双光子荧光
双光子荧光显微镜的原理特点
双光子荧光显微镜的原理特点
1.双光子激发
双光子荧光显微镜的激发方式与传统的荧光显微镜不同。
传统的荧光显微镜利用一束高能光子激发荧光标记物，而双光子荧光显微镜则采用两束较低能量的激光束同时照射样本，仅在聚焦点处产生足够高的能量密度来激发荧光。
2.非线性激发
3.深层成像
4.较小的损伤风险
5.三维成像能力
6.高分辨率
总之，双光子荧光显微镜通过采用双光子激发和非线性光学特性，实现了高分辨率、深层、三维成像，并具有较小的损伤风险等优点。
它在生命科学研究中发挥着重要的作用，为科学家们提供了窥探细胞和组织内部结构与功能的新窗口。
新型双光子荧光染料DMAHAS在人-鼠肝癌模型中的应用
中图 分 类号 ：７ ５ ３ Ｒ ３ ． 文 献 标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０６１０ （０ ０ ０ －３６０ １０ —７ ３ ２ １ ）６０ ８ －４
Ａｐ ｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｖ ｌＴｗｏ ｐ ｔ ｎ Ａｂ ｏ ｂ ｎｇ Ｆｌ ｒ ｓ ｅ ｅ ｉ ｐｌ ｔｏ ｆａ Ｎｏ ｅ ｃ － ｈｏ ｏ ｓ ｒ ｉ ｕｏ ｅ ｃ ｎｃ ｎ Ｈｕｍ ａ ｐ ｔｃ Ｃａ ｅ ｉｓ Ｘｅ ｏ ｒ ｆ ｉ ｅ Ｍ ｏ ｅ ｎ Ｈｅ ａ ｉ ｎｃ ｒ Ｃｅ ｌ ｎ ｇ ａ ｔ Ｍ ｃ ｄｌ
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性分析采用 ＭＴ 、 Ｙ 中性红 （ Ｒ） 考马斯亮蓝 （ Ｂ 和流式 细胞术 （ Ｃ 等方法 。Ｄ Ｈ Ｓ Ｎ 、 ｃ） Ｆ Ｍ） ＭＡ Ａ 标记肿瘤细胞 的体 内示 踪在人
肝癌模 型中进行 ， 切除的肿瘤异种移植物经荧光成像 和传统 的组织病理分析 。此 外 ， 我们 建立 了一种基于 Ｄ Ｈ Ｓ释放 ＭＡ Ａ 的细胞 毒性分析方法 。研究结果表 明 Ｄ Ｈ Ｓ ＨｅＧ ＭＡ Ａ 对 ｐ ２细胞无 明显毒性 ， 它显示 出对 活细胞很高 的穿透性和稳定 的细 胞质定 位。体 内细胞示踪实验 表明它是一种用于肿瘤示踪和荧光成像 的可靠探针。 关键词 ： 细胞毒性 ； 双光子吸收； 荧 光成像 ； 细胞毒 Ｔ细胞 ； 肝癌
荧光材料的双光子效应
荧光材料的双光子效应
荧光材料的双光子效应是指当一束激光通过荧光材料时，两个光子同时被吸收并导致荧光发射的现象。
这种效应在近年来得到了越来越多的关注，因为它具有许多优点，例如更高的空间分辨率和深度穿透能力。
荧光材料是一种特殊的材料，它可以吸收一定波长范围内的电磁辐射并发出可见光。
这种现象被称为荧光效应。
在双光子效应中，两个激光光子被吸收后，电子从基态跃迁到激发态，并在退激发过程中发出荧光信号。
与传统单光子激发相比，双光子激发具有更高的局部化和深度穿透能力。
这是因为双光子效应只会在聚焦点处发生，而且其穿透深度比单光子更大。
这使得双光子显微镜成为生物医学领域中重要的成像技术之一。
除了生物医学领域外，双光子效应还可以应用于光电转换、光学存储和激光打印等领域。
此外，由于双光子效应的独特性质，它还可以用于制备具有高分子量的荧光材料。
总之，荧光材料的双光子效应是一种非常有前途的技术，在各个领域
都有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展和完善，相信这种技术将会在更多领域得到应用。
双光子荧光概述.
