双光子激光扫描荧光显微镜及其应用
双光子显微成像原理及近期应用案例
双光子显微成像原理及近期应用案例双光子显微成像是一种高分辨率的成像技术，它利用两个光子的共同作用实现对生物样本的成像。
该技术在生命科学、医学和材料科学等领域有着广泛的应用。
本文将介绍双光子显微成像的原理，并探讨其在近期的应用案例。
双光子显微成像的原理是基于非线性光学效应。
在传统的荧光显微镜中，利用单光子的激发来激发和探测样品中的荧光信号。
然而，单光子的能量较高，容易导致样品的光化学损伤和细胞的光毒性作用。
而双光子显微成像则采用两个光子的准同步非共线激发，以降低光毒性并增加分辨率。
双光子显微成像的工作原理是通过使用超短脉冲激光来激发样品中的荧光物质。
这种超短脉冲激光具有高能量浓度和高峰值功率，可以实现光穿透较深的样品，如活体组织。
当两个光子同时到达荧光物质并被吸收后，它们的能量叠加，使得荧光物质处于激发态，进而发出荧光信号。
通过检测和记录这些荧光信号，可以获取样品的高分辨率图像。
在生命科学领域，双光子显微成像因其高分辨率和非侵入性的优势而得到广泛应用。
例如，研究者可以利用双光子显微成像技术观察细胞内的亚细胞器、蛋白质分子和细胞结构的变化。
双光子显微成像还可以用于监测神经元活动和细胞信号传导等重要生理过程。
通过对这些生物学过程的观察和研究，我们可以更好地理解生命的本质和疾病的发生机制。
近年来，双光子显微成像在医学诊断和治疗方面也取得了重要进展。
例如，在皮肤科领域，双光子显微成像可以非侵入性地观察皮肤水分含量、胶原蛋白分布和血管结构等，从而帮助医生诊断和治疗各种皮肤病。
另外，双光子显微成像还可以用于术前虚拟操作和手术引导等方面，提高手术的准确性和成功率。
例如，在眼科手术中，医生可以利用双光子显微成像技术精确地观察眼底血管和细胞变化，从而为患者提供更好的治疗方案。
除了生命科学和医学领域，双光子显微成像还在材料科学、纳米技术和能源研究等领域得到广泛应用。
例如，研究者可以利用双光子显微成像技术观察材料中的晶格结构、电子云变化和界面反应等，为新材料的设计和合成提供重要的参考。
双光子及光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验
Ex 1000
498
副发射峰位于约540nm
Lambda合成图特征：
GFP标记利水用稻根不中同自发波荧长光的的清双除 光子激光照 目La的mb：d了a射合解成土可图壤能特中征的含：不碳同细纳菌米间的管竞的争关靶系向药物， 目的：了la解m土b壤d中a的扫不描同细发菌现间的荧竞光争关信系号呈现 e原x理90：0某n严m些做材格z料-s的在tac双倍k，光频显子示激关多发系层，光会刻发效射果波，长信为号激随发深光度一增半加的而荧衰光减
GFP：绿色偏蓝
呈台阶形
自发荧光：绿色偏黄
自发荧光：
叶绿素荧光：红色
在560nm左右对称分布
叶绿素荧光：
625nm以上强烈信号
转基因ห้องสมุดไป่ตู้料的快速筛选
原则：密集预排列待测样
技巧：lambda扫描
色彩判别
荧光峰形检查
GFP蓝绿特征色
GFP台阶形特征峰
518
540
土壤浸出液中外源GFP标记细菌浓度分析
目的：了解土壤中的不同细菌间的竞争关系 方法：等比掺入外源GFP标记菌体，设置多种 环境条件 问题：土壤标本背景嘈杂，往往带有各种带荧 光的杂质颗粒 解决： 1 固定样品体积 2 lambda成像检测GFP特异荧光 3 最大化pinhole
主 6绿2发色5n射信m峰 号以激 光位 被上于 强发一强约 烈烈，半红5信1光会的号8n掩m发荧盖射光波长为激发
3 最大化pinhole
GFP和RFP弱时无法分辨
ex 900nm 做z-stack，显示多层光刻效果，信号随深度增加而衰减
利用光谱扫描鉴定微弱荧光信号的真假
后者高度约为前者的一半
