藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)
盐析法分离藻蓝蛋白的研究
35% 40%
45%
2.4
纯度(A620/A280)
2.3
2.2
2.1
2.0 5
10
15
硫酸铵饱和度/%
图 5 四步盐析 PC 纯度
70
45%
65
50% 55%
60%
60
回收率/%
55
50
45
40 5
10
15
硫酸铵饱和度/%
图 6 四步盐析 PC 回收率
3.8
33%
3.6
35% 27%
3.4
纯度(A620/A280)
3.2 盐析 在 藻 蓝 蛋 白 盐 析 过 程 中 ， 文 献 大 多 采 用 25%
硫酸铵去杂，50%硫酸铵沉淀PC。这种分离只是 用于其他纯化方法前的预处理，不能分离出高纯 度的PC。本实验采用多次分段盐析，虽回收率仅 有9.66%，但PC纯度高达3.92，考虑到盐析操作简 单，硫酸铵价格便宜，本实验还是具有很大的应
收稿日期： 2009-08-04 基金项目： 唐山市自然科学基金(04204501C-18)。 作者简介： 王巍杰(1967—)，女，硕士，副教授，主要从事药物和功能性食品的研究工作。
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2010 年 第 35 卷 第 5 期
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
提取物与应用
式中：A280，A620 分别代表波长在280 nm，620 nm处的吸光度。 o和t分别代表冷冻-融化后藻蓝蛋白粗 体液和经过盐析沉淀得到的藻蓝蛋白上 清液。
硫酸铵达到所需饱和度需加入的固体硫酸铵 为：X=G(S2-S1)/(1-AS2)
式中：X 表示将1 L 硫 酸 铵 饱 和 度 为 S1的 溶 液 提 高 到 S2时 所 需 加 入 的 固 体 硫 酸 铵 g 数； S1 表示原溶液中硫酸铵的饱和度； S2 表示加入固体硫酸铵后所需达到的 饱和度； G和A为常数，与温度有关，数值参照 严寒等[10]研究的“硫酸铵盐析公式参数 的校正”。
螺旋藻中藻蓝蛋白提取的工艺流程
螺旋藻中藻蓝蛋白提取的工艺流程王艺生物技术二班20100404071、预处理将螺旋藻洗净晾干2、细胞破碎利用超声波破碎发破碎细胞，藻胆蛋白属于胞内蛋白质，要提取分离藻胆蛋。
首先必须要破坏藻类细胞的细胞壁、细胞膜，使藻胆蛋白以溶解的状态释放出来，并保持其活性。
超声波细胞粉碎仪破碎鱼腥藻细胞的最佳处理条件是超声仪的功率为600 W，超声时间为9min，固液比为1：8，破壁容量为20 mL。
也可与其他方法合用最大限度的破碎细胞。
3、提取（初步分离）（1）用超滤膜过滤藻胆蛋白提取液，获得藻胆蛋白粗制品。
用NaNO3，高渗一超滤法分离提纯藻胆蛋白，超滤时选用聚砜膜，在超滤过程中，无机盐和小分子蛋白质，包括小分子的藻毒素透过滤膜而去掉，特别适用于易产生水华的微囊藻脱毒，提高产品的安全性。
NaNO3高渗．超滤法是提取藻胆蛋白的简单易行的方法，用此法提取的藻胆蛋白是安全无毒的，且易于纯化，脱水方便，产品易于干燥。
（2）也可利用沉淀法将大量盐加到蛋白质溶液中，蛋白质胶粒凝结并沉淀析出，因此向细胞破碎液中加入盐溶液使蛋白质沉淀析出。
用25％硫酸铵可将藻红蛋白沉淀出，用30％硫酸铵可将藻蓝蛋白沉淀出，再用50％硫酸铵可将蓝藻蛋白沉淀出。
4、精制（高度纯化）离子交换层析法，用 DEAE一步纯化藻蓝蛋白；改变传统以离子强度作梯度洗脱的方法，根据藻红蛋白的等电点进行pH梯度洗脱，仅用DEAE一步层析，就将藻红蛋白纯度从1.042提高至5.6，回收率达67.33％。
用硅藻土545柱分级洗脱，再用该法纯化，从螺旋藻中获得初度为4.1的藻蓝蛋白和纯度为4.6的别藻蓝蛋白；将提取液上DE。
AE一52纤维素柱，提取纯度只有1.9，在上葡聚糖凝胶柱，则得到了纯度较高的蓝藻蛋白。
5、成品制作随着藻蓝蛋白制品的应用范围的不断扩大，对提取分离工艺的要求也逐渐提高。
不仅要有高的提取率、好的产品质量，而且要考虑省时、省力、自动化程度高。
利用缓慢冷却加晶种的方法使藻蓝蛋白结晶，干燥后进行保存。
藻红蛋白的分离纯化及多肽组成分析
