有一个明显的肩峰;A亚基最大吸收峰为624nm;B亚基最大吸收峰为610nm.由图证明亚基的复性已经比较成功.320浙江大学学报(理学版)第37卷图2 变性状态的藻蓝蛋白与变性状态的B 亚基、A 亚基Fig.2 UV -V is spectral scan of denatured C -PC and B ,A subunits图3 藻蓝蛋白、B 亚基和A 亚基的紫外可见光谱Fig.3 U V -V is spectra l scan o f C -P C and B ,A subunits3.3 荧光光谱图A 亚基的最大激发波长为610nm,最大发射峰642nm(见图4(a)),另外280nm 的光也能够激发A亚基的荧光,最大发射峰依然为642nm.B 亚基最大激发波长为623nm ,最大激发峰650nm (见图4(b)).藻蓝蛋白的荧光最大发射峰为648nm.图4 亚基荧光发射光谱A 亚基(610nm 激发,图4(a))、B 亚基(623nm 激发,图4(b))F ig.4 F luor escence emission spectrum of A subunit(610nm)and B subunit (623nm)3.4 SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳参照5分子克隆实验指南6配制15%的分离胶,采用10V #cm -1的电压跑电泳,考马斯亮蓝染色,电泳结果显示(见图5)两个亚基分离成功,在SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳显示为一条带[10].图5 亚基的电泳图片Fig.5 Electr opho resis pattern of subunits1:C -PC,2、3:A 亚基,4:B亚基图6 C -P C 、A 亚基与B 亚基对SP C -A -1细胞生长的影响F ig.6 Effects of C -PC,A subunit and B subuniton gr ow th of SPC -A -1cells3.5 C -PC 及其亚基对SPC -A1细胞生长的影响C -PC 对该细胞的生长有抑制作用,并有良好的时间和剂量关系(见图6(a)).较高浓度的C -PC 有显著的抑制作用,40L mo l #L -1的C -PC 处理细胞24h 后,细胞存活率降至67.75%;60L mo l #L-1的C -PC 处理细胞24h 后,细胞存活率仅为34.10%.321第3期张 昕,等:螺旋藻C -藻蓝蛋白亚基分离及抗肿瘤活性研究但是,较低浓度的C-PC对SPC-A-1细胞的杀伤效果则明显较弱,10L mol#L-1的C-PC处理该细胞48h 后,细胞存活率为81.50%;而5L mol#L-1的C-PC 处理该细胞48h后,细胞存活率仍高达90.11%.A亚基对SPC-A-1细胞的生长有一定的抑制作用,20L m ol#L-1的A亚基处理该细胞48h后存活率与对照细胞相比降为75.32%,总体效果与相同摩尔浓度的C-PC杀伤效果相当(见图6(b)),B亚基对SPC-A-1细胞生长的影响,与相同摩尔浓度的C-PC和A亚基相比(见表1),B亚基对该细胞具有更显著的杀伤效果,具有良好的剂量和时间关系.10L mol#L-1浓度的B亚基处理该细胞24h后存活率降为45.30%,20L m ol#L-1的B亚基处理该细胞48h后,细胞存活率仅为13.69%,提示B亚基作为抗肿瘤药物的良好潜力(见图6 (c)).