螺旋藻中藻蓝蛋白提取的工艺流程
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度谭一心一、实验目的学习并掌握提取、纯化藻蓝蛋白及紫外可见光谱仪检测纯度的方法。
二、实验原理1冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。
如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀破碎。
2盐析法：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。
盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集，并从溶液中析出。
3DEAE—纤维素：二乙基胺乙基纤维素，总交换量0.9meq/g功能基：二乙基胺乙基，弱碱性阴离子交换剂。
原理：含有某些功能基团，可以进行离子交换，性能比一般离子交换树脂温和，适用于分离具有生物活性的大分子，可以将性质相近的大分子物质分开。
1.装柱：装柱前先将层析柱垂直固定在支架上。
装柱的方法分干装和湿装两种。
干装是直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将气泡排尽。
湿装法是先加适量溶剂到柱中，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液缓缓下降到需要的高度，吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，以防气泡产生。
2.加样：经过平衡的层析柱当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。
加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2（体积越小越有利于提高分辨率）。
3.洗脱：待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂（5cm），并在柱上端与装有洗脱剂的储液瓶连接开始洗脱。
同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集（按体积或时间分管收集）。
4.测定：随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。
螺旋藻中藻蓝蛋白提取的工艺流程
螺旋藻中藻蓝蛋白提取的工艺流程王艺生物技术二班20100404071、预处理将螺旋藻洗净晾干2、细胞破碎利用超声波破碎发破碎细胞，藻胆蛋白属于胞内蛋白质，要提取分离藻胆蛋。
首先必须要破坏藻类细胞的细胞壁、细胞膜，使藻胆蛋白以溶解的状态释放出来，并保持其活性。
超声波细胞粉碎仪破碎鱼腥藻细胞的最佳处理条件是超声仪的功率为600 W，超声时间为9min，固液比为1：8，破壁容量为20 mL。
也可与其他方法合用最大限度的破碎细胞。
3、提取（初步分离）（1）用超滤膜过滤藻胆蛋白提取液，获得藻胆蛋白粗制品。
用NaNO3，高渗一超滤法分离提纯藻胆蛋白，超滤时选用聚砜膜，在超滤过程中，无机盐和小分子蛋白质，包括小分子的藻毒素透过滤膜而去掉，特别适用于易产生水华的微囊藻脱毒，提高产品的安全性。
NaNO3高渗．超滤法是提取藻胆蛋白的简单易行的方法，用此法提取的藻胆蛋白是安全无毒的，且易于纯化，脱水方便，产品易于干燥。
（2）也可利用沉淀法将大量盐加到蛋白质溶液中，蛋白质胶粒凝结并沉淀析出，因此向细胞破碎液中加入盐溶液使蛋白质沉淀析出。
用25％硫酸铵可将藻红蛋白沉淀出，用30％硫酸铵可将藻蓝蛋白沉淀出，再用50％硫酸铵可将蓝藻蛋白沉淀出。
4、精制（高度纯化）离子交换层析法，用 DEAE一步纯化藻蓝蛋白；改变传统以离子强度作梯度洗脱的方法，根据藻红蛋白的等电点进行pH梯度洗脱，仅用DEAE一步层析，就将藻红蛋白纯度从1.042提高至5.6，回收率达67.33％。
用硅藻土545柱分级洗脱，再用该法纯化，从螺旋藻中获得初度为4.1的藻蓝蛋白和纯度为4.6的别藻蓝蛋白；将提取液上DE。