盐析时一般选择溶解度足够大的中性盐，如硫酸铵、氯化钠、硫酸钾。但硫 酸铵有独特的优点：溶解度大、对温度不敏感；25度饱和溶解度769g/L，4.1 mol/L， 0度时饱和溶解度679 g/L，3.9 mol/L。而且分级效果好，有稳定蛋白质结构的作 用。所以通常多用硫酸铵做蛋白盐析沉淀。
2、蛋白质的离子交换柱层析纯化
1）离子交剂的预处理和再生 本实验用DEAE－52阴离子交换纤维素进行藻胆蛋白的纯化。DEAE－52阴 离子交换剂在使用前一般需用0.5 mol/L的HCl和NaOH预处理。具体做法是：先 用0.5mol/L的HCl浸泡DEAE－52纤维素30－40分钟，抽虑除去HCl并水冲洗至近 中性；再用0.5 mol/L NaOH浸泡DEAE－52纤维素30－40分钟，抽虑除去NaOH； 最后用0.5 mol/L HCl中和NaOH的碱性，抽虑后用水冲洗至近中性。至此，DEAE －52阴离子交换纤维素预处理完成，可用于装柱。用过的DEAE－52阴离子交换 纤维需经过再生处理后才可以使用。再生处理可先用高浓度NaCl (1－2 mol/L)过 柱冲洗柱床，以除去DEAE－52阴离子交换纤维所吸附的成份。然后，再用0.5 mol/L的HCl和NaOH处理，处理方法与预处理完全相同。 2）装柱 取经过预处理或再生的DEAE－52纤维素约16－20ml，用1.6 20 cm 的层析 柱装柱，柱床体积约为1.6 8-10 cm。用50 mmol/L的NaH2PO4－K2HPO4pH 7.0 缓冲液(内含NaN34 mmol/L，EDTA-Na 2 mmol/L)过柱平衡柱床，流速～20－30 ml/ hr，直到层 析柱流出液 的pH等于磷酸缓 冲液的p H。至此 ，DE AE－52 纤维素 柱可以上样进行离子交换层析。
蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定
实验一、蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定第一部分蛋白质的表达、分离、纯化1、目的要求（1）了解克隆基因表达的方法和意义。
（2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。
2、实验原理克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。
通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。
大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。
本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。
蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
3、试剂和器材一、试剂[1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL.[2] 氨苄青霉素：100mg/mL[3] 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0[4] Washing Buffer：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3[5] Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0[6] IPTG二、器材摇床，离心机，层析柱（1′10 cm）4、操作方法一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中（含100ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定(共14张PPT)
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
藻蓝蛋白浓度测定
藻蓝蛋白浓度测定
一、目的
1、掌握藻蓝蛋白测定方法。
2、掌握分光光度法测定藻蓝蛋白的操作技术。
二、原理