在2个不同Z坐标下做bleach， ex 458nm
双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验
图像采集与处理
采集参数设置
根据样本特性和实验目的，合理 设置图像采集的参数，如曝光时 间、增益等，以提高图像质量。
图像处理与分析
利用专业软件对采集到的图像进 行必要的处理和分析，如去噪、 增强对比度、测量荧光强度等。
数据导出与共享
将处理后的数据导出为通用的文 件格式，便于进一步的数据分析 和共享。
防止光漂白
在观察过程中，应尽量避免长时间 照射和频繁扫描，以减少荧光染料 的光漂白。
荧光探针的选择与使用
探针特异性
选择具有高特异性的荧光探针，以确 保标记的准确性和可靠性。
探针浓度与稳定性
探针混合使用
在某些情况下，可能需要将几种荧光 探针混合使用，此时应确保它们之间 不会发生相互干扰或淬灭现象。
根据实验需求，调整荧光探针的浓度， 并确保其在样本中的稳定性。
药理学研究中的应用
总结词
双光子和光谱扫描在药理学研究中具有重要价值，能够观察药物对细胞和组织的影响，有助于发现新 的药物作用机制和靶点。
详细描述
在药理学研究中，双光子和光谱扫描技术被广泛应用于观察药物对细胞和组织的影响。这些技术能够 实时监测药物对细胞代谢、能量代谢、蛋白质表达等方面的影响，帮助科学家们发现新的药物作用机 制和靶点，为新药研发提供有力支持。
04 技术挑战与未来展望
提高成像深度与分辨率
优化双光子吸收截面
通过提高双光子吸收截面，可以降低成像所需的激光功率，从而 减少光毒性。
开发新型光谱扫描技术
通过改进光谱扫描技术，可以实现更快速、更准确的图像采集，提 高分辨率。
优化光学元件
选用高数值孔径的物镜和低噪声的光电探测器，提高成像深度和分 辨率。
察细胞和组织的细微结构。
贝塞尔双光子光片显微镜在活体生物成像中的应用
贝塞尔双光子光片显微镜在活体生物成像中的应用第一篇范文贝塞尔双光子光片显微镜在活体生物成像中的应用引言：活体生物成像技术在生物学和医学领域中起着重要的作用。
近年来，贝塞尔双光子光片显微镜作为一种先进的成像技术，被广泛应用于活体生物成像领域。
本文将介绍贝塞尔双光子光片显微镜在活体生物成像中的应用，并探讨其优势和挑战。
一、贝塞尔双光子光片显微镜的原理：贝塞尔双光子光片显微镜是一种基于双光子激发荧光显微镜的技术。
它利用两个光子的能量同时激发样品中的荧光分子，从而实现了更深层次的成像。
与传统的单光子激发荧光显微镜相比，贝塞尔双光子光片显微镜具有更高的分辨率和对样品的损伤较小的优点。
二、贝塞尔双光子光片显微镜在活体生物成像中的应用：1. 神经科学研究：贝塞尔双光子光片显微镜在神经科学研究中有着广泛的应用。
通过该技术，研究人员能够实时观察神经元的行为和信号传递过程，进一步了解大脑的功能和疾病机制。
2. 心血管研究：贝塞尔双光子光片显微镜也被应用于心血管研究领域。
通过该技术，研究人员能够清晰地观察心脏细胞的动作电位和心肌组织的结构变化，为心脏疾病的研究和治疗提供重要的信息。
3. 细胞生物学研究：在细胞生物学研究中，贝塞尔双光子光片显微镜能够实时观察细胞内部结构和分子的动态变化，帮助研究人员深入了解细胞的行为和功能。
4. 肿瘤研究和药物开发：贝塞尔双光子光片显微镜在肿瘤研究和药物开发领域也发挥着重要作用。
通过该技术，研究人员能够观察肿瘤细胞的生长、转移和药物反应，为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路和方法。
三、贝塞尔双光子光片显微镜的优势和挑战：1. 优势：- 高分辨率：贝塞尔双光子光片显微镜具有更高的分辨率，能够实现更深层次的成像。
- 最小化样品损伤：双光子激发具有较低的光剂量，能够减少对样品的损伤。