AE一52纤维素柱，提取纯度只有1.9，在上葡聚糖凝胶柱，则得到了纯度较高的蓝藻蛋白。
5、成品制作随着藻蓝蛋白制品的应用范围的不断扩大，对提取分离工艺的要求也逐渐提高。
不仅要有高的提取率、好的产品质量，而且要考虑省时、省力、自动化程度高。
利用缓慢冷却加晶种的方法使藻蓝蛋白结晶，干燥后进行保存。
藻蓝蛋白的提取
藻蓝蛋白的提取方法1.PBS 缓冲液直接提取法(1)配制pH=6.0 的PBS 缓冲溶液。
(2)称取20 g 螺旋藻粉, 加入步骤( 1) 配制的缓冲溶液200 mL, 然后将其放在磁力搅拌器上搅拌 4 h, 将搅拌后的溶液置于离心机中10 000 g 离心10 min, 收集蓝色上清液。
(3) 将离心得到的上清液加洗涤剂洗涤, 再将洗涤后溶液进行过滤。
(4)将滤液用旋转真空蒸发仪蒸干, 可得蓝色固体,将固体置于干燥器中 1 h, 待完全干燥后取出, 将其研磨成蓝色粉末样品。
2藻蓝蛋白的富集分离2 .1螺旋藻细胞的破碎准确称取0 .5 g 螺旋藻粉, 加入100 mL 的pH =7 .0 、0 .01 mol/L 的H3PO4 缓冲液, 采用反复冻融(3 次)的方法对藻体细胞进行破碎, 在显微镜下观察计数细胞破碎率在90%以上即可.将破碎的螺旋藻细胞悬浊液于4 000 r/min 离心20min , 倾倒上清液可得到含藻蛋白的粗提液.在568 、620 和650 nm处测粗提液的吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量.2.2 盐析法沉淀藻蓝蛋白在装有固定体积藻蛋白粗提液的烧杯中加入一定量的(N H4)2SO4 溶液, 边加边搅拌, 以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性, 最终(NH4)2 SO4 溶液的质量浓度分别为20 %、40 %、50 %和60 %, 然后分别在20 ℃和40 ℃下对(NH4)2 SO4 盐析法沉淀藻蓝蛋白进行实验研究.在设置的温度和盐浓度下静置过夜, 再于-4 ℃离心机中以10 000 r/min 离心20 min , 将离心得到的沉淀用1/4 上清液体积的H3PO4 缓冲液(pH =7 .0)溶解, 并倾倒于透析袋中, 再置于去离子水中透析24h(每隔4 h 更换一次去离子水);透析结束后, 再于-4 ℃离心机中以10 000 r/min离心25 min ;用移液管抽取上清液,在568 、620 和650 nm 下测吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量.2 .3 等电点法沉淀藻蓝蛋白在装有固定体积藻蛋白粗提液的烧杯中加入0 .1 mo l/L 稀H2 SO4 溶液, 边加边搅拌,以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性, 将藻蛋白粗提液pH调节为3 .0 、4 .0 和5 .0 , 即藻蓝蛋白的等电点附近,静置过夜, 于-4 ℃离心机中以10 000 r/min 离心20 min ;将离心得到的沉淀用1/4 上清液体积的H3PO4 缓冲液(pH =7 .0)充分溶解, 再于-4 ℃高速离心机中以10 000 r/min 离心25 min ;用移液管抽取上清液,在568 、620 和650 nm 下测吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量.2 .4 藻蓝蛋白的收率和分离因数分别计算藻蓝蛋白的收率(Y )、浓缩率(m)和分离因数(β):式(3)-(5)中, N(g/L)为藻液比, 0 和t 分别代表冷冻-融化后藻蛋白粗提液和经过盐析法沉淀或等电点法沉淀最终得到的藻蓝蛋白上清液.双水相萃取（1）藻蓝蛋白的初步提取。
藻蛋白提取实验报告
一、实验目的本实验旨在通过学习并掌握藻蛋白的提取方法，了解不同提取方法对藻蛋白提取效果的影响，并对提取得到的藻蛋白进行初步的纯化及鉴定。
二、实验原理藻蛋白主要存在于藻类植物中，如螺旋藻、小球藻等。
藻蛋白的提取方法主要有物理法、化学法和生物法。