采用紫外－可见吸收光谱法测定藻蓝蛋白的浓度，螺旋藻中藻蓝蛋白吸收光谱的差异作为其测定标准，藻蓝蛋白在620nｍ处有最大吸收值，其含量测定参照Ｂennett的研究按照下式进行计算藻蓝蛋白含量。
式中：Ｃpc为样品溶液中藻蓝蛋白的浓度，ｍg／mL；
Ａ620为样品溶液在波长620nm下的吸光值；
Ａ652为样品溶液在波长652nm下的吸光值。
三、实验器材及试剂
1、实验仪器及工具：紫外可见光分光光度计、酸度计、漏斗、三角瓶、烧杯、
移液枪等。
2、实验原料及试剂
超净水、稀硫酸、稀碱等。
四、实验方法及步骤
1、分光光度计预热：打开分光光度计电源，预热半个小时。
2、藻蓝蛋白溶液制备：用漏斗过滤实验5破壁的螺旋藻溶液20毫升左右，去除细胞碎片的上清液就是藻蓝蛋白提取液。
3、分光光度计调零：用和提取体系相同pH的去离子水作为空白，分别调整620、652nm的吸光值为零。
4、藻蓝蛋白浓度测定：将上述藻蓝蛋白样品分别在调零后测定A620和A652的值，每个样品测定三次记录数值，算出平均值。
5、藻蓝蛋白浓度计算：按照上述公式计算出藻蓝蛋白溶液的藻蓝蛋白浓度，根据藻蓝蛋白浓度和体积判定提取效果。
五、实验结果记录
记录提取样品的A620和A652，计算出不同条件下提取的藻蓝蛋白浓度，确定所研究影响因素的最适水平。
六、实验结果分析
根据提取液藻蓝蛋白浓度分析所研究影响因素对提取率的影响规律。
藻蓝蛋白毕业设计
藻蓝蛋白毕业设计藻蓝蛋白毕业设计毕业设计是大学生活中的重要一环，它不仅是对所学知识的综合运用，也是对自己专业能力的一次检验。
对于生物科学专业的学生来说，选择一个有意义且有挑战性的毕业设计课题是至关重要的。
在我即将毕业的时候，我选择了藻蓝蛋白作为我的毕业设计课题。
藻蓝蛋白是一种在藻类中广泛存在的蛋白质，具有丰富的营养价值和广泛的应用前景。
它不仅可以作为食品添加剂，提高食品的营养价值，还可以应用于生物医学领域，如药物载体、抗氧化剂等。
因此，研究藻蓝蛋白的生产和应用具有重要的意义。
在我的毕业设计中，我主要关注藻蓝蛋白的生产和提取。
首先，我通过实验室培养藻类细胞，寻找高产藻蓝蛋白的菌株。
通过对菌株的筛选和培养条件的优化，我成功地获得了高产藻蓝蛋白的藻类细胞。
接下来，我研究了藻蓝蛋白的提取方法。
传统的藻蓝蛋白提取方法通常需要使用有机溶剂，对环境造成一定的污染。
因此，我尝试了一种新的提取方法，即超声波辅助提取。
通过超声波的作用，可以快速破裂藻类细胞，释放出藻蓝蛋白。
我通过对超声波参数的优化，成功地提取了高纯度的藻蓝蛋白。
除了生产和提取，我还对藻蓝蛋白的应用进行了研究。
我发现藻蓝蛋白具有很好的抗氧化活性，可以有效清除自由基，减轻氧化应激对细胞的损伤。
因此，我将藻蓝蛋白应用于细胞培养中，观察其对细胞的保护作用。
实验结果表明，藻蓝蛋白可以显著改善细胞的存活率和增强细胞的抗氧化能力。
此外，我还探索了藻蓝蛋白在药物载体方面的应用。
藻蓝蛋白具有良好的稳定性和可溶性，可以作为药物的载体，提高药物的生物利用度和靶向性。
我将一种常用的抗癌药物与藻蓝蛋白结合，制备了一种新型的药物载体。
通过体外药物释放实验，我发现藻蓝蛋白载体可以延缓药物的释放速度，提高药物的稳定性。
通过这次毕业设计，我不仅深入了解了藻蓝蛋白的生产和应用，还锻炼了自己的实验技能和科研能力。
在实验过程中，我遇到了很多困难和挑战，但通过不断的努力和思考，我最终克服了这些困难，取得了令人满意的结果。
蛋白质的分离纯化实验报告
蛋白质的分离纯化实验报告一、实验目的1、掌握蛋白质分离纯化的基本原理和方法。
2、学会运用不同的技术手段对蛋白质进行提取、分离和纯化。
3、熟悉蛋白质纯度鉴定的常用方法。
二、实验原理蛋白质是生物体中重要的大分子化合物，其分离纯化是研究蛋白质结构和功能的重要前提。
蛋白质的分离纯化主要依据其物理化学性质的差异，如分子大小、电荷、溶解度、亲和力等。
常见的分离纯化方法包括：1、盐析法：通过向蛋白质溶液中加入中性盐，如硫酸铵，使蛋白质溶解度降低而沉淀析出。
2、凝胶过滤层析：利用凝胶颗粒的多孔网状结构，根据蛋白质分子大小进行分离。
3、离子交换层析：基于蛋白质所带电荷的不同，在离子交换树脂上进行吸附和解吸。
4、亲和层析：利用蛋白质与特定配体之间的特异性亲和力进行分离。
三、实验材料与设备1、材料新鲜的动物组织（如肝脏）各种试剂，包括硫酸铵、磷酸盐缓冲液、离子交换树脂、亲和配体等。
