藻蓝蛋白的提取与纯化
钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特研究
钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特*研究
为发展新型海洋*物,采用SephacrylS-200凝胶层析和羟基*灰石柱层析对人工养殖钝顶螺旋藻中的藻蓝蛋白进行了分离和纯化,得到了藻蓝蛋白纯品.测定了藻蓝蛋白的氨基*组成和含量.藻蓝蛋白的紫外、可见吸收光谱表明其最大特征吸收波长为278,360,620nm.得到的藻蓝蛋白经等电聚焦显示为一条带,其等电点为pH＝4.3.还测量了藻蓝蛋白红外吸收光谱.研究所获得的藻蓝蛋白为后续开展临床应用提供了可靠的样品.
投诉
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度谭一心一、实验目的学习并掌握提取、纯化藻蓝蛋白及紫外可见光谱仪检测纯度的方法。
二、实验原理1冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。
如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀破碎。
2盐析法：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。
盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集，并从溶液中析出。
3DEAE—纤维素：二乙基胺乙基纤维素，总交换量0.9meq/g功能基：二乙基胺乙基，弱碱性阴离子交换剂。
原理：含有某些功能基团，可以进行离子交换，性能比一般离子交换树脂温和，适用于分离具有生物活性的大分子，可以将性质相近的大分子物质分开。
1.装柱：装柱前先将层析柱垂直固定在支架上。
装柱的方法分干装和湿装两种。
干装是直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将气泡排尽。
湿装法是先加适量溶剂到柱中，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液缓缓下降到需要的高度，吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，以防气泡产生。
2.加样：经过平衡的层析柱当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。
加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2（体积越小越有利于提高分辨率）。
3.洗脱：待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂（5cm），并在柱上端与装有洗脱剂的储液瓶连接开始洗脱。
同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集（按体积或时间分管收集）。
4.测定：随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。
藻蓝蛋白的分离纯化及其在食品中的应用
藻蓝蛋白的分离纯化及其在食品中的应用蓝绿藻是一种广泛存在于水体中的微生物，具有丰富的蛋白质，其中具有生物活性的藻蓝蛋白是其重要成分之一。
藻蓝蛋白具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生理功能，在食品领域中的应用也越来越受到人们的关注。
首先，提取藻蛋白是藻蓝蛋白分离纯化的第一步。
一种常用的方法是溶解蓝藻细胞膜，并通过离心等操作将藻蛋白从细胞中分离出来。
然后，可以使用尺寸排除色谱、离子交换色谱和亲和色谱等技术进一步纯化。
这些分离纯化的方法能够去除其他蛋白质和杂质，提高藻蓝蛋白的纯度。
藻蓝蛋白在食品中的应用有许多潜力。
首先，在抗氧化方面，藻蓝蛋白具有很高的自由基清除能力，可以减少食品在贮存和加工过程中的氧化反应，延长食品的保鲜期。
另外，藻蓝蛋白还能够稳定食品中的颜色，使颜色更加鲜艳。
这一特性使得藻蓝蛋白可以广泛应用于饮料、糕点等食品中，提高产品的市场竞争力。
其次，藻蓝蛋白还具有抗炎和抗肿瘤的作用。
研究发现，藻蓝蛋白能够抑制炎症反应中的炎症介质释放，从而减轻炎症反应对人体的伤害。
在食品加工过程中，添加藻蓝蛋白可以减少食品中的致炎物质的生成，提高食品的健康性。
此外，藻蓝蛋白还具有一定的抗肿瘤活性，可以用于开发新型的抗肿瘤功能性食品。
除此之外，藻蓝蛋白在食品领域中的应用还包括改善食品的营养价值和口感。
藻蓝蛋白中富含的氨基酸和多种微量元素可以提高食品的营养价值。
同时，藻蓝蛋白还具有一定的凝胶特性，在食品中可以改善质地和口感，提高食品的口感感受。