本实验采用物理法中的冻融法提取藻蛋白，该方法操作简单，对藻类植物损伤小，提取效率较高。
三、实验材料与仪器材料：1. 螺旋藻粉2. 蒸馏水3. 0.1mol/L的KOH溶液4. 0.1mol/L的HCl溶液5. 95%乙醇6. 无水乙醇7. 丙酮8. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）仪器：1. 电子天平2. 磁力搅拌器3. 超声波清洗器4. 高速离心机5. 蒸发皿6. 烧杯7. 离心管8. 吸管9. 滤纸四、实验步骤1. 藻蛋白粗提1. 称取10g螺旋藻粉，置于100ml离心管中。
2. 加入50ml蒸馏水，充分搅拌，使螺旋藻粉充分溶解。
3. 将混合液置于冰浴中冷却，每隔30分钟搅拌一次，共冷却2小时。
4. 冷却完成后，以4000r/min的转速离心10分钟，收集上清液。
5. 将上清液转移至烧杯中，加入95%乙醇，使蛋白质沉淀，静置30分钟。
6. 以4000r/min的转速离心10分钟，收集沉淀。
7. 将沉淀用蒸馏水洗涤三次，以去除杂质。
2. 藻蛋白纯化1. 将洗涤后的沉淀溶于适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中。
2. 将混合液通过DEAE纤维素层析柱，用磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱。
3. 收集含有藻蛋白的洗脱液，经浓缩、冷冻干燥后得到藻蛋白。
五、实验结果与分析1. 藻蛋白粗提通过冻融法提取的藻蛋白，在95%乙醇中沉淀，经离心后得到淡蓝色沉淀，表明藻蛋白提取成功。
2. 藻蛋白纯化通过DEAE纤维素层析柱纯化后，得到的藻蛋白在紫外-可见光谱上呈现出典型的藻蓝蛋白特征峰，表明纯化成功。
六、实验结论本实验采用冻融法和DEAE纤维素层析柱法成功提取并纯化了藻蛋白。
实验结果表明，冻融法是一种简单、高效的藻蛋白提取方法，而DEAE纤维素层析柱法可以进一步纯化藻蛋白，提高其纯度。
藻蓝蛋白生产工艺
藻蓝蛋白生产工艺藻蓝蛋白是一种天然的蓝色色素，广泛用于食品、药品和化妆品等领域。
藻蓝蛋白的生产工艺一般包括培养和提取两个步骤。
首先是藻类培养。
选择一种高产藻类作为目标菌株，常用的有蓝细菌和蓝藻等。
蓝藻是一种常见的藻类，具有高产蓝色素的特点。
蓝藻可以在光合作用下自主合成藻蓝蛋白，因此只需提供充足的光照和适宜的培养基即可。
蓝藻的培养一般采用液体培养法或固体培养法。
液体培养法是将蓝藻菌种接种到含有适宜营养物的培养液中，利用搅拌或充气等方法提供充足的氧气和养分，以促进菌株的生长和藻蓝蛋白的合成。
固体培养法是将蓝藻菌种接种到含有固体基质的培养皿或柱中，通过调节温度和湿度等因素，为蓝藻的生长提供适宜的环境条件。
在培养过程中，需要控制培养液的温度、光照强度和光周期等参数，以及添加适当的营养物，如碳源、氮源和矿物盐等。
此外，还要注意防止外源污染和细胞自身的寄生菌感染等问题。
培养达到一定程度后，即可进行藻蓝蛋白的提取。
提取工艺一般包括细胞破碎、离心和过滤等步骤。
首先将培养液中的藻藻菌株离心下沉，然后通过破碎细胞壁的方法将细胞内的藻蓝蛋白释放出来。
常用的破碎方法包括超声波破碎和高压破碎等。
接下来，通过离心和过滤等步骤将藻蓝蛋白与细胞碎片、杂质等分离，得到相对纯净的藻蓝蛋白溶液。
最后，对提取得到的藻蓝蛋白溶液进行精制和纯化。
常用的精制方法包括吸附、离子交换和凝胶过滤等。
通过这些方法，可以去除藻蓝蛋白中的杂质和不纯物质，提高藻蓝蛋白的纯度和质量。
总之，藻蓝蛋白的生产工艺包括培养和提取两个步骤。
培养过程中需要控制好培养液的环境参数和添加适宜的营养物，提取过程中需要采用破碎、离心和过滤等方法将藻蓝蛋白与细胞碎片等分离，最后通过精制和纯化等步骤提高藻蓝蛋白的纯度和质量。
藻蓝蛋白的生产工艺流程
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在进行藻蓝蛋白的生产之前，藻种培养是关键的第一步。
螺旋藻藻蓝蛋白的分离
螺旋藻藻蓝蛋白的分离摘要: 藻蓝蛋白(Phycocyanin)是一个具有生物活性功能的天然蓝色素蛋白,已被用作优质蛋白源,添加于食品和鱼饵料中, 具有抗氧化、增强人体免疫力等功能, 又可制成荧光探针, 用于免疫学、细胞生物学等领域。