2、设备离心机层析柱紫外分光光度计电泳仪四、实验步骤1、蛋白质的提取将新鲜的动物组织剪碎，加入适量的磷酸盐缓冲液，在冰浴中匀浆。
低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集上清液，即为粗提的蛋白质溶液。
2、盐析沉淀在上清液中缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，使其饱和度逐渐增加到 50%。
搅拌 30 min 后，低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集沉淀。
3、凝胶过滤层析装柱：将凝胶颗粒填充到层析柱中，用缓冲液平衡柱子。
上样：将盐析沉淀溶解后，缓慢上样到层析柱中。
洗脱：用缓冲液进行洗脱，收集不同洗脱峰的流出液。
4、离子交换层析装柱：将离子交换树脂填充到层析柱中，用起始缓冲液平衡柱子。
上样：将凝胶过滤层析收集的样品上样到离子交换层析柱中。
洗脱：采用梯度洗脱的方法，逐渐改变缓冲液的离子强度，收集洗脱峰。
5、亲和层析装柱：将亲和配体偶联到层析介质上，填充到层析柱中，用平衡缓冲液平衡柱子。
上样：将离子交换层析收集的样品上样到亲和层析柱中。
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藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)藻蓝蛋白(phycocyanin , PC)是一种存在于蓝藻细胞内的光合色素 ,能高效捕获光能。
其分子质量在 40 ku 左右 ,由α、β两个亚基组成 ,亚基分子质量都在 20 ku 左右。
肽链上共价结合 1 个开链的四吡咯环辅基 ,类似动物红细胞的血红素结构。
天然存在的藻蓝蛋白通常以六聚体(αβ) 6的形式存在。
与之相近的别藻蓝蛋白(Anthocyanin ,APC)为三聚体( αβ) 3 ,在 650 nm 处有最大吸收峰。
分离纯化的水溶藻蓝蛋白在溶液中呈蓝色 ,并发出紫色荧光 ,在波长620 nm 具有特异吸收峰 ,可用吸光度 A 620 / A 280表示其纯度。
因其水溶性、无毒、清亮且着色力强等优点 ,藻蓝蛋白被广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。
藻蓝蛋白带有荧光 ,可用作荧光标记物。
一、教学目的通过藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子制备方案设计与实践研究，体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法。
整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64-80学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的动手机会。
有利于培养学生的学习兴趣。
二、实验方案1材料与方法1. 1 实验材料钝顶螺旋藻粉产自中国科学院武汉植物所 ,其他无机盐和酸碱试剂均为国产分析纯试剂。
1. 2 分析方法1.2.1藻蓝蛋白浓度的测定方法一：【曲文娟等，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术，食品科学，2007年5期，135-138】用紫外分光光度计对粗提的藻蓝蛋白溶液进行全波段扫描, 可见藻蓝蛋白的特征吸收在620nm, 异藻蓝蛋白的特征吸收在:方法二：【刘杨等，水提分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稳定性研究，天津师范大学学报(自然科学版)，Vol.28 No.3.11-14（2008）】 螺旋藻中以藻胆蛋白吸收光谱的差异作为其测定标准。
