[精品]藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案).doc
螺旋藻中藻蓝蛋白提取的工艺流程
螺旋藻中藻蓝蛋白提取的工艺流程王艺生物技术二班20100404071、预处理将螺旋藻洗净晾干2、细胞破碎利用超声波破碎发破碎细胞，藻胆蛋白属于胞内蛋白质，要提取分离藻胆蛋。
首先必须要破坏藻类细胞的细胞壁、细胞膜，使藻胆蛋白以溶解的状态释放出来，并保持其活性。
超声波细胞粉碎仪破碎鱼腥藻细胞的最佳处理条件是超声仪的功率为600 W，超声时间为9min，固液比为1：8，破壁容量为20 mL。
也可与其他方法合用最大限度的破碎细胞。
3、提取（初步分离）（1）用超滤膜过滤藻胆蛋白提取液，获得藻胆蛋白粗制品。
用NaNO3，高渗一超滤法分离提纯藻胆蛋白，超滤时选用聚砜膜，在超滤过程中，无机盐和小分子蛋白质，包括小分子的藻毒素透过滤膜而去掉，特别适用于易产生水华的微囊藻脱毒，提高产品的安全性。
NaNO3高渗．超滤法是提取藻胆蛋白的简单易行的方法，用此法提取的藻胆蛋白是安全无毒的，且易于纯化，脱水方便，产品易于干燥。
（2）也可利用沉淀法将大量盐加到蛋白质溶液中，蛋白质胶粒凝结并沉淀析出，因此向细胞破碎液中加入盐溶液使蛋白质沉淀析出。
用25％硫酸铵可将藻红蛋白沉淀出，用30％硫酸铵可将藻蓝蛋白沉淀出，再用50％硫酸铵可将蓝藻蛋白沉淀出。
4、精制（高度纯化）离子交换层析法，用 DEAE一步纯化藻蓝蛋白；改变传统以离子强度作梯度洗脱的方法，根据藻红蛋白的等电点进行pH梯度洗脱，仅用DEAE一步层析，就将藻红蛋白纯度从1.042提高至5.6，回收率达67.33％。
用硅藻土545柱分级洗脱，再用该法纯化，从螺旋藻中获得初度为4.1的藻蓝蛋白和纯度为4.6的别藻蓝蛋白；将提取液上DE。
AE一52纤维素柱，提取纯度只有1.9，在上葡聚糖凝胶柱，则得到了纯度较高的蓝藻蛋白。
5、成品制作随着藻蓝蛋白制品的应用范围的不断扩大，对提取分离工艺的要求也逐渐提高。
不仅要有高的提取率、好的产品质量，而且要考虑省时、省力、自动化程度高。
利用缓慢冷却加晶种的方法使藻蓝蛋白结晶，干燥后进行保存。
藻蓝蛋白生产工艺
藻蓝蛋白生产工艺藻蓝蛋白是一种天然的蓝色色素，广泛用于食品、药品和化妆品等领域。
藻蓝蛋白的生产工艺一般包括培养和提取两个步骤。
首先是藻类培养。
选择一种高产藻类作为目标菌株，常用的有蓝细菌和蓝藻等。
蓝藻是一种常见的藻类，具有高产蓝色素的特点。
蓝藻可以在光合作用下自主合成藻蓝蛋白，因此只需提供充足的光照和适宜的培养基即可。
蓝藻的培养一般采用液体培养法或固体培养法。
液体培养法是将蓝藻菌种接种到含有适宜营养物的培养液中，利用搅拌或充气等方法提供充足的氧气和养分，以促进菌株的生长和藻蓝蛋白的合成。
固体培养法是将蓝藻菌种接种到含有固体基质的培养皿或柱中，通过调节温度和湿度等因素，为蓝藻的生长提供适宜的环境条件。
在培养过程中，需要控制培养液的温度、光照强度和光周期等参数，以及添加适当的营养物，如碳源、氮源和矿物盐等。
此外，还要注意防止外源污染和细胞自身的寄生菌感染等问题。
培养达到一定程度后，即可进行藻蓝蛋白的提取。
提取工艺一般包括细胞破碎、离心和过滤等步骤。
首先将培养液中的藻藻菌株离心下沉，然后通过破碎细胞壁的方法将细胞内的藻蓝蛋白释放出来。
常用的破碎方法包括超声波破碎和高压破碎等。
接下来，通过离心和过滤等步骤将藻蓝蛋白与细胞碎片、杂质等分离，得到相对纯净的藻蓝蛋白溶液。
最后，对提取得到的藻蓝蛋白溶液进行精制和纯化。
常用的精制方法包括吸附、离子交换和凝胶过滤等。
通过这些方法，可以去除藻蓝蛋白中的杂质和不纯物质，提高藻蓝蛋白的纯度和质量。
总之，藻蓝蛋白的生产工艺包括培养和提取两个步骤。
培养过程中需要控制好培养液的环境参数和添加适宜的营养物，提取过程中需要采用破碎、离心和过滤等方法将藻蓝蛋白与细胞碎片等分离，最后通过精制和纯化等步骤提高藻蓝蛋白的纯度和质量。