然而，尽管藻蓝蛋白在食品中的应用潜力巨大，但也面临一些挑战。
首先，藻蓝蛋白的生产成本较高，加上其稳定性和保存性能较差，限制了其在食品中的广泛应用。
其次，藻蓝蛋白作为一种新型成分，还需要进一步研究其对人体健康的影响，以确保其在食品中的安全性。
综上所述，藻蓝蛋白具有广泛的蛋白质来源、多种生理功能及一定的应用潜力，在食品领域中的研究和开发也取得了一些进展。
随着科学技术的不断发展，相信藻蓝蛋白在食品中的应用将会得到更大的推广和应用。
藻蓝蛋白生产工艺
藻蓝蛋白生产工艺藻蓝蛋白是一种天然的蓝色色素，广泛用于食品、药品和化妆品等领域。
藻蓝蛋白的生产工艺一般包括培养和提取两个步骤。
首先是藻类培养。
选择一种高产藻类作为目标菌株，常用的有蓝细菌和蓝藻等。
蓝藻是一种常见的藻类，具有高产蓝色素的特点。
蓝藻可以在光合作用下自主合成藻蓝蛋白，因此只需提供充足的光照和适宜的培养基即可。
蓝藻的培养一般采用液体培养法或固体培养法。
液体培养法是将蓝藻菌种接种到含有适宜营养物的培养液中，利用搅拌或充气等方法提供充足的氧气和养分，以促进菌株的生长和藻蓝蛋白的合成。
固体培养法是将蓝藻菌种接种到含有固体基质的培养皿或柱中，通过调节温度和湿度等因素，为蓝藻的生长提供适宜的环境条件。
在培养过程中，需要控制培养液的温度、光照强度和光周期等参数，以及添加适当的营养物，如碳源、氮源和矿物盐等。
此外，还要注意防止外源污染和细胞自身的寄生菌感染等问题。
培养达到一定程度后，即可进行藻蓝蛋白的提取。
提取工艺一般包括细胞破碎、离心和过滤等步骤。
首先将培养液中的藻藻菌株离心下沉，然后通过破碎细胞壁的方法将细胞内的藻蓝蛋白释放出来。
常用的破碎方法包括超声波破碎和高压破碎等。
接下来，通过离心和过滤等步骤将藻蓝蛋白与细胞碎片、杂质等分离，得到相对纯净的藻蓝蛋白溶液。
最后，对提取得到的藻蓝蛋白溶液进行精制和纯化。
常用的精制方法包括吸附、离子交换和凝胶过滤等。
通过这些方法，可以去除藻蓝蛋白中的杂质和不纯物质，提高藻蓝蛋白的纯度和质量。
总之，藻蓝蛋白的生产工艺包括培养和提取两个步骤。
培养过程中需要控制好培养液的环境参数和添加适宜的营养物，提取过程中需要采用破碎、离心和过滤等方法将藻蓝蛋白与细胞碎片等分离，最后通过精制和纯化等步骤提高藻蓝蛋白的纯度和质量。
藻蓝蛋白的生产工艺流程
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在进行藻蓝蛋白的生产之前，藻种培养是关键的第一步。
高纯度藻蓝蛋白分离纯化及光谱特性研究
human and rat CN TF.J Neurochem,1991,57(3):1003～10125 咸海青,范 明,甘思德,等(Xian H Q,Fan M,G an S D, et al).人睫状神经营养因子的原核表达纯化及其生物效应.中国应用生理学杂志(Chinese J Appli Phsiol),1996,12(1): 21～246 Daniel M B,Stuart J E.Protein Methods.New Y ork:Wiley2Liss Press,1991.50～1607 Marston F A O,Freedman F B.Recovery and reaction of recombi2 nant proteins.Biochem Soc Trans,1988,16(1):101～1038 Marston F A O,Angal S,Lowe P A,et al.Scale2up of the recovery and reaction of recombinant proteins.Biochem Soc Trans, 1988,16(1):112～1159 Doonan S,Walter J M.Downstream processing of protein products.Biochem Soc Trans,1990,18(1):231～234Study of R enaturation of R ecombinant H uman Ciliary N eurotrophic F actor Expressed in E.coli. XIAN Hai2Qing,FAN Ming,WU Yan(Instit ute of B asic Medical Science,A cademy of M ilitary Medical Sciences,Beiji ng100850,China);Q IU Z ong2Y in(Medical U niversity of Chongqi ng, Chongqi ng400046,China).Abstract Renaturation of human cilinary neurotrophic factor expressed in recombinant bacteria,by