藻蓝蛋白( PC)在 620 nm 处有最大光吸收,其含量测定参考王广策等人的相关研究方法:6201425.0A c PC = (1’)【王广策, 周百成, 曾呈奎. 钝顶螺旋藻 c-藻蓝蛋白和多管藻R-藻红蛋白的分离及其摩尔消光系数的测定[J ].海洋科学1996 , 20 (1) : 52255.】1.2.2藻蓝蛋白的纯度测定【刘杨等，水提分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稳定性研究，天津师范大学学报(自然科学版)，Vol.28 No.3.11-14（2008）】最大光吸收在650 nm ,式(1) - (2)PC APC 620和 A 650分别代表波长在 620 和 650 nm 处的吸光度。
【Kaplan D , Calvert H E , Peters G A. The azolla-anabaena azollae relationship. Ⅻ: Nit rogenase activity and phycobiliproteins of the endophyte as a function of leaf age and cell type[J ] . Plant Physiol , 1986 , 80 (4) : 8842890.】1.2.3 藻蓝蛋白提取得率的计算 【曲文娟等，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术，食品科学，2007年5期，135-138】 藻蓝蛋白提取得率(T)为提取液中藻蓝蛋白的重量与原料重量的比值。
按公式(2)计算:10034.5)474.0(650620⨯-=A A nV T (3) 式中: n ——样品稀释倍数;V ——提取液总体积, mL;G ——原料质量, mg 。
1.2.4 总蛋白质测定方法一：采用考马斯亮蓝法【李冰等，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白提取纯化新工艺，海洋科学，2007 年，第31 卷，第8 期，48-52】取洁净干燥的试管分成两组按表1进行操作。
标准蛋白质溶液质量浓度为500 mg/ L。
以1-6号管标准蛋白质质量浓度(g/ L)为横坐标, 1-6号管A595 nm值为纵坐标作图,即得标准曲线。
未知浓度的 1∶100倍稀释后按照7-样和8-样操作测定,根据 A595值推算出浓度大小。
1. 3 藻蓝蛋白的提取分离1. 3. 1 螺旋藻细胞的破碎和藻蓝蛋白粗提液的制备螺旋藻细胞悬浮液：准确称取 1.0～2.0 g 螺旋藻粉 ,加入 200 mL 的pH = 7. 0、 0. 01 mol/ L 的磷酸缓冲液, 4 ℃分别浸泡 24h备用。
细胞破碎：（选择冻融法或超声波法）方法一（冻融法）：取上述螺旋藻悬浮液在-20℃和30℃反复冻融(3次)使藻体细胞破碎,在显微镜下观察计数细胞破碎率在 90 %以上即可。
方法二（超声波法）：取上述螺旋藻悬浮液进行超声波破碎，破碎条件：功率500W，能量80%，室温，开3秒停2秒，破碎时间2～X分钟（5分钟）,在显微镜下观察计数细胞破碎率在 90 %以上即可。
离心分离：将破碎的螺旋藻细胞悬浊液于 8000 r/ min 离心 15 min ,收集上清液可得到含藻蛋白的粗提液。
在 568、620和650 nm处测粗提液的吸光度,计算藻蓝蛋白的含量。
1. 3. 2 沉淀分离藻蓝蛋白1.3.2.1盐析法沉淀藻蓝蛋白（1）藻蓝蛋白盐析曲线的制作（需要藻蓝蛋白粗提液40～50 ml，选做）a.取6支干净试管编号1～6，分别加入粗提液5 ml；b.分别向1～4号试管中加入饱和硫酸铵2 ml、3 ml、4 ml、5 ml，然后再分别加入蒸馏水3 ml、2 ml 、1 ml、0 ml；向5号、6号试管中分别先加入固体硫酸铵0.66g和1.37g，再加饱和硫酸铵5 ml，充分摇晃溶解完全后，硫酸铵饱和度分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%，每管各取5ml×2混匀的溶液装入7ml×2离心管中，对应编号1-1’～6-6’，室温（或0℃）静置4h以上，对称放入离心机中，10 000 r/min ，离心10min，弃去上清液，收集沉淀。
c.向收集的沉淀加入5 ml 0.1 mol/L（pH7.0）磷酸缓冲溶液溶解沉淀物；d.测定各管中总蛋白质的浓度、藻蓝蛋白浓度和纯度。
e.以硫酸铵饱和度为横坐标，总蛋白质浓度和藻蓝蛋白的含量为纵坐标作图，得到蛋白质盐析曲线和藻蓝蛋白盐析曲线。