藻蓝蛋白浓度测定
藻蓝蛋白浓度测定
一、目的
1、掌握藻蓝蛋白测定方法。
2、掌握分光光度法测定藻蓝蛋白的操作技术。
二、原理
采用紫外－可见吸收光谱法测定藻蓝蛋白的浓度，螺旋藻中藻蓝蛋白吸收光谱的差异作为其测定标准，藻蓝蛋白在620nｍ处有最大吸收值，其含量测定参照Ｂennett的研究按照下式进行计算藻蓝蛋白含量。
式中：Ｃpc为样品溶液中藻蓝蛋白的浓度，ｍg／mL；
Ａ620为样品溶液在波长620nm下的吸光值；
Ａ652为样品溶液在波长652nm下的吸光值。
三、实验器材及试剂
1、实验仪器及工具：紫外可见光分光光度计、酸度计、漏斗、三角瓶、烧杯、
移液枪等。
2、实验原料及试剂
超净水、稀硫酸、稀碱等。
四、实验方法及步骤
1、分光光度计预热：打开分光光度计电源，预热半个小时。
2、藻蓝蛋白溶液制备：用漏斗过滤实验5破壁的螺旋藻溶液20毫升左右，去除细胞碎片的上清液就是藻蓝蛋白提取液。
3、分光光度计调零：用和提取体系相同pH的去离子水作为空白，分别调整620、652nm的吸光值为零。
4、藻蓝蛋白浓度测定：将上述藻蓝蛋白样品分别在调零后测定A620和A652的值，每个样品测定三次记录数值，算出平均值。
5、藻蓝蛋白浓度计算：按照上述公式计算出藻蓝蛋白溶液的藻蓝蛋白浓度，根据藻蓝蛋白浓度和体积判定提取效果。
五、实验结果记录
记录提取样品的A620和A652，计算出不同条件下提取的藻蓝蛋白浓度，确定所研究影响因素的最适水平。
六、实验结果分析
根据提取液藻蓝蛋白浓度分析所研究影响因素对提取率的影响规律。
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定(共14张PPT)
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
藻蓝蛋白的生产工艺流程
藻蓝蛋白的生产工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!藻蓝蛋白的生产工艺流程一、藻种培养阶段。
在进行藻蓝蛋白的生产之前，藻种培养是关键的第一步。
藻蓝蛋白浓度测定
藻蓝蛋白浓度测定
一、目的
1、掌握藻蓝蛋白测定方法。
2、掌握分光光度法测定藻蓝蛋白的操作技术。
二、原理
采用紫外－可见吸收光谱法测定藻蓝蛋白的浓度，螺旋藻中藻蓝蛋白吸收光谱的差异作为其测定标准，藻蓝蛋白在620nｍ处有最大吸收值，其含量测定参照Ｂennett的研究按照下式进行计算藻蓝蛋白含量。
式中：Ｃpc为样品溶液中藻蓝蛋白的浓度，ｍg／mL；
Ａ620为样品溶液在波长620nm下的吸光值；
Ａ652为样品溶液在波长652nm下的吸光值。
三、实验器材及试剂
1、实验仪器及工具：紫外可见光分光光度计、酸度计、漏斗、三角瓶、烧杯、
移液枪等。
2、实验原料及试剂
超净水、稀硫酸、稀碱等。
四、实验方法及步骤
1、分光光度计预热：打开分光光度计电源，预热半个小时。
2、藻蓝蛋白溶液制备：用漏斗过滤实验5破壁的螺旋藻溶液20毫升左右，去除细胞碎片的上清液就是藻蓝蛋白提取液。
3、分光光度计调零：用和提取体系相同pH的去离子水作为空白，分别调整620、652nm的吸光值为零。
4、藻蓝蛋白浓度测定：将上述藻蓝蛋白样品分别在调零后测定A620和A652的值，每个样品测定三次记录数值，算出平均值。
5、藻蓝蛋白浓度计算：按照上述公式计算出藻蓝蛋白溶液的藻蓝蛋白浓度，根据藻蓝蛋白浓度和体积判定提取效果。
五、实验结果记录
记录提取样品的A620和A652，计算出不同条件下提取的藻蓝蛋白浓度，确定所研究影响因素的最适水平。
六、实验结果分析
根据提取液藻蓝蛋白浓度分析所研究影响因素对提取率的影响规律。
藻胆蛋白的分离纯化
R-藻红蛋白的分离纯化
R-藻红蛋白