gel filitration chromatograph,was studied.It was showed that the renaturation rate by this way was higher than that by dilution and dialy2 sis,and the protein was purified at the same time.It was a simple,rapid,good reproducibility and efficient procedure which can be used to produce ciliary neurotrophic factor in large scale.K ey w ords recombinant ciliary neurotrophic factor, renaturation,inclusion body高纯度藻蓝蛋白分离纯化及光谱特性研究3王 勇 钱凯先董 强1)(浙江大学生物科学与技术系,杭州310027)(山东省医学科学院,济南250062)摘要 藻蓝蛋白(PC)具有特征性吸收光谱和荧光光谱,是一种新颖的荧光分子探针.为了获取高纯度PC,经过反复探索研究建立了Sephadex G2200、DEAE2SephadexA225、HA、Sephadex G2200的分离纯化程序。
蓝藻蛋白的分离与纯化
藻蓝蛋白的分离与纯化一、实验目的和要求1、了解藻蓝蛋白的生理意义及功能，藻蓝蛋白一般的提取和纯化的方法；2、掌握蛋白含量测定方法；掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的实验技术。
二、实验原理藻蓝蛋白（PC）是一类普通存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素，也是一种天然色素蛋白，具有水溶性，可用作食品着色剂。
此外，它具有强烈的荧光，在分子生物学上被制成荧光探针，是一种无毒、无副作用的理想光敏剂。
藻蓝蛋白还具有重要的医疗价值，不但能提高机体细胞的非特异性免疫功能，而且对特异性免疫功能有促进作用。
另外，它还具有清除自由基的能力，可以抗疲劳，延缓衰老，对人体的生理功能有重要的生物学意义。
利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液中电离所形成的正负离子ＮＨ可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。
由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同研究表明可用25%(NH4)2SO4 饱和度沉淀除去杂质，55%(NH4)2SO4 沉淀藻蓝蛋白。
盐析出来的蛋白质，需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。
最常用的脱盐方法是透析。
蛋白质是大分子物质，它不能透过半透膜，而小分子物质可以自由透过半透膜，顾不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂质透析掉。
蛋白含量的测定有紫外分光光度计法和显色法（Folin-酚法、考马斯亮蓝法等）本实验采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的，含量，考马斯亮蓝G-250 在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用后变为蓝色，最大光吸收由465nm 变为595nm，在一定范围内，蛋白质的含量与595nm 处吸光值成正比。
离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有弱酸性的二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。
蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团结合，结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力。
藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)
藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)藻蓝蛋白(phycocyanin , PC)是一种存在于蓝藻细胞内的光合色素 ,能高效捕获光能。
其分子质量在 40 ku 左右 ,由α、β两个亚基组成 ,亚基分子质量都在 20 ku 左右。
肽链上共价结合 1 个开链的四吡咯环辅基 ,类似动物红细胞的血红素结构。
天然存在的藻蓝蛋白通常以六聚体(αβ) 6的形式存在。