- 实时观察：该技术能够实时观察活体生物样本，提供更准确的数据和信息。
2. 挑战：- 设备成本高：贝塞尔双光子光片显微镜的设备成本相对较高，限制了其在广泛领域的应用。
新型光学成像技术——双光子荧光显微镜
新型光学成像技术——双光子荧光显微镜光学成像技术一直以来都是生物学研究的重要手段。
传统的荧光显微镜通过荧光标记物的发光来研究生物分子和细胞的功能，但由于深度限制和荧光标记对细胞和生物体的影响，限制了研究深度和准确程度。
然而双光子荧光显微镜的出现改变了这个现状，具备高分辨率、深度成像和非侵入性标记等特点。
一、双光子荧光显微镜的原理双光子荧光显微镜的成像原理是利用非线性荧光效应——双光子激发荧光效应，当两个光子的能量合成能够与荧光分子的跃迁能量匹配时，荧光分子受到激发，发生荧光发射。
与传统的单光子激发荧光不同，双光子激发荧光只在聚焦点产生明显的荧光信号。
这是因为在双光子激发荧光中，荧光产生需要两个光子的同步作用。
这种非线性过程不利于在样品各个层次产生荧光信号。
因此，在使用双光子荧光显微镜进行样品成像时，只在聚焦点周围的小范围内进行信号的检测，从而能够获得更高的分辨率和更深的成像深度。
二、双光子荧光显微镜的特点1. 非侵入性成像传统的荧光显微镜需要生物体或细胞中荧光标记物的标记才能进行成像。
而双光子荧光显微镜不需要使用任何外部标记物，可以直接在生物体中进行成像。
这种非侵入式成像能力使得双光子荧光显微镜在活体成像和组织工程等应用方面有着广阔的应用前景。
2. 高分辨率成像由于双光子荧光显微镜的成像原理，只在聚焦点周围的小范围内进行信号的检测，能够获得更高的分辨率。
深度成像时，同样具备更高的分辨率，在成像深度达到300μm时，其分辨率保持在数百奈米量级。
3. 深度成像双光子荧光显微镜能够获得更深的成像深度。
传统的荧光显微镜在成像深度达到几十微米之后，即使在同样的条件下，荧光信号的强度会急剧减弱，因此限制了深度成像的应用范围。
而双光子荧光显微镜能够在成像深度达到1mm时，仍然能够获得较高的荧光信号强度和分辨率。
三、双光子荧光显微镜的应用1. 细胞成像双光子荧光显微镜能够对单个细胞进行成像，展示细胞内分子的构成和运动过程，以及细胞能量代谢和信号传递的机制等。
双光子激发荧光显微镜的发展
双光子激发荧光显微镜的发展随着科技的不断进步，显微镜成为了深入认识生命世界的重要工具之一。
而在显微镜技术中，双光子激发荧光显微镜的发展备受关注。
本文将就双光子激发荧光显微镜的相关知识进行论述。
什么是双光子激发荧光显微镜？双光子激发荧光显微镜，简称双光显微镜，属于激光显微技术的一种，并被广泛应用于生命科学中。
其工作原理是使用高质量的激光器引导光走向样品，通过使用两个光子同时作用于分子来激发显微镜所需要的荧光信号。
这种方法允许显微镜更好地看到细胞和生物体组织的内部结构。
双光显微镜的优势与传统显微镜相比，双光显微镜有许多显著的优势。
首先，通过使用两个光子激发单个分子，双光显微镜可以提供更高的空间分辨率和深度分辨率，这是因为激光器以较少的能量量光局部激发组织。
其次，使用双光显微镜可以降低对样品的组织破坏，因为较低的光能量只会在样品中产生微小的热效应和氧化反应。
另外，由于双光显微镜只激发标记物，因此可以获得清晰的荧光成像，减少在样品中不必要的光发生。
双光显微镜的应用领域由于双光显微镜提供了更高的空间分辨率和深度分辨率，因此双光显微镜可以用于研究活体细胞结构、功能和动态变化。
双光显微镜可以帮助生物学家观察单个细胞和组织中的多个神经元和分子扰动，以便更好地了解生命的基本机制。
此外，双光显微镜还可以用于非线性光学研究、大分子结构研究、纳米材料研究、化学反应动力学和生物分子动力学的研究等领域。
现在，越来越多的科学家和工程师致力于双光显微镜的推进和发展，以期探索和发现新的科研成果。