R-藻红蛋白是一种从藻类中提取的天然安全无毒的色素蛋白 质，是一种重要的生理活性物质，具有抗氧化，提高免疫力能 力，抗肿瘤及抗炎症等作用 R-藻红蛋白在食品 、化妆品乃至医药诊断，生物工程上的开 发和利用不断向广度和深度发展，尤其在光动力学治疗，新型 荧光探针，防治癌症 、溃疡和血栓等疾病的保健品和药品方面 的贡献尤为显著 最新研究还发现藻红蛋白在光学信息存储与处理，快速光电 探测 、人工神经网络等方面也具有潜在的应用前景
双水相萃取法
坛紫菜经细胞破碎后得到藻红蛋白粗提液 在粗提液中加PEG 和硫酸铵盐后混合均匀，静置直至体 系平衡分离成单独的相（此时目标蛋白分配到上相（ PEG 相），而细胞碎片、 核酸、 多糖和杂蛋白等分配到下相 （富盐相），除去下相） 第二步萃取是在上相中加入组成相同的盐，形成新的双 水相体系，使目标蛋白质转入富盐相，从而将蛋白质与 PEG 分离，以便目的产物的进一步加工处理以及 PEG的回 收利用
R-藻红蛋白的分离纯化
细胞破碎提取 R-藻红蛋白的提取方法主要有反复冻融法、液氮研磨法、细 胞溶胀法、低浓度 CaCl2提取法、SDS 溶液提取法、纤维素酶 提取法和超声波破碎法等
根据提取纯度大小来衡量
反复冻融法＞低浓度 CaCl2提取法＞超声波破碎法＞SDS 提取
法＞液氮研磨法＞细胞溶胀法＞纤维素酶提取法
RHale Waihona Puke 藻红蛋白的分离传统分离纯化： 多先经过硫酸铵盐析粗提藻胆蛋白 再经过一系列的层析柱组合纯化藻胆蛋白 目前分离纯化：
一步层析法 、利凡诺法 、双水相萃取法等分离纯化技术
双水相萃取法的优点
在低温或室温下进行分离纯化，保持了生物物质的生物活 性 分相时间短，由于表面张力小 ，所以搅拌过程需要输入 的能量很小，萃取可在很短的时间（ 5 min ~1 5 min） 内达到平衡； 易于连续化操作，并且可将萃取规模放大 对于目标藻胆蛋白不仅具有很高的提取率（9 0 %左右， 最大可达 9 7 .4 %），而且还可获得较高的纯度，基本 可达分析级（ 4 .0） 其设备投资费用少，操作简单，不存在有机溶剂残留问题
蛋白质的分离纯化实验报告
蛋白质的分离纯化实验报告一、实验目的1、掌握蛋白质分离纯化的基本原理和方法。
2、学会运用不同的技术手段对蛋白质进行提取、分离和纯化。
3、熟悉蛋白质纯度鉴定的常用方法。
二、实验原理蛋白质是生物体中重要的大分子化合物，其分离纯化是研究蛋白质结构和功能的重要前提。
蛋白质的分离纯化主要依据其物理化学性质的差异，如分子大小、电荷、溶解度、亲和力等。
常见的分离纯化方法包括：1、盐析法：通过向蛋白质溶液中加入中性盐，如硫酸铵，使蛋白质溶解度降低而沉淀析出。
2、凝胶过滤层析：利用凝胶颗粒的多孔网状结构，根据蛋白质分子大小进行分离。
3、离子交换层析：基于蛋白质所带电荷的不同，在离子交换树脂上进行吸附和解吸。
4、亲和层析：利用蛋白质与特定配体之间的特异性亲和力进行分离。
三、实验材料与设备1、材料新鲜的动物组织（如肝脏）各种试剂，包括硫酸铵、磷酸盐缓冲液、离子交换树脂、亲和配体等。
2、设备离心机层析柱紫外分光光度计电泳仪四、实验步骤1、蛋白质的提取将新鲜的动物组织剪碎，加入适量的磷酸盐缓冲液，在冰浴中匀浆。
低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集上清液，即为粗提的蛋白质溶液。
2、盐析沉淀在上清液中缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，使其饱和度逐渐增加到 50%。
搅拌 30 min 后，低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集沉淀。
3、凝胶过滤层析装柱：将凝胶颗粒填充到层析柱中，用缓冲液平衡柱子。
上样：将盐析沉淀溶解后，缓慢上样到层析柱中。
洗脱：用缓冲液进行洗脱，收集不同洗脱峰的流出液。
4、离子交换层析装柱：将离子交换树脂填充到层析柱中，用起始缓冲液平衡柱子。