与之相近的别藻蓝蛋白(Anthocyanin ,APC)为三聚体( αβ) 3 ,在 650 nm 处有最大吸收峰。
分离纯化的水溶藻蓝蛋白在溶液中呈蓝色 ,并发出紫色荧光 ,在波长620 nm 具有特异吸收峰 ,可用吸光度 A 620 / A 280表示其纯度。
因其水溶性、无毒、清亮且着色力强等优点 ,藻蓝蛋白被广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。
藻蓝蛋白带有荧光 ,可用作荧光标记物。
一、教学目的通过藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子制备方案设计与实践研究，体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法。
整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64-80学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的动手机会。
有利于培养学生的学习兴趣。
二、实验方案1材料与方法1. 1 实验材料钝顶螺旋藻粉产自中国科学院武汉植物所 ,其他无机盐和酸碱试剂均为国产分析纯试剂。
1. 2 分析方法1.2.1藻蓝蛋白浓度的测定方法一：【曲文娟等，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术，食品科学，2007年5期，135-138】用紫外分光光度计对粗提的藻蓝蛋白溶液进行全波段扫描, 可见藻蓝蛋白的特征吸收在620nm, 异藻蓝蛋白的特征吸收在:方法二：【刘杨等，水提分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稳定性研究，天津师范大学学报(自然科学版)，Vol.28 No.3.11-14（2008）】 螺旋藻中以藻胆蛋白吸收光谱的差异作为其测定标准。
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螺旋藻粉提取藻蓝蛋白
摘要：藻蓝蛋白是一种可用于配制化妆品及各种天然食品或荧光探针标记的多用途蛋白。
本实验旨在找出最适螺旋藻粉中提取藻蓝蛋白的工业提取工艺。
对藻蓝蛋白的提取，本课题组采用了反复冻融法、水提法、缓冲液法，以找出提取效率高，成本低的方法。
实验结果显示，反复冻融三次的藻蓝蛋白浓度A620/A280分别为：0.819/1.871、0.597/1.676、0.245/0.629;水提法三次的A620/280分别为：
0.842/1.768、0.650/1.136、0.177/0.737;缓冲液提取三次的A620/A280分别为：
1.040/
2.102、0.260/0.630、0.052/0.247。
在蛋白质的分离时，采用两步盐析法，盐析前A620=1.143，A280=1.983；两步盐析后，A620=2.203，A280=1.492。
最后在纯化方法上选择了羟基磷灰石柱分离，得到蛋白样品A620=1.379，A280=0.528。
关键词：螺旋藻；藻蓝蛋白；二次盐析；柱分离
介绍：藻蓝蛋白既是一种蛋白质，又是一种很好的天然食用色素，同时又是极好的保健食品。
藻蓝蛋白是自然界中少见的色素蛋白之一，不仅颜色鲜艳，而且本身是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全，必需氨基酸含量高。
藻蓝蛋白具有抗癌、促进血细胞再生、养护卵巢、促使人体内合成弹力蛋白等功效。
21世纪初，在欧美、日本等国，藻蓝蛋白广泛用作食品和化妆品的高级天然色素，并被制成生化药品。
因为藻蓝蛋白为胞内蛋白，所以细胞破碎技术是直接影响蛋白提取得率的关键因素之一。
藻蓝蛋白的提取一般有超声波、高压均质、反复冻融、水提法、缓冲液提法等【1】。
本实验通过反复冻融、水提法和缓冲液法对螺旋藻细胞进行破碎提取藻蓝蛋白，对各条件下得到的蛋白溶出率进行了比较分析，确定了各条件下蛋白提取的最佳条件。
在藻蓝蛋白的分离时，主要是把蛋白质与提取液中其他物质分离。
可利用蛋白质的盐析【2】，和调节PH使蛋白变性等，使蛋白质从提取液中分离出来；最后，再把藻蓝蛋白从杂蛋白中分离出来，常用的方法有柱分离法等【3】。
1 藻蓝蛋白的提取
1.1 反复冻融法
本实验首先采用的是反复冻融法。
取60g螺旋藻藻粉溶于1200ml蒸馏水中，在-20℃冰箱中反复冻融三次，每次取10000r/min离心上清液。
将上清液稀释20倍后，利用藻蓝蛋白在620nm紫外光下有特殊吸收峰，测定其在280nm和620nm 下的吸收值，以测定藻蓝蛋白的浓度。
表1 冻融法提取效果
提取次数A620nm A280nm A620/A280 体积ml
1 0.819 1.871 0.438 1100