我们相信，在双光显微镜的应用研究中，将会有许多重要的发现和创新出现，助推生物科技领域的进一步发展。
结语双光子激发荧光显微镜是一种创新的科技技术，它的出现和发展深入了解生命世界的机理，为生物学和医学研究提供了更加准确的实验手段和方法龙。
我们相信，随着科技的不断进步，双光显微镜将会有更加广泛的应用。
双光子激光扫描荧光显微镜及其应用
表 1 几种常见荧光分子的单光子 、双光子 和三光子的吸收截面 3 [5 ]
荧光分子
δ1 (λ/ nm) / 10 - 16cm2
ηδ2 (700nm)
/ 10 - 50cm4·s / 光子
ηδ3 (700nm) / 10 - 83cm6·s2/ 光子2
DAPI free
113 (345nm)
Dansy1
TWO PHOTON LASER SCANNING FL UORESCENCE MICROSCOPY AND ITS APPL ICATIONS
CHEN De2Qiang XIA An2Dong WAN G Ke2Yi HUAN G Wen2Hao
( Depart ment of Precision M achi nery and Inst rument ation , U niversity of Science and Technology of Chi na , Hef ei 230026)
图 1 单 、双光子激发过程示意图
图 2 单 、双光子激发所形成的荧光形貌 (样品为罗丹明 B 的水溶液. 上为单光子激发 ,下为双光子激发)
3 材料的吸收截面 δ
吸收截面 δ是双光子激发现象的重要参数 , 它 的大小反映了分子吸收双光子的本领. 对单光子激 发中的吸收截面 δ已有较为准确的文献记载 , 而对 双光子乃至多光子吸收截面 δ,目前尚缺乏全面 、准 确的记载. 因此 ,对常用的荧光分子多光子吸收截面 δ和光谱的进一步研究 , 将有助于多光子激发共焦 激光扫描荧光显微镜的进一步广泛应用.
·232 ·
2 双光子激发原理简介
在激光照射下 ,基态荧光分子或原子吸收一个 光子后成为激发态 ,随后又弛豫到某一基态 ,同时以 光子形式释放能量而发出荧光. 这一过程就是通常 的单光子激发情况. 1931 年 ,Maria G ppert - Mayer 预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中 ,同 时吸收两个光子而成激发态 ,这种情况就是双光子 激发过程[2 ] . 1961 年 , Kaiser 等在 CaF2 ∶Eu2 + 晶体 中首次观察到了这种双光子激发现象[3 ] . 图 1 简单 地描述了这种双光子激发的过程. 比如在单光子激 发情形 ,NADH 酶在 350nm 的光激发下产生 450nm 的荧光 ,而在双光子激发情形 , NADH 酶则需同时 吸收两个 700nm 的光子才能产生 450nm 的荧光. 这 就是说 ,双光子技术可以使我们无需使用紫外光源
双光子显微镜用途
双光子显微镜用途双光子显微镜（Two-photon microscope）是一种高分辨率的显微镜技术，它利用两个低能量的光子同时激发样本，从而获得三维立体的高清图像。
与传统显微镜技术相比，双光子显微镜具有较大的穿透深度、较低的背景荧光和较少的细胞损伤等优点，因而被广泛应用于生物医学研究领域。
双光子显微镜的原理是利用两个相当低频率的激光束同时通过透镜，进入样品。
当两个低频激光束在样品中的焦点交汇时，只有同时处于两束光子对应波长的区域才会被激发发光，使得仅激发样品焦点位置的荧光信号形成。
这种二次非线性光学过程产生的双光子荧光信号，则可以在样品内深层结构进行高分辨率成像。
另一方面，双光子激发荧光信号仅在焦点内产生，减少了有机染料等光毒性物质对生物样品的损伤。