上样：将凝胶过滤层析收集的样品上样到离子交换层析柱中。
洗脱：采用梯度洗脱的方法，逐渐改变缓冲液的离子强度，收集洗脱峰。
5、亲和层析装柱：将亲和配体偶联到层析介质上，填充到层析柱中，用平衡缓冲液平衡柱子。
上样：将离子交换层析收集的样品上样到亲和层析柱中。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
c = (mg /mL) (1)
【曲文娟等,钝顶螺旋藻藻菠蛋白的脉冲超声辅助提取技术,食品科学,2007年5期，135-138】 5.34 式中：n——样品稀释倍数;V——提取液总体积，mL;G——原料质量，mg。
藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定（实验教案） 藻蓝蛋白（phycocyanin , PC）是一种存在于蓝藻细胞内的光合色素，能高效捕获光能。其分了质量 在40kii左右，由a、8两个亚基组成，亚基分了质量都在20 ku左右。肽链上共价结合1个开链的四 毗咯环辅基，
类似动物红细胞的血红素结构。天然存在的藻蓝蛋白通常以六聚体（a B） 6的形式存在。与 之相近的别藻蓝蛋B （Anthocyanin ,APC）为三聚体（a P） 3 ,在650 nm处有最大吸收峰。分离纯化的水 溶藻蓝蛋白在溶液中呈蓝
色，并发出紫色荧光，在波长620 nm具有特异吸收峰，可用吸光度AC20 / A280 表示其纯度。因其水溶性、无毒、清亮且着色力强等优点，藻蓝蛋白被广泛用于食品着色剂和化妆品的添 加剂。藻蓝蛋白带有荧光，可用作荧光标记物。
—、教学目的 通过藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子制备方案设计与实践研究，体验从 复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法。整个实验过程学生独立完 成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64-80学时），但每一•步单元操作的原理清晰， 技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的动手机会。有利于培养学生的学习兴趣。
二、实验方案 1材料与方法 1. 1实验材料 钝顶螺旋藻粉产自中国科学院武汉植物所，其他无机盐和酸碱试剂均为国产分析纯试剂。 1. 2分析方法
1.2.1藻蓝蛋白浓度的测定 方法一：【曲文娟等，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术，食品科学.2007年5期,135-138］
用紫外分光光度计对粗提的藻蓝蛋白溶液进行全波段扫描，可见藻蓝蛋白的特征吸收在620nm,异藻
蓝蛋白的特征吸收在650nm处。提取液中藻蓝蛋白浓度（C）按公式（1）计算:
方法二：【刘杨等，水提分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稳定性研究，天津师范大学学报（自然科学版）， Vol.28 No. 3. 11-14 （2008）］ 螺旋藻中以藻胆蛋白吸收光谱的差异作为其测定标准。藻蓝蛋白（PC）在620 nm处有最大光吸收，其 含量测定参考王广策等人的相关研究方法： Cpc= 0.1425&20 (1') 匚口策，周百成，曾呈仅 钝顶螺旋藻C-藻蓝蛋H和多管集R-藻红蛋闩的分离及其摩尔消光系数的测定［J ］.海洋科学1996 , 20 （1） : 52255.】［ 1.2.2藻蓝蛋白的纯度测定 【刘杨等，水提分离饨顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稽定性研究，天津师范大学学报（自然科学版）.Vol. 28 No. 3.