表1相同摩尔浓度下B亚基分别与C-PC、A亚基对SPC-A-1细胞抑制作用比较(x?s) T able1Co mpar ison of the ant-i tumor ef fects of B subunit,C-PC and A subunit on the SPC-A-1cellsin the same concentr atio n(x?s)样品浓度(L mol#L-1)151020 C-PC组/%24h95.48?0.5*92.46?0.7*73.54?0.8*48h90.11?0.6*81.50?0.8*68.44?0.6* A亚基组/%24h92.11?0.7*85.45?0.8*82.78?0.5**78.64?0.6**48h88.86?0.5*86.47?0.5**80.09?0.6**75.32?0.8* B亚基组/%24h81.50?0.8**66.19?0.6**45.30?0.7**36.77?0.7**48h75.69?0.9**40.31?0.5**29.88?0.5**13.69?0.5**注t检验,*P<0.05,**P<0.01(vs control)4结论藻蓝蛋白是一种普遍存在于蓝藻中,含开链四吡咯结构的天然色素蛋白.藻蓝蛋白亚基与藻蓝蛋白性质相近,但是亚基分子量小,更容易直达病灶,与细胞发生作用.本文第1次在藻蓝蛋白的分离中运用热变性的方法,简化了藻蓝蛋白的提取方法,降低了生产成本.通过脲变性、CM-Sepharose F.F.阳离子交换层析与透析复性得到电泳单一条带的亚基.得到的亚基保持了藻蓝蛋白原有的光谱学性质和荧光性质,三者可见区吸收峰在620nm附近,荧光最大发射峰很接近,都在640nm和650nm之间.这证明了此方法分离C-PC亚基行之有效.变性状态下藻蓝蛋白及其亚基三者的紫外可见光谱很相似,可以说基本没有什么大的区别,这是由于在变性条件蛋白质处于舒展状态,发色团周围氨基酸对发色团的影响不大即发色团所处的环境为溶液环境,所以三者的光谱学性质接近.复性后三者的区别较明显,说明亚基的复性比较成功,发色团的发色受到了周围氨基酸环境的影响.藻蓝蛋白对肿瘤细胞具有直接杀伤作用,国内外已有文献报道.李冰等[11]认为,藻蓝蛋白具有抗肿瘤效应,其机理可能是藻蓝蛋白作为一种有丝分裂原,可与肿瘤细胞表面的有丝分裂受体结合,通过受体的交联和蛋白激酶活化从而促进细胞内CD59基因的转录表达,诱导死亡结构域的活化,从而抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞的凋亡.亚基的分子量小,更容易与细胞表面受体结合,与细胞发生作用,因此亚基具有更好的抗癌效果,特别表现在B亚基.5L mol#L-1B亚基浓度作用48h后的抑制率已经达到59.69%,具有很好的抗肿瘤潜力.这为藻蓝蛋白抗肿瘤药物的开发研究奠定了基础.由于提取工艺比较复杂,特别是工艺中包含了蛋白质的变性复性,导致亚基的质量不是很稳定,限制了进一步研究和实际应用.此外,A亚基对该细胞株的生长抑制与藻蓝蛋白差不多,这意味着三者与细胞的作用效果除受分子大小的影响还受其它因素的影响,需要进行进一步的研究和探讨.参考文献(References):[1]GL A ZER A N.Phy co bilipr oteins-a 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螺旋藻C-藻蓝蛋白亚基分离及抗肿瘤活性研究
获得 高纯 度 的 藻蓝 蛋 白 （ — Ｃ， ／ ＞ ４ ５ ． — Ｃ 用 ８ ｍｏ 。 ＣＰ Ａ Ａ 。 ． ）Ｃ Ｐ 卜Ｉ 的尿 素 溶 液 变性 ， Ｃ Ｓ ｐ ａｏ ｅＦ Ｆ 阳 离 ＿ 过 Ｍ— ｅ ｈ ｒ ｓ ． ．