（2）藻蓝蛋白盐析沉淀分离在装有固定体积藻蓝蛋白粗提液的烧杯中加入一定量的(NH4)2SO4溶液 ,边加边搅拌 ,以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性 ,最终(NH4)2SO4溶液的质量浓度分别为50%,室温（或0℃）静置4h以上，使藻蓝蛋白盐析沉淀,再于冷冻（- 4℃）离心机中以10 000 r/ min离心20 min ,将离心得到的沉淀用 1/ 4 上清液体积的0.1 mol/L(pH=7. 0)磷酸缓冲液溶解,并倾倒于透析袋中 ,再置于去离子水中透析 24 h (每隔4 h 更换一次去离子水) ; 透析结束后 ,再于冷冻（- 4℃）离心机中，以10 000 r/ min离心 20 min ;收集上清液，在280、620 和650 nm下测吸光度 ,计算藻蓝蛋白的含量。
1. 3.2.2 等电点法沉淀藻蓝蛋白（选做）在装有固定体积藻蛋白粗提液的烧杯中加入0.1 mol/ L稀H2SO4溶液 ,边加边搅拌 ,以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性 ,将藻蛋白粗提液 pH调节为4.0,即藻蓝蛋白的等电点附近 ,静置过夜 ,于冷冻（- 4℃）离心机中，以10 000 r/ min 离心20 min ;将离心得到的沉淀用 1/ 4 上清液体积的0.1 mol/L(pH=7.0)磷酸缓冲液充分溶解 ,再于冷冻（- 4℃）高速离心机中以10 000 r/ min离心20 min ;取上清液,在 280、620和650 nm下测吸光度 ,计算藻蓝蛋白的含量。
1. 3. 4 Sephadex G-200色谱纯化选用φ15×600～800mm Sephadex G-200色谱柱，加样量为 3～5mL （约含蛋白60～100mg ）用 20mmol/L （pH 为7.0 ）的磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱速度可控制为 0.5mL/min 即10min/管，可用 A280 的紫外线进行检测。
如果测得的数值很高，说明蛋白含量过高，需要稀释后测量，测量方法如下：每管取 0.5mL 稀释 10 倍后用紫外线测量的结果。
以A280测量值为纵坐标，收集管号为横坐标绘制洗脱曲线，收集藻蓝蛋白洗脱峰，取适当浓缩后进行蛋白质纯度的鉴定。
剩余部分测量体积，置于冻干管中冷冻干燥（纯品藻蓝蛋白）。
【取5mL 藻蓝蛋白收集液留作藻蓝蛋白含量测定和纯度分析】1. 3. 5藻蓝蛋白的收率和分离因数分别计算藻蓝蛋白的收率( Y) 、 浓缩率( m)和分离因数(β ) :N PC Y t /][= (4)][][PC PC m t = (5)00]/[][]/[][]/[][PE PE ACP ACP PC PC t t t +=β (6) 式(4) - (6)中 , N ( g/ L)为藻液比, 0 和 t 分别代表冷冻-融化后藻蛋白粗提液和经过盐析法沉淀或等电点法沉淀最终得到的藻蓝蛋白上清液。
1.4 藻蓝蛋白的稳定性试验1.4.1 温度稳定性试验将 1. 3. 2 中富集分离得到的藻蓝蛋白上清液分别置于 20、 30、 40 和 50 ℃的水浴中 ,开始计时并每隔0. 5 h 测量上清液在 568、 620 和 650 nm 处的吸光度 ,再采用 1. 2 中的分析方法测量藻蓝蛋白的浓度 ,以考察藻蓝蛋白对温度的稳定性。
1.4.2酸碱稳定性试验将 1. 3. 2 中富集分离得到的藻蓝蛋白上清液用0. 1 mol/ L 稀 H 2SO 4 溶液调节pH 为 3. 0、 5. 0、8. 0和 9. 0 ,置于 20℃ 的水浴中 ,开始计时并每隔0. 5 h 测量上清液在568、 620 和650 nm 处的吸光度 ,再采用 1. 2 中的分析方法测量藻蓝蛋白的浓度 ,以考察藻蓝蛋白对酸碱的稳定性。
1.5 PC 纯度分析1.5.1测定各级分离提纯程序1.5.12.结果与讨论1、蛋白质标准曲线；2、藻蓝蛋白盐析曲线；3、藻蓝蛋白Sephadex G-200柱层析图谱45集分离的影响；8、藻蓝蛋白对温度的稳定性；9、藻蓝蛋白的酸碱稳定性 3 结论研究表明: 1、2、3、4、… … … … ……参考文献:。