11-14 （2008）】
藻蓝蛋白的纯度为溶液在620和280 nm处吸光度的比值,而别藻蓝蛋白（APC）最大光吸收在650 nm , 其含
量的测定根据D.Kaplan|等采用的方法：
c - &50 - °.2°8&20 ⑵
心 一
5.09
式⑴-⑵中，CM和c此分别代表藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的质量浓度（g/ L） ,A例和A颇分别代表 波长在620和650 nm处的吸光度。 [K.iplan D , Calvert H E , Pei.、. G A. I !；u azol la-anabaona azol . :alien : Ml: \ 〔 rogenase activity and phycob i 1
i proto ins of the endophyte as a function of leaf age and cel 1 type[J ] . Plant Physiol , 1986 , 80 (4) : 8842890.]
1.2.3藻蓝蛋白提取得率的计算 藻蓝蛋白提取得率⑴为提取液中藻蓝蛋白的重量与原料重量的比值。按公式⑵计算: T = ■—（&20 -。・474&50）X |00 1-2.4总蛋白质测定 方法一：采用考马斯亮蓝法【李冰等，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白提取纯化新工艺，海洋科学，2007年，笫31卷，第8期，48-52] 取洁净干燥的试管分成两组按表1进行操作。标准苦白质溶液质量浓度为500 mg/ Lo 表1标准曲线制备（单位ul） 试剂与操作 1 2 3 4 5 6 7-样 8-样
标准蛋白质 0 50 100 150 200 250 一一一 一一一
分析样品 — — — — — — 250 500
蒸馅水 500 450 400 350 300 250 250 0 将表各管加3 mL考马斯亮蓝G -250，立即摇匀，置室温放置15 min，置于595 nm波长处比色。 以1-6号管标准蛋白质质量浓度（g/ L）为横坐标，1-6号管A595 nm值为纵坐标作图，即得标准曲线。未知 浓度的1 ： 100倍稀释后按照7-样和8-样操作测定，根据A595值推算出浓度大小。
1. 3藻蓝蛋白的提取分离 1. 3. 1螺旋藻细胞的破碎和藻蓝蛋白粗提液的制备 螺旋藻细胞悬浮液：准确称取1.0〜2.0 g螺旋藻粉，加入200 mL的pH = 7. 0、0. 01 mol/ L的 磷酸缓冲液，4 °C分别浸泡24h备用。 细胞破碎：（选择冻融法或超声波法） 方法一（冻融法）：取上述螺旋藻悬浮液在-2（rc和30笆反岌冻融（3次）使藻体细胞破碎，在显微镜下 观察计数细胞破碎率在90 %以上即可。 方法二（超声波法）：取上述螺旋藻悬浮液进行超声波破碎，破碎条件：功率500W,能量80%, 室温，开3秒停2秒，破碎时间2〜X分钟（5分钟），在显微镜下观察计数细胞破碎率在90 %以 上即可。 离心分离:将破碎的螺旋藻细胞悬浊液于8000 r/ min离心15 min，收集上清液可得到含藻蛋白的 粗提液。在
568、620和650 nm处测粗提液的吸光度，计算藻蓝蛋白的含量。
1. 3. 2沉淀分离藻蓝蛋白
1.3. 2.1盐析法沉淀藻蓝蛋白 （1） 藻蓝蛋白盐析曲线的制作（需要藻蓝蛋白粗提液40〜50 ml,―） a. 取6支干净试管编号1〜6,分别加入粗提液5 ml ； b. 分别向1~4号试管1"P加入饱和硫酸铉2ml、3ml、4 mix 5 ml,然后再分别加入蒸馅水3 ml、2nd、 1 ml、0 ml；向5号、6号试管中分别先加入固体硫酸馁0. 66g和1. 37g,再加饱和硫酸铉5 ml,充分摇 晃溶解完
全后,硫酸铉饱和度分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%,每管各取5mlX2混匀的溶液装入 7mlX2离心管中，对应编号1-1,〜6-6二室温（或0°C ）静置4h以上，对称放入离心机中，10 000 r/min , 离心lOmin,弃去上清