一个虚能态 , 通过两个光子的
能量进行叠加而使处于基态的 电子达到激发态。
Has not been difficult, then does not have attains
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荧光物质在吸收了与其能级结 构匹配的能量后，电子由基态
S0 被激发至激发态 S1 ，经过辐
射跃迁后电子又回到基态 S0 ， 这一过程中发射出荧光。与单 光子荧光不同，双光子吸收过 程中，基态与激发态之间存在
目录
1.研究背景
2.基本原理
3.特点及优点
4.应
用
Has not been difficult, then does not have attains
1 双光子荧光背景介绍
双光子吸收是指在强光激发下,介质分子同时吸收两 个光子,从基态跃迁到两倍光子能量的激发态的过程。 早在1931年, Gppert Mayer 就在理论上预言了双光
双光子荧光产生原理：荧光分子吸收第一个光子后，跃迁 到虚能级上，该能级仅能存在几飞秒，便自动返回基态， 第二个光子必须在这几飞秒内与虚能级上的分子作用，从 基态跃迁到激发态，能量较大的激发态分子,通过内转换
使自己回到最低电子激发态的最低振动能级。处于此能级
的分子不是通过内转换的方式来消耗能量，回到基态，而 是通过发射出相应的光量子来释放能量，回到基态的各个 不同的振动能级时，就发射荧光。
子吸收的存在。
直到上世纪60年代初激光器出现后,才由Kaiser等首 先从实验上证实了双光子吸收过程。然而,由于一般材料 的双光子吸收截面很小,双光子吸收的实际应用受到限制, 使双光子吸收研究一直停留在基础研究水平。
双光子荧光
双光子荧光显微成像由于兼具诸如近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等特点而显著地优于单光子荧光显微成像,为生命科学研究提供了更为锐利的工具.用于研究离子的含量及其对生理的影响、离子参与的生理活动机制、离子与分子的作用、特定分子的分布及其相互作用等方面的双光子荧光探针,是实现成像的关键.双光子荧光探针的研究旨在促进双光子荧光显微镜应用的发展,促进生命科学、医学科学的快速发展,同时也带动双光子荧光探针所隶属的化学这一学科的发展。
次氯酸双光子荧光探针的合成及其在生物成像中的应用
次氯酸双光子荧光探针的合成及其在生物成像中的应用中文摘要双光子吸收技术自问世以来一直受到了广泛的关注。
与单光子吸收材料相比，双光子吸收材料在分辨率、穿透深度具有显著的优势，可以用于显微成像、微纺织技术、三维数据存储、光限幅、上转换发光、光动力学治疗以及药物靶向释放等诸多领域。
特别是双光子显微技术，以近红外的激光为光源对生物样品进行成像，具有穿透性强，空间分辨率高，背景荧光干扰小，以及对生物样品的光损伤较小等优点，在生物医学领域具有广阔的应用前景。
然而，传统的双光子材料常常具有大共轭结构，水溶性差、细胞穿透能力差、生物毒性也较大，并不适用于生物成像。
因此，设计合成具有较高双光子吸收截面的有机小分子用于生物体内细胞、血管、组织成像，具有重要的研究价值。
本文设计合成了两种具有双光子吸收特性的荧光小分子，对其发光性能进行了系统的研究，探索它们在生物成像中的应用。
具体的研究内容包括：1、设计合成了一类以寡聚苯乙烯为骨架的双光子次氯酸荧光探针OPV-HOCl，并将其应用于活细胞及组织内的双光子成像。
在寡聚苯乙烯骨架上引入次氯酸识别基团——氧硫杂环戊烷，通过1H-NMR、13C-NMR、HRMS 对其结构进行了表征，并通过紫外光谱、荧光光谱等进一步研究了该探针对次氯酸的响应性能，测定了其双光子吸收截面。
加入次氯酸以后，探针分子末端的氧硫杂环戊烷基团被氧化，并生成醛基。
由于分子内强烈的电荷转移导致产物的双光子吸收截面提高了近15倍（从78.9GM提高到1131.5GM），因此OPV-HOCl可以作为一个双光子“turn-on”型次氯酸荧光探针。
此外，该探针还具有反应速度快、选择性好、pH适用范围宽等优点。
MTT实验表明该探针具有较小的细胞毒性。
由于该探针优异的次氯酸响应性能和较小的生物毒性，我们成功地将其用于小鼠胶质瘤细胞BV-2中次氯酸的检测，研究表明该探针可以透过细胞膜，并对细胞中外源性次氯酸和脂多糖诱导产生的内源性次氯酸具有高选择性的快速响应。