本文主要介绍运用硫酸铵盐析与层析柱结合法从螺旋藻中分离提取藻蓝蛋白。
藻蓝蛋白是一类普遍存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素,一种特殊的色素蛋白, 由开链四吡咯化合物和脱辅蛋白通过硫链键结合。
藻蓝蛋白在螺旋藻中的含量高达10%～20% , 是螺旋藻细胞中重要的光合作用的天然色素,在光合作用中能以近乎100% 的高效率把光能优先地传递给光系统。
藻蓝蛋白既可以作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、染料等工业。
同时藻蓝蛋白具有强烈荧光可制成荧光试剂、荧光探针、荧光示踪物质等, 用于临床医学诊断、免疫化学及生物工程等研究领域中。
同时藻蓝蛋白还是一种无毒副作用的理想光敏剂。
由于藻蓝蛋白具有良好的开发前景, 在螺旋藻的含量较高, 螺旋藻中藻蓝蛋白的研究成了藻类蛋白研究的热点。
1工艺流程弃去下层墨绿色沉淀↗螺旋藻（加入提取液）→冻融→离心（10000r/min,15min）→取亮蓝色上清液→加入↗弃去蓝色沉淀(NH4)2SO4固体粉末（在溶液浓度达到20%）→离心（10000r/min,15min）→取亮蓝色上清液→加入(NH4)2SO4固体粉末（在浓度达到50％）→离心（10000r/min,15min）→取得深蓝色沉淀→加入蒸馏水→装入层析袋→蒸馏水中层析（4℃）→过柱纯化→结果检测↘弃去黄绿色上清液2分离纯化具体方法2.1取螺旋藻粉颗粒倒入塑料瓶中，加提取液。
2.2.将塑料瓶用滤纸封住瓶口置低温（－20℃）下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。
如此反复冻融多次（实验中此步骤我们只做了一次，其余由老师帮做）,细胞可在形成冰粒和增高剩余胞盐浓度的同时,发生溶胀破碎。
实验现象:解冻前:墨绿色固状(略带紫色)解冻后:墨绿色溶液2.3.冻融所得溶液分两次在10000rpm下高速离心15min，得到亮蓝色上清液，用小烧杯收集，弃去下层墨绿色沉淀。
藻蓝蛋白的提取与纯化
螺旋藻粉提取藻蓝蛋白摘要：藻蓝蛋白是一种可用于配制化妆品及各种天然食品或荧光探针标记的多用途蛋白。
本实验旨在找出最适螺旋藻粉中提取藻蓝蛋白的工业提取工艺。
对藻蓝蛋白的提取，本课题组采用了反复冻融法、水提法、缓冲液法，以找出提取效率高，成本低的方法。
实验结果显示，反复冻融三次的藻蓝蛋白浓度A620/A280分别为：0.819/1.871、0.597/1.676、0.245/0.629;水提法三次的A620/280分别为：0.842/1.768、0.650/1.136、0.177/0.737;缓冲液提取三次的A620/A280分别为：1.040/2.102、0.260/0.630、0.052/0.247。
在蛋白质的分离时，采用两步盐析法，盐析前A620=1.143，A280=1.983；两步盐析后，A620=2.203，A280=1.492。
最后在纯化方法上选择了羟基磷灰石柱分离，得到蛋白样品A620=1.379，A280=0.528。
关键词：螺旋藻；藻蓝蛋白；二次盐析；柱分离介绍：藻蓝蛋白既是一种蛋白质，又是一种很好的天然食用色素，同时又是极好的保健食品。
藻蓝蛋白是自然界中少见的色素蛋白之一，不仅颜色鲜艳，而且本身是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全，必需氨基酸含量高。
藻蓝蛋白具有抗癌、促进血细胞再生、养护卵巢、促使人体内合成弹力蛋白等功效。
21世纪初，在欧美、日本等国，藻蓝蛋白广泛用作食品和化妆品的高级天然色素，并被制成生化药品。
因为藻蓝蛋白为胞内蛋白，所以细胞破碎技术是直接影响蛋白提取得率的关键因素之一。
藻蓝蛋白的提取一般有超声波、高压均质、反复冻融、水提法、缓冲液提法等【1】。
本实验通过反复冻融、水提法和缓冲液法对螺旋藻细胞进行破碎提取藻蓝蛋白，对各条件下得到的蛋白溶出率进行了比较分析，确定了各条件下蛋白提取的最佳条件。
在藻蓝蛋白的分离时，主要是把蛋白质与提取液中其他物质分离。