双光子显微镜的应用范围非常广泛，以下是一些主要的用途：1. 细胞和组织成像：双光子显微镜可以在活体细胞和组织上进行高分辨率的成像，观察细胞内的分子和结构。
它可以提供细胞和组织的立体结构、形态、空间分布和细胞动力学等相关信息，对于研究细胞的表面、核内结构和细胞器的功能有重要意义。
2. 神经活动成像：双光子显微镜可以通过染色剂或染料与生物标记物相互作用，对神经元的形态、连接和电生理活动进行实时观察。
科研人员可以利用这一技术来研究神经元的空间分布、突触传递、突触结构和神经网络的功能等。
3. 癌症研究：双光子显微镜可以观察和追踪肿瘤细胞在活体内的扩张和转移过程。
通过染色剂或荧光标记物，可以定量测量肿瘤细胞或器官中的生化分子表达。
同时，双光子显微镜还可以用于药物研发和评估，以及肿瘤病理过程的研究。
4. 免疫学研究：双光子显微镜可以观察和监测免疫细胞在活体内的迁移和活动过程。
例如，它可以用来研究免疫细胞与细菌、病毒、寄生虫等病原体的相互作用，以及固定免疫细胞和移行免疫细胞之间的相互作用。
5. 皮肤研究：双光子显微镜可以在活体皮肤上观察细胞和组织的生理和病理过程，如麻风病、荨麻疹、红斑狼疮等。
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维成像. 图 3 为共焦激光扫描荧光显微镜的原理图. 它的关键技术是共焦小孔 (pinhole) 的引入. 由于共 焦小孔的存在 ,探测器只接收来自物镜焦点处的信 息 ,焦点以外的光将全被共焦小孔屏蔽. 因而共焦激
光扫描显微镜要比常规光学显微镜的分辨率要高 些 ,且图像清晰度也有所增强. 而且正是由于共焦小 孔的存在使之具有三维成像的特点 ,这是常规光学 显微镜所不能比拟的.
图 4 常见的双光子激发共焦激光扫描荧光显微镜的配置图
5 双光子激发共焦激光扫描荧光显微镜的 特点
正如前述 ,在单光子激发情况下 ,荧光波长比激 发波长大 ,而且荧光量子效率与入射光强度成正比 ,
物理
同时 ,在透过样品的整个激发光路上都产生了单光 子激发现象. 另外 ,在生物医学研究中 ,为了获得足 够精度的数据 ,以进行定量分析 ,用作标记的荧光剂 或试样本身的激发和荧光波长往往在紫外和近紫外 波段. 比如 NADH 酶的荧光峰为 450nm ,且必须用 350nm 的激光激发. 然而 ,这种波长的紫外光对生 物组织常常是有害的. 同时 ,在研究生物体组织的荧 光成像时 ,人们有时必须使用 250 —300nm 的激发 光 ,这就要求使用复杂的紫外波段的物镜和紫外光 学元件 ,这给实验带来很大的麻烦.
Abstract The principle of two - photon laser scanning fluorescence microscopy and its applications are re2 viewed. Its intrinsic t hree2dimensional spatial resolution has been widely exploited in t he life sciences ,semiconduc2 tor technology ,optical data storage and lit hographic microfabrication. Key words two2photon laser scanning fluorescence microscopy ,confocal ,t hree2dimension
目前 ,双光子共焦激光扫描显微镜已成为半导 体制造和检测 、生物学 、医学研究和三维高密度存储 及其微细加工的重要工具 ,为开拓新学科和促进科 学研究领域向更高层次发展起到了非常重要的作 用. 利用双光子共焦激光扫描显微镜的特点揭示了 许多新现象和新规律. 本文拟对这一技术的原理 、特 点和应用进行综述.