双光子荧光原理
双光子荧光原理
《双光子荧光原理》
嘿，大家知道吗？今天我来给你们讲讲双光子荧光原理，这可真是个神奇的玩意儿啊！
就说有一次我去实验室，看到那些科学家们在捣鼓一些奇怪的仪器。
我凑过去一看，嘿，他们正在研究双光子荧光呢！我就好奇地问：“这到底是咋回事呀？”科学家笑着跟我说：“别急，听我慢慢道来。
”
然后他就开始给我解释啦，说这个双光子荧光啊，就像是一场特别的灯光秀。
你可以想象一下，在一个黑黑的地方，有一些小小的分子，它们就像一个个小演员。
当有特定的光照射过去的时候，这些小演员就开始活跃起来啦！它们会吸收两个光子，然后发出特别亮特别神奇的荧光。
就好像这些小演员突然被点亮了，开始闪闪发光。
我当时就觉得，哇塞，这也太有意思了吧！就好像是在黑暗中突然出现了很多美丽的小星星。
然后科学家还说，这个原理在很多领域都有重要的应用呢，比如医学啦、生物学啦等等。
我听了之后真的是大开眼界啊，原来这么一个看似深奥的原理，其实也可以这么有趣地去理解呀！这就像是生活中的很多事情，当你深入去了解的时候，总会发现一些意想不到的惊喜和乐趣。
哎呀，这双光子荧光原理，真的是让我又长了不少见识呢！我想我以后看到那些闪闪发光的东西，都会想起这个神奇的原理啦！哈哈！
怎么样，我讲得够通俗易懂吧，希望你们也能像我一样对双光子荧光原理感兴趣哟！。
双光子荧光显微镜的研究
浙江大学』Ⅲ！｛ｊ学位论文第二章双光ｆ成像理论吒。
ｍ＝叫２吨。
篙ｅｘｐｆ（２Ｂ．４）山§２２的分析可以知道，这里口；为一比例系数，与单光子探测系统有关；口，现对单光子荧光强度和双光子荧光强度在径向作一比较，令公式（２．３．３）和（２．３．４）中的ｚ＝Ｏ，可以得到荧光光强的径向分布方程分别为：Ｌ。
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２唧陶㈦，．ｓ，（ａ）（ｂ）图２—３荧光强度径向归一化分布（ａ）甲光子荧光光强径向归～化分布（ｂ）双光予荧光光强径向归～化分布蔫浙江大学顺士学位论文第三章双光于实验系统简介第三章双光子实验系统简介在了解了双光予成像理论的基础上，介绍实验中双光子成像系统的流程以及备个组成部分。
通过前期的实验，分析和总结得到的实验数据，经理论计算后，对取光子系统的性能做了一个测试，为双光子荧光成像实验，以及双光子、ＯＣＴ相结合实现结构功能成像等后期科研的展开打下基础。
本章首先介绍了双光子荧光成像系统的流程，然后对其主要部分：光学成像设计、光电转换、机械扫描做了一个简要的介绍，研制了新型的扫描探头。
§３．１双光子荧光成像实验系统流程双光予实验系统的总体构架如图３一ｌ所示图３，ｌ双光子荧光显微镜实验系统图对于一个完整的双光子荧光成像系统，一般应包括：光学成像、光电转换、机械扫描、计算机控制、数据采集、数据处理和显示等几个部分。
其系统流程如第二章职光予实验系统简介在探测器前面放置了荧光滤光片，来选择适当的荧光范围，过滤背景光，提高系统的信噪比。
图３—３中虚线框内表示的是ＮＩＫＯＮ５０Ｉ显微镜丰体，其详细结构如图３－４所示：图３．４ＮＩＫＯＮ５０Ｉ显微镜光路图箭头的方向表示光束入射的方向。
由图可以知道，Ｎ１ＫＯＮ５０１显微镜本身结构中就包含了落射式和透射式两种激发荧光的方式，可以根据需要来选择。
由第章ｌ｝，的介绍，可以知道，对本次实验来说，为最大程度的探测荧光，用落射式采集荧光的效率高，所以只利用显微镜上半部分的光路。
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3 双光子荧光的特点及优点
3.1 特点：
(1)双光子吸收的辐射光源一般在可见-近红外区 (≥800nm)； (2)双光子吸收的强度与激发光强的平方成正比，是 一种非线性吸收，荧光强度比单光子吸收强；
3.2 优点
• (5)双光子跃迁具有很强的选择激发性，有利于对 生物组织中一些特殊物质进行成像研究，广泛应 用于生物活体检测中。
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4 双光子荧光应用
双光子荧光探针
双光子荧光显微成像