2 0.597 1.676 0.356 350
3 0.245 0.629 0.389 350
1.2 水提法
将20g螺旋藻藻粉溶于400ml蒸馏水中，在搅拌转子搅拌4h，10000r/min 离心10min，取上清液。
将沉淀溶于400ml蒸馏水后继续搅拌4h后再次10000r/min 离心10min，取上清液。
再将沉淀溶解于400ml蒸馏水进行第三次搅拌，离心后取上清液。
将三次的上清液分别稀释20倍后测定在280nm和620nm下的吸光值。
表2 水提法提取效果
提取次数A620nm A280nm A620/A280 体积ml
1 0.84
2 1.768 0.476 350
2 0.650 1.136 0.572 200
3 0.177 0.737 0.240 200
1.3 缓冲液提法
将20g螺旋藻藻粉溶于400mlPBS缓冲液中，在搅拌转子搅拌4h，10000r/min离心10min，取上清液。
将沉淀溶于400ml蒸馏水后继续搅拌4h后再次10000r/min离心10min，取上清液。
再将沉淀溶解于400ml蒸馏水进行第三次搅拌，离心后取上清液。
将三次的上清液分别稀释20倍后测定在280nm和620nm下的吸光值。
表3 缓冲液提取效果
提取次数A620nm A280nm A620/A280 体积ml
1 1.040 2.10
2 0.495 350
2 0.260 0.630 0.41
3 200
3 0.052 0.247 0.211 200
2 藻蓝蛋白的分离
不同饱和度的硫酸铵对螺旋藻藻蓝蛋白盐析的影响由表4可知，当硫酸铵饱和度为20％时，上清液在620 nm处的吸收峰值高同时在280nm处吸收峰值很低，说明杂蛋白较多的沉淀而藻蓝蛋白没有沉淀；饱和度为40%时，上清液在620nm 处吸收值最低，同时在280nm处吸收值很高，也就是藻蓝蛋白的提取量大且杂蛋白含量低，比活力的值也最大，藻蓝蛋白的提取纯度也是最大的。
所以本实验采用先20％饱和度的硫酸铵进行盐析，10000r/min离心后取上清液后，再用40%饱和度的硫酸铵进行盐析，10000r/min离心后取沉淀。
表4 不同饱和度的硫酸铵对螺旋藻藻蓝蛋白盐析的影响
硫酸铵浓度上清液A620 上清液A280 沉淀A620 沉淀A280
10%硫酸铵0.557 0.965 0.021 0.113
20%硫酸铵0.398 0.862 0.158 0.195
30%硫酸铵0.030 0.635 0.443 0.389
40%硫酸铵0.002 0.519 0.483 0.504
50%硫酸铵0.002 0.447 0.488 0.559
60%硫酸铵0.001 0.381 0.433 0.541 经过20%硫酸铵和40%硫酸铵两步盐析后，所得蛋白的A620=2.203，A280=1.442。
3. 藻蓝蛋白的纯化
3.1 羟基磷灰石的制备
称取羟基磷灰石10g，加入蒸馏水搅拌过夜。
将羟基磷灰石悬浊液迅速上柱，待羟基磷灰石压实后加入样品。
3.2藻蓝蛋白的纯化
将藻蓝蛋白粗品液分别通过10 mmol/L的PBS预平衡了的羟基磷灰石吸附上柱。
然后在洗脱过程中不断增加PBS离子强度(分别以10、20、50、100、200 mmol/L、pH=7.0的PBS缓冲液，分别收集不同离子强度缓冲液的洗脱液，并进行吸收值测定。
经过测定，过柱后的藻蓝蛋白的A620=1.379，A280=0.528，A620/A280=2.612。
4 结果
将三种提取方法从提取率，提取时间，设备需求，辅料用料及价格等多个方面进行比较【4】，结果显示：缓冲液第一次提取浓度最高A620=1.040，水提法其次A620=0.842，冻融法最差A620=0.819；第二次提取浓度水提法最高A620=0.650，冻融法其次A620=0.597，缓冲液最差A620=0.260；第三次提取，三种方法的提取浓度都很低，不利于工业生产。
淘汰提取效率低的冻融法，又由于缓冲液成本高于水，且水提法的提取浓度已经较高，所以最适合的工业提取法为二次水提法。
将水提法所得的藻蓝蛋白的粗提液用20%硫酸铵盐析，使杂蛋白尽可能沉淀，藻蓝蛋白尽量多地保存在上清液中；10000r/min离心10min后，取上清液，然后用40%的硫酸铵进行二次盐析，将藻蓝蛋白尽可能多地沉淀，杂蛋白保留在上清液中。
所得蛋白的A620=2.203，A280=1.442，A620/A280=1.528。
最后经过羟基磷灰石柱后，藻蓝蛋白进一步纯化，其A620=1.379，A280=0.528，A620/A280=2.612。
参考文献
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[4] 胡一兵,胡鸿钧,李夜光,耿亚红.从一种富含藻胆蛋白的螺旋藻中大量提取和纯化藻蓝
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