子交换层析 、 析 、 透 复性 ， 得 具 活 性 的 Ｃ～ 获 ＰＣ亚 基 ． Ｃ 用 ＣＫ一 ８试 剂盒 分 别研 究 了 Ｃ Ｐ ｄ和 Ｂ亚 基 对 一 个 肺 腺 癌 细 — Ｃ、
（ 江大学 生命科学学 院 ， 物化学研究所 ， 江 杭州 ３０５） 浙 生 浙 １ ０ ８
摘 要 ： 解 决 Ｃ 藻 蓝 蛋 白分 子 较 大 ， 以 直 接 与 细 胞 发 生 作 用 的 问题 ， 藻 蓝 蛋 白 亚 基 的 分 离 纯 化 方 法 进 行 研 为 难 对 究 ， 初 步 探 讨 了其 对 肿 瘤 细 胞 的抑 制 作 用 ． 通 过 热 变 性 、 析 和 自制 的 羟 基 磷 灰 石 吸 附 层 析 ， 钝 顶 螺 旋 藻 中 并 对 盐 从
中 图 分 类 号 ： ５ Ｑ ｌ
ＺＨＡＮＧ Ｘｉ ｄ ｉｎ ｙ ｎ ｎ，Ｉ Ｊａ — ｏ ｇ，ＧＯＮＧ ｎ — ｕ （ ｎ ｔｔｔ ｆＢｉｃ ｅ ｉｔｙ ， ｌｅ ｅｏ ’ｉ ｅＳｃｅ ｃ ｓ ｈ ｊａ ｇＵｎ — Ｘｉｇ ｇ ｏ Ｉ ｓｉ ｅ ｏｈ ｍ ｓｒ Ｃｏｌｇ Ｊ ｌｆ ｉｎ ｅ ，Ｚ ｅ ｉｎ ｉ ｕ ｏ
ｖ ｒ ｉｙ ，Ｈ ａｎ ｅｓｔ ｇｚｈ ００５ ｏｕ ３１ ８，Ｃｈｉ ｎａ）
Ｉｏａｉｎ ｏ Ｐ ｓ ｂ ｎ￣ ｆｏ ｓ ｉｕｉａ ｐａｅ ｓｓ ａ ｄ ｉ ｈｂｔｒ ｆｅｔｏ Ｐ 。 １ ｅｌｌ ｅ Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｈｅｉｎ ｓ ｌｔ ｆＣ— Ｃ ｕ ｕ ｉ ｒ ｍ ｐ ｒ ｌ ｌｔｎ ｉ ｎ ｎ ｉｉｏｙ ｅｆｃ ｎ Ｓ Ｃ Ａ‘ ｃｌ ｉ ． ｏ ｒ ａ ｆＺ ｊ ｇ ｏ ｎ ｎ ａ
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螺旋藻藻蓝蛋白的分离
摘要: 藻蓝蛋白(Phycocyanin)是一个具有生物活性功能的天然蓝色素蛋白,已被用作优质蛋白源,添加于食品和鱼饵料中, 具有抗氧化、增强人体免疫力等功能, 又可制成荧光探针, 用于免疫学、细胞生物学等领域。
本文主要介绍运用硫酸铵盐析与层析柱结合法从螺旋藻中分离提取藻蓝蛋白。
藻蓝蛋白是一类普遍存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素,一种特殊的色素蛋白, 由开链四吡咯化合物和脱辅蛋白通过硫链键结合。
藻蓝蛋白在螺旋藻中的含量高达10%～20% , 是螺旋藻细胞中重要的光合作用的天然色素,在光合作用中能以近乎100% 的高效率把光能优先地传递给光系统。
藻蓝蛋白既可以作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、染料等工业。
同时藻蓝蛋白具有强烈荧光可制成荧光试剂、荧光探针、荧光示踪物质等, 用于临床医学诊断、免疫化学及生物工程等研究领域中。
同时藻蓝蛋白还是一种无毒副作用的理想光敏剂。
由于藻蓝蛋白具有良好的开发前景, 在螺旋藻的含量较高, 螺旋藻中藻蓝蛋白的研究成了藻类蛋白研究的热点。
1工艺流程
弃去下层墨绿色沉淀
↗
螺旋藻（加入提取液）→冻融→离心（10000r/min,15min）→取亮蓝色上清液→加入
↗弃去蓝色沉淀(NH4)2SO4固体粉末（在溶液浓度达到20%）→离心（10000r/min,15min）→取亮蓝色
上清液→加入(NH4)2SO4固体粉末（在浓度达到50％）→离心（10000r/min,15min）→
取得深蓝色沉淀→加入蒸馏水→装入层析袋→蒸馏水中层析（4℃）→过柱纯化→结果检测↘