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荧光物质在吸收了与其能级结 构匹配的能量后，电子由基态
S0 被激发至激发态 S1 ，经过辐
射跃迁后电子又回到基态 S0 ， 这一过程中发射出荧光。与单 光子荧光不同，双光子吸收过 程中，基态与激发态之间存在
3.2 优点
• (2)双光子荧光使用红外激光作为激发光源，能大 大地降低生物组织对激发光的吸收，可获得较强 的样品荧光；
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3.2 优点
• (3)长波长光源作为双光子荧光的激发光源，可以 避免样品中激发波长较低的自发荧光物质的干扰；
一成功用于双光子显微镜的双光子探针。
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双光子荧光探针的研究领域
双光子葡萄糖示踪器
具有良好的光稳定性，能够持 续监控正常细胞与结肠癌细胞摄入葡萄糖的过程，能够成 像观察癌细胞与结肠癌深处抗癌剂的能力，为癌症的早期 诊断提供帮助 双光子巯基探针 根据探针与巯基反应后荧光增强， 可用双光子显微镜探测活体细胞与组织90-180μ m深处的 巯基成像情况 双光子半胱氨酸探针 根据醛基（sp2）与半胱氨酸 反应后转变为叔甲基(sp3)而丧失吸电子效应这一原理实现
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3.2 优点
(1)由于激发光源波长较长，受光散射影响较小，使 得入射光的损耗较小，在介质中的穿透性较好；
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双光子荧光探针的种类
阴离子探针
氟离子探针，Liu等报道了3个类似的探针 分子。此类探针尚不能在水中识别氟离子．但为双光子阴离 子探针的设计提供了一个范例。
双光子pH探针
werts等合成了双光子pH探针，是唯
子吸收的存在。
直到上世纪60年代初激光器出现后,才由Kaiser等首 先从实验上证实了双光子吸收过程。然而,由于一般材料 的双光子吸收截面很小,双光子吸收的实际应用受到限制, 使双光子吸收研究一直停留在基础研究水平。
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双光子荧光探针设计原理
探针分子组成：一是荧光团；二是离子团或称作受体
作用机制：
1、一是分子内电荷迁移机理（ICT） 2、二是光诱导电子迁移过程（PET） 3、共振能量迁移(RET) 4、集团转换（GC）
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双光子荧光
（Two-photon fluorescence）
组员：樊艳萍
孟 筝 贾晓波 白秋红
2015.10.22
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• 与单光子相比，双光子激发过程就是基态荧光分子或原 子同时吸收两个光子激发至激发态，通过弛豫过程，辐 射出频率略小于两倍入射光频率的荧光光子。比如对
NADH酶，在单光子激发情形下，需在350 nm的光激发下
产生450nm 的荧光。而在双光子激发情形下，可采用光 损伤较小的红外或近红外光，如700nm 的激光来激发得 到的450 nm荧光。
双光子荧光探针的种类
阳离子探针
镁离子探针，由pond等在2004年合成，这些 探针对离子的选择性差，在水中不能络合镁离子 钙离子探针，由Kim等在2004年合成,是ICT探针，
在水中不能络合钙离子，不能用于荧光显微镜
基于ICT铅离子探针，由Ahn在2005年合成，锌 离子有干扰作用，不能在水中应用 基于RET铅离子探针，探针络合了铅离子后， 荧光增强5倍，探针的选择性比较好，唯一的干扰是铝离子。 但由于水溶性差，不能在水中络合铅离子。
世界上最小的动物模型：纳米牛
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双光子吸收在微纳米加工中的应用
世界上最小的微纳机械
Appl Phys Lett, 2001, 78(2): 249—251