可利用蛋白质的盐析【2】，和调节PH使蛋白变性等，使蛋白质从提取液中分离出来；最后，再把藻蓝蛋白从杂蛋白中分离出来，常用的方法有柱分离法等【3】。
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螺旋藻中藻蓝蛋白提取的工艺流程
王艺生物技术二班2010040407
1、预处理
将螺旋藻洗净晾干
2、细胞破碎
利用超声波破碎发破碎细胞，藻胆蛋白属于胞内蛋白质，要提取分离藻胆蛋。
首先必须要破坏藻类细胞的细胞壁、细胞膜，使藻胆蛋白以溶解的状态释放出来，并保持其活性。
超声波细胞粉碎仪破碎鱼腥藻细胞的最佳处理条件是超声仪的功率为600 W，超声时间为9min，固液比为1：8，破壁容量为20 mL。
也可与其他方法合用最大限度的破碎细胞。
3、提取（初步分离）
（1）用超滤膜过滤藻胆蛋白提取液，获得藻胆蛋白粗制品。
用NaNO3，高渗一超滤法分离提纯藻胆蛋白，超滤时选用聚砜膜，在超滤过程中，无机盐和小分子蛋白质，包括小分子的藻毒素透过滤膜而去掉，特别适用于易产生水华的微囊藻脱毒，提高产品的安全性。
NaNO3高渗．超滤法是提取藻胆蛋白的简单易行的方法，用此法提取的藻胆蛋白是安全无毒的，且易于纯化，脱水方便，产品易于干燥。
（2）也可利用沉淀法将大量盐加到蛋白质溶液中，蛋白质胶粒凝结并沉淀析出，因此向细胞破碎液中加入盐溶液使蛋白质沉淀析出。
用25％硫酸铵可将藻红蛋白沉淀出，用30％硫酸铵可将藻蓝蛋白沉淀出，再用50％硫酸铵可将蓝藻蛋白沉淀出。
4、精制（高度纯化）
离子交换层析法，用 DEAE一步纯化藻蓝蛋白；改变传统以离子强度作梯度洗脱的方法，根据藻红蛋白的等电点进行pH梯度洗脱，仅用DEAE一步层析，就将藻红蛋白纯度从1.042提高至5.6，回收率达67.33％。
用硅藻土545柱分级洗脱，再用该法纯化，从螺旋藻中获得初度为4.1的藻蓝蛋白和纯度为4.6的别藻蓝蛋白；将提取液上DE。
AE一52纤维素柱，提取纯度只有1.9，在上葡聚糖凝胶柱，则得到了纯度较高的蓝藻蛋白。
5、成品制作
随着藻蓝蛋白制品的应用范围的不断扩大，对提取分离工艺的要求也逐渐提高。
不仅要有高的提取率、好的产品质量，而且要考虑省时、省力、自动化程度高。
利用缓慢冷却加晶种的方法使藻蓝蛋白结晶，干燥后进行保存。
藻蓝蛋白具有较高的促红细胞生成素(EPO)活性，它能直接刺激CFU—E的形成，对骨髓造血具有刺激作用，有很好的抗病毒活性，在细胞受感染前用APC处理的抗病毒效果比感染后处理效果更好，并且还有抗氧化和消炎活性。
因此，可以利用藻蓝蛋白的这些特点把蓝藻蛋白制作成治疗药物或者是保健食品。
分离鸡蛋清中的溶菌酶及卵清蛋白
生物技术二班李美君2010021431
1离子交换法
选用DEAE做骨架，阴离子交换剂，碱性洗脱液，PH值在8.6以下缓冲液，采用硅胶基质阴离子交换剂作为填料制作的色谱分离纯化蛋清中的溶菌酶克服了上述的弊端，获得了良好的分离效果，这种方法比传统的软基质离子交换色谱分离法速度快，纯化效率高。
2离子交换膜色谱
离子交换膜色谱主要是利用膜介质表面的基团与目标蛋白质之间进行离子交换作用进行分离的。
选用DEAE做骨架，阴离子交换剂，碱性洗脱液，PH值在8.6以下缓冲液
1.树脂的选择，选择弱酸性羧甲基交联葡聚糖阳离子交换树脂。
2.树脂预处理
3.上柱，将溶菌酶与卵清蛋白的混合液自上向下流过树脂。
4.洗涤，用蒸馏水进行洗涤。
5.洗脱，用硫酸铵溶液洗脱溶菌酶，收集洗脱液，透析得到纯净的溶菌酶。
6.树脂再生，用大量的水冲洗，然后用酸处理。
3超滤法
第一步超滤采用错流过滤，膜的错流过滤可实现混合液中物质的分离，在生物工程领域有着广泛的应用。
此步目的是除去分子量大于卵清蛋白的蛋白分子，通过膜的筛选选择了分离及清洗效果均较好的PVDF100KDa超滤膜进行操作条件的优化。
同时选择了压力0.08MPa，流速1.5L/min作为最适操作条件。
在此条件得到的透过液中卵清蛋白透过率为26.32％，溶菌酶透过率为36.72％。
第二步超滤采用终端过滤，此步的目的是将溶菌酶和卵清蛋白分离纯化，根据两种蛋白的分子量及膜的性能选择了30 KDa再生纤维素超滤膜作为此步超滤膜。