同常规的单光子激发共焦激光扫描荧光显微镜 相比 ,双光子共焦激光扫描荧光显微镜光源多采用 锁模的飞秒钛宝石激光器以得到足够强的激光 ,保 证对样品进行双光子激发. 考虑到显微镜内复杂的 光学元件对飞秒脉冲的影响 ,可以在光路中插入腔 外脉冲压缩器 ,对超快激光在物镜焦点处的脉冲展 宽和脉冲畸变进行优化和压缩[8 ,9 ] . 另外 ,由于材料
实验技术
双光子激光扫描荧光显微镜及其应用 3
陈德强 夏安东1) 王克逸1) 黄文浩1)
(中国科学技术大学精密机械与精密仪器系 合肥 230026)
摘 要 文章对双光子激光扫描荧光显微镜的原理及其应用进行了综述. 双光子激光扫描荧光显微镜的本征的空 间三维成像特性广泛应用于生命科学 、半导体和三维高密度数据存储及其微细加工的研究. 关键词 双光子激光扫描荧光显微镜 ( TPL SM) ,共焦 ,三维
3 国家自然科学基金和国家教委留学回国人员科研启动基金资助 项目 1999 - 06 - 04 收到初稿 ,1999 - 08 - 27 修回
1) 中国科学技术大学理化中心选键化学实验室客座人员
物理
就能达到检测紫外荧光探针的目的. 由于双光子激 发所产生的荧光强度与激发光的光强平方成正比 , 因而与单光子激发的线性过程相比 ,双光子激发就 需要很强的激发光强 ,这就使双光子激发具有很高 的空间局域特点. 图 2 是单 、双光子激发所产生的荧 光形貌. 从图 2 可以看出 ,由于单光子激发的线性过 程 ,在整个激发光路里的样品都由于激发而发出荧 光 ,而对于双光子激发而言 ,只有在焦点处的微小区 域内样品才能吸收足够的双光子而发出荧光. 将双 光子 激 发 的 这 一 特 点 应 用 到 CL SM 而 产 生 的 TPL SM ,可以获得比单光子 CL SM 更清晰的三维荧 光图像. 另外 ,在此基础上发展起来的三光子激发 (荧光分子同时吸收 3 个光子) 的 L SM 也越来越显 示出其重要的特点 ,它具有比 TPL SM 更高的空间 局域性[5 ] ,因而具有更高的空间分辨率.
0117 (336nm)
Fura - 2 + Ca2 + 112 (335nm)
Fura - 2 free 110 (362nm)
Indo - 1 + Ca2 + 113 (340nm)
Indo - 1 free 113 (345nm)
0116 1 12 11 115 315
0125 013 30 20 6 2
·234 ·
的双光子吸收强烈地与激发光强的平方相关 ,因而 在紧聚焦的条件下 ,双光子吸收仅局域于物镜焦点 处的空间体积～λ3 的小范围内 ,使人们可以或甚至 不使用共焦小孔 ,就能得到高清晰的三维图像 ,使共 焦显微镜的设计大为简化 ,易于操作. 这是多光子激 发的一大优势. 图 4 是双光子激发共焦激光扫描荧 光显微镜的配置图.
1990 年 ,美国康奈尔大学 Denk 等人提出将双 光子 激 发 现 象 应 用 到 共 焦 激 光 扫 描 荧 光 显 微 镜 中[1 ] ,从而为共焦激光扫描显微镜的更广泛应用开 辟了道路. 双光子激发共焦激光扫描荧光显微镜较 好地克服了单光子激发共焦激光扫描荧光显微镜的 缺点 ,而且有着较高的空间分辨率. 由同时吸收 2 个 以上的光子组成的多光子激发激光扫描荧光显微镜 超过了常规的单光子共焦荧光显微镜的分辨极限. 目前 ,多光子激发共焦激光扫描荧光显微镜已引起 了各国学者的广泛注意和兴趣.