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展具有重要的意义
双光子诱导发射荧光 (TPF)探针— 线粒体成像
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9B-HVC
MTO
合并
3-（1-羟乙基-4-烯基吡啶碘盐） -N-正丁基咔唑（ 9B-HVC ）水溶液中本质上 是非荧光的，仅仅在线粒体环境中积累就会发出荧光。 9B-HVC是一种潜在的 线粒体双光子荧光探针。
双光子荧光产生原理：荧光分子吸收第一个光子后，跃迁 到虚能级上，该能级仅能存在几飞秒，便自动返回基态， 第二个光子必须在这几飞秒内与虚能级上的分子作用，从 基态跃迁到激发态，能量较大的激发态分子,通过内转换
使自己回到最低电子激发态的最低振动能级。处于此能级
的分子不是通过内转换的方式来消耗能量，回到基态，而 是通过发射出相应的光量子来释放能量，回到基态的各个 不同的振动能级时，就发射荧光。
目录
1.研究背景
2.基本原理
3.特点及优点
4.应
用
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1 双光子荧光背景介绍
双光子吸收是指在强光激发下,介质分子同时吸收两 个光子,从基态跃迁到两倍光子能量的激发态的过程。 早在1931年, Gppert Mayer 就在理论上预言了双光
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2 双光子荧光基本原理
2.1 单、双光子荧光的介绍
• 在一般的荧光现象中，由于激发光的光子密度低，一个荧 光分子只能同时吸收一个光子，再通过辐射跃迁发射一个 荧光光子 ，就是单光子荧光。
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1990年,美国康奈尔大学Denk等提出将双光子激发现 象应用到共焦激光扫描显微镜中,开辟了双光子荧光显微 和成像这个崭新的领域。
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近年来,有机双光子吸收材料在诸多领域 ,尤其 是双光子荧光显微和成像中的应用得到了广泛的关
双光子共焦激光扫描荧光显微镜
是以光学系统的共焦成像为基础, 利用光扫描技术和样品扫描技术 对样品进行三维动态测量的装置. 共焦小孔的存在,探测器只接收来 自物镜焦点处的信息,焦点以外的 光将全被共焦小孔屏蔽
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注。设计和合成双光子吸收截面大和上转换荧光强
的有机分子能大大促进双光子荧光显微成像在生物 系统中的应用 ,包括单分子检测、免疫测定、 DNA 片
断测定、化学和生物传感器、生物微芯片、毛细管
分离检测等。 在大量的实验和理论研究基础上,人们总结出有 机双光子吸收材料的一些结构-性能关系,提出了许 多行之有效的设计及合成策略,大大推动了双光子吸 收应用的发展。
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2.2 双光子吸收的示 意图
• 图 (a) 为单光子激发过程。在激 光照射下，基态分子或原子吸收 一个光子后成为激发态 ，随后 又弛豫到某一基态，同时以光子 形式释放能量而发出荧光。这一 过程就是单光子激发。 当使用光波长为图 (a) 中激发光 波长两倍的光，对相同物质进行 激发时，由于所使用光波的光子 能量仅为原来的一半，无法通过 单光子过程使基态电子激发到激 发态。只有在光子密度极高的情 况下，基态的电子可以同时吸收 两个光子，使处于基态的电子跃 迁至激发态，这种现象如图 (b) 所示。
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3.2 优点
• (4)双光子荧光可以避免普通荧光成像中的荧光漂 白问题和对生物细胞的光致毒问题；
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图2a 双光子吸收 图2b 单光子吸收 S 单重态能级 T 三重态能级 V 虚拟中间态 hv 吸收光能量 Fl 荧的