弃去黄绿色上清液
2分离纯化具体方法
2.1取螺旋藻粉颗粒倒入塑料瓶中，加提取液。
2.2.将塑料瓶用滤纸封住瓶口置低温（－20℃）下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。
如此反复冻融多次（实验中此步骤我们只做了一次，其余由老师帮做）,细胞可在形成冰粒和增高剩余胞盐浓度的同时,发生溶胀破碎。
实验现象:解冻前:墨绿色固状(略带紫色)解冻后:墨绿色溶液
2.3.冻融所得溶液分两次在10000rpm下高速离心15min，得到亮蓝色上清液，用小烧杯收集，弃去下层墨绿色沉淀。
2.4.称取之前已经研磨好的(NH4)2SO4固体粉末，分多次缓慢加入小烧杯中，边加边搅拌，使溶液的(NH4)2SO4浓度达到20％。
在10000rpm下高速离心15min，离心沉降后，取得亮蓝色上清液，弃去蓝色沉淀。
2.5.称取之前已经研磨好的(NH4)2SO4固体粉末，分多次缓慢加入小烧杯中，边加边搅拌，使溶液的(NH4)2SO4浓度达到50％。
在10000rpm下高速离心15min，离心沉降后，取得深蓝色沉淀，弃去黄绿色上清液。
加适量蒸馏水溶解所得沉淀备用(水因尽量少,有利于渗析)。
2.6.剪取约25cm长的层析袋，放入烧杯中煮沸5min（从水沸开始计时），将其中一头用细线扎住，对折后再用细线扎住。
将之前溶解沉淀的溶液倒入层析袋中。
放入蒸馏水中，4℃下透析2—3天。
2.7.取一支层析柱，检漏后清洗干净，用两个铁夹固定在铁架台上，要从正面和侧面检查是否竖直，如不竖直则作出调整。
称取40gDEAE—纤维素—52于一烧杯，加150ml0.5MHCL 溶液，轻搅,浸20min，小心倒掉上清液，补水到同一刻度，轻轻搅拌溶液，均匀地倒入柱中。
柱中液面上要保留2～3cm的空间，之后液面每下移到原刻度位置，就补水到相应高度，使蒸馏水始终高于填料2cm以上。
2.8.剪一片刚好可以覆盖填料平面的滤纸，轻放入填料面。
将准备好的层析柱中的缓冲液放出，待液面比填料高出大约只有1cm时，关闭柱开关。
用胶头滴管吸取透析后的藻蓝蛋白粗提液，伸入柱液面内，沿管壁以很慢的速度将粗提液滴到液面中部，待液面升高后可以加快滴加速度。
待液面离柱口只有大约2cm距离时，把开关完全打开，一边继续滴加粗提液。
现象：开始有颜色分层，由上到下分别为蓝色，绿色，黄色
2.9.待粗提液液面比填料高出大约只有1cm时，滴加50ml，0.02M，pH6.5磷酸缓冲液冲洗残余粗提液，不要一次加入，应先加少量把残余粗提液冲洗干净(至溶液澄清为止)，再大量加入。
最后加入0.5MNaCL—0.02M，Ph6.5磷酸缓冲液（流速：1.0ml/min）。
第一次洗脱后现象：洗脱一段时间后出现红色层，最后出现明显的四个分层，由上到下分别为蓝色，绿色，青色，粉红色。
2.10.小心观测，待有浅蓝色溶液流出时，马上开始收集。
2.11.结果检测
3结论
目前，螺旋藻主要以干粉形式直接应用食品行业，由于受其溶解性质的局限性，使其应
用受到一定的限制螺旋藻是丝状的多细胞蓝藻,因含有多种对人体有益的营养物质而受到广
泛的关注,其突出特点是氨基酸种类齐全且蛋白质含量高,其中含量最高的藻蓝蛋白(PC)一
直是基础研究的热点,不仅在光合作用的原初反应机理的探索方面有重要意义,而且可以作
为生物体内的荧光示踪物质,作为天然的色素蛋白也具有十分广阔的应用前景。
但由于藻蓝
蛋白分离纯化的困难,普及化有难度。
目前主要研究在于简化分离提纯的工艺流程，节约成本，解决普及化。
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