A 值为 10 - 16 —10 - 17 cm2 . 光子符合的时间尺度由 虚拟中间态的持续时间Δτ决定 , 由测不准原理可 估计Δτ≈10 - 16 s , 因此 , 由 A 2Δτ得双光子激发吸
收截面δ 大约为 10 - 49 cm4 ·s/ 光子. 相应地 , 由 A 3 (Δτ) 2 得三光子激发吸收截面 δ大约为 10 - 82cm6·
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s/ 光子2 . 由于在多光子激发过程中 , 仅有一小部分 光子被吸收 , 所以直接测量多光子吸收截面 δ往往
很困难. 为了便于应用 ,表 1 列出了几种常见荧光分 子的吸收截面 δ的值[5 ] . 对于一个 n 光子的激发过
程 ,荧光分子的荧光强度正比于 δnIenxτ, 因而由表 1 可见 ,在相同的激发光强 ( Iex) 下 , 双光子激发吸收 截面 δ2 和三光子激发吸收截面 δ3 比单光子激发吸 收截面 δ1 要小得多. 因此 , 多光子激发要求的入射 光强比单光子激发大得多.
3 表中数据是在 10 - 4mol/ L 的溶液中测得的 ,η是荧光分子的荧光
量子效率
4 共焦激光扫描荧光显微镜原理
共焦激光扫描荧光显微镜技术的发展是光学显 微镜技术的一次革命[6 ,7 ] . 它是以光学系统的共焦 成像为基础 ,利用光扫描技术和样品扫描技术对样 品进行三维动态测量的装置. 它利用激光作为光源 , 在光学设计时 ,采用共轭焦点 (共焦) 技术 ,使光源 、 被照物点和探测器处在彼此对应的共轭位置. 光源 经物镜在样品内聚焦成衍射极限的光点 ,其荧光 (或 反射光) 再次通过物镜或聚光镜到达空间滤波器的 共焦针孔内 ,由靠近针孔后面的探测接收器接受信 号. 通过扫描聚光点在样品内的位置对样品进行三
图 1 单 、双光子激发过程示意图
图 2 单 、双光子激发所形成的荧光形貌 (样品为罗丹明 B 的水溶液. 上为单光子激发 ,下为双光子激发)
3 材料的吸收截面 δ
吸收截面 δ是双光子激发现象的重要参数 , 它 的大小反映了分子吸收双光子的本领. 对单光子激 发中的吸收截面 δ已有较为准确的文献记载 , 而对 双光子乃至多光子吸收截面 δ,目前尚缺乏全面 、准 确的记载. 因此 ,对常用的荧光分子多光子吸收截面 δ和光谱的进一步研究 , 将有助于多光子激发共焦 激光扫描荧光显微镜的进一步广泛应用.
表 1 几种常见荧光分子的单光子 、双光子 和三光子的吸收截面 3 [5 ]
荧光分子
δ1 (λ/ nm) / 10 - 16cm2
ηδ2 (700nm)
/ 10 - 5Байду номын сангаасcm4·s / 光子
ηδ3 (700nm) / 10 - 83cm6·s2/ 光子2
DAPI free
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1 引言
近年来 ,光学显微镜技术中的一个最引人注目 的成就是双光子激发现象 (two2p hoton excitation ,简 称 TPE) 在共焦激光扫描显微镜 (confocal laser scan2 ning microscopy ,简称 CL SM) 中的广泛应用[1 ] . 随着 飞秒激光技术和光学显微镜技术的发展 ,现在人们 已经能够比较容易地制造并使用双光子共焦激光扫 描显微镜 ( two2p hoton laser scanning microscopy ,简 称 TPL SM) ,对样品在双光子激发后发出的荧光进 行观察和三维成像.