液，收集沉淀。 c. 向收集的沉淀加入5 ml 0. 1 mol/L （pH7. 0）磷酸缓冲溶液溶解沉淀物;
d. 测定芥管中总蛋白质的浓度、藻蓝蛋白浓度和纯度。
以硫酸铉饱和度为横坐标，总蛋白质浓度和藻蓝蛋白的含量为纵坐标作图，得到蛋白质盐析曲线和 藻蓝蛋白盐析曲线。 （2） 藻蓝蛋白盐析沉淀分离
在装有固定体积藻蓝蛋白粗提液的烧杯中加入一定量的（NH02SO.溶液，边加边搅拌，以防溶液局部 过浓使蛋白质发生变性，最终（NH旗SOi溶液的质量浓度分别为50%,室温（或0C）静置4h以上，使藻蓝 蛋白盐析沉淀，再于冷冻（-4C）离心机中以10 000 r/ min离心20 min，将离心得到的沉淀用1/ 4上 清液体积的0.1 mol/L（pII二7. 0）磷酸缓冲液溶解，并倾倒于透析袋中，再置于去离了水中透析24 h （每隔 4 h更换一次去离了
水）；透析结束后，再于冷冻（- 4°C）离心机中，以10 000 r/ min离心20 min ; 收集上清液，在280、620和650 nm下测吸光度，计算藻蓝蛋白的含量。 1. 3. 2.2等电点法沉淀藻蓝蛋白（选做）
在装有固定体积藻蛋白粗提液的烧杯中加入0.1 mol/ L稀相0[溶液，边加边搅拌，以防溶液局部过 浓使蛋白质发生变性，将藻蛋白粗提液pH调节为4.0,即藻蓝蛋白的等电点附近，静置过夜，于冷冻（- 4°C）离心机中，以10 000 r/min离心20min ;将离心得到的沉淀用1/4上清液体积的0. 1 mol/L（pH=7. 0）磷酸缓冲液充分溶解，再于冷冻（-4°C）高速离心机中以10 000 r/min离心20 min ;取上清液，在280、 620和650 nm下测吸光度，计算藻蓝蛋白的含量。'[ACP]t/[ACP]Q+[PE]（ /[PE]Q
式（4） - （6）中，N （ g/ L）为藻液比，0和t分别代表冷冻-融化后藻蛋白粗提液和经过盐析法沉淀或 等电点法沉淀最终得到的藻蓝蛋白上清液。 1.4藻蓝蛋白的稳定性试验
1.5.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳（见附件）
1. 3. 4 Sephadex G-200 色谱纯化 选用6 15X600〜800mm Sephadex G-200色谱柱，加样量为3〜5mL （约含蛋白60〜100mg）用20mmol/L （pll为7.0 ）的磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱速度可控制为0. 5mL/min即lOmin/管，可用A280的紫外 线进行
检测。 如果测得的数值很高，说明蛋白含量过高，需要稀释后测量，测量方法如下：每管取0. 5mL稀释10 倍后用紫外线测量的结果。 以A280测量值为纵坐标，收集管号为横坐标绘制洗脱曲线，收集藻蓝蛋白洗脱峰，取适当浓缩后进 行蛋白质纯度的鉴定。剩余部分测量体积，置于冻干管中冷冻干燥（纯品藻蓝蛋白）。 （取5mL藻蓝蛋白收集液留作藻蓝蛋白含量测定和纯度分析】 1. 3. 5藻蓝蛋白的收率和分离因数
分别计算藻蓝蛋白的收率（Y）、浓缩率（m）和分离因数（8 Y = [PC]f/N
〃「心 \PC lo
[PC]t/[PC]Q 1.4. 1温度稳定性试验
将1. 3. 2中富集分离得到的藻蓝蛋白上清液分别置于20、30、40和50 °C的水浴中，开始计 时并每隔0. 5 h测量上清液在568、620和650 nm处的吸光度，再采用1. 2中的分析方法测量藻蓝 蛋白的浓度，以考察藻蓝
蛋白对温度的稳定性。 1.4. 2酸碱稳定性试验
将1. 3. 2中富集分离得到的藻蓝蛋白上清液用0. 1 mol/ L稀H2SOI溶液调节pH为3. 0、5. 0、 8.。和9. 0 ,置于20°C的水浴中，开始计时并每隔0. 5 h测量上清液在568、620和650 nm处的吸 光度，再采用1. 2中的分析方法测量藻蓝蛋白的浓度，以考察藻蓝蛋白对酸碱的稳定性。