ctDNA在肿瘤诊断和预后应用的研究进展_郑玲杰

中国临床药理学与治疗学 2016 May； 21（ 5）
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涉及肿瘤微转移疾病的晚期患者虽然含有较少的 ctDNA 片段，但是随着检测技术的提高，对其进行 定量定性分析也日益成为可能［17］。 4． 1 预后评估 4． 1． 1 预后评估 评估不同病人的预后需要结 合临床观察、分期和组织病理学和生物分子特征 等。这些从影像和活检标本中得到的信息，帮助 临床医生对肿瘤的疾病进展做出准确的判断。对 于那些组织切片不易获得或者保存的组织切片基 因分析遇到问题时，液体活检的重要性就凸显出 来了。
1 中南大学湘雅医院临床药理研究所，长沙 410008，湖南； 2 中南大学临床药理研究所遗传药理学湖南省重点实验室，长沙 410078，湖南
摘要 循环肿瘤细胞、循环肿瘤 DNA 和外泌体的 检测并称为液体活检，这些可以检测和量化肿瘤 突变的技术在肿瘤的临床治疗中的作用越来越受 到重视。来源于肿瘤细胞的游离 DNA 被称为循 环肿瘤 DNA。最近，对核酸分析的敏感性和准确 性的最新研究进展为在肿瘤中找到体细胞基因变 化的游离 DNA 提供了依据。本文综述了循环肿 瘤 DNA 检测在临床中的应用及其局限性。 关键词 循环肿瘤 DNA； 肿瘤标志物； 肿瘤诊断； 预后
1 ctDNA 的发现和生物学特性
循环游离 DNA（ circulating cell-free DNA，cfDNA） 是一种胞外 DNA，存在于血液、脑脊液等体 液中，以单链或者双链 DNA、DNA 蛋白质复合物 等形式存在，大小为 150 ～ 210 000 bp，片段之间 差异较大［2］。1948 年 Mandel 和 Metais［3］首次发 现人体血液中存在着游离形式的 DNA。癌症患 者的循环 DNA 则发现于 1977 年。鉴于肿瘤 DNA 能流入血液，卢煜明教授推断胎儿 DNA 应该也能 进入血液，并成功证明了孕妇血液中携带着男性 胎儿的 Y 染色体［4］。该发现使在怀孕初期可通 过无创方式检测胎儿性别，筛查唐氏综合症等发 育疾病。每个人体内代谢凋亡的细胞都会释放 DNA 进入血液循环系统［5］。对于癌症患者而言， cfDNA 不单来源于上述途径也来源于脱离肿瘤组 织入血的 CTC，这种来源于肿瘤细胞的 DNA 被称 为循环肿瘤 DNA。
4 ctDNA 在临床上的应用
在过去几 年 有 很 多 关 于“生 物 标 记 物 ”的 研 究。这些生物标记物是疾病复发、疾病进展或死 亡的指示 因 子［36］。 虽 然 还 没 有 批 准 液 体 活 检 在 临床上的应用，但正在进行的研究显示 ctDNA 在 未来临床应用上存在着巨大价值的可能。大量的 研究数据调查显示，ctDNA 在 IV 期患者的检查中 敏感性似乎是接近 100% 。 ［8，7，23］ 早期患 者 或 是
ctDNA 的片段大小一般为 166 bp［6］。基于不 同的 研 究 结 果，其 半 衰 期 为 16 min ～ 2 h 不 等［7-8］。目前认为血浆核酸酶是清除循环 DNA 的 关键酶，但其对 DNA 蛋白复合体作用有限，因此 以复合体 形 式 存 在 的 循 环 游 离 DNA 可 免 于 降 解［9］。由于健康 人 体 内 巨 噬 细 胞 和 溶 酶 体 的 清 除作用，使其血液中的 cfDNA 含量维持在较低水 平［10］。肿瘤细胞以指数增长方式倍增，因此细胞 的代谢、凋亡和坏死也以同样的方式进行。大量 癌细胞的播散及坏死所释放的核酸超出了机体正 常的清除能力，导致癌症患者的 cfDNA 比健康人 的高。研究发现，正常人血中 cfDNA 含量极少， 多为 1 ～ 100 μg / L，平均30 μg / L。肿瘤患者血中
随着 DNA 测序技术的快速发展，已实现对痕 量 DNA 分子进行定量分析。目前用于 ctDNA 检 测的技术 有 BEAMing［8］，数 字 PCＲ［20］，cold-PCＲ （ co-amplification at lower denaturation temp raturePCＲ） 和 ［21］ MAP （ MIDI-Activated Pyrophosphorolysis） ［22］等。BEAMing 技 术 是 利 用 磁珠 来 吸 附 游 离 DNA，它可以从 1 万个健康细胞 DNA 中检测 出那一个 ctDNA 分子。数字基因组方法对晚期 肿瘤有较高的敏感性，在很多研究中其在肿瘤组 织中 发 现 的 突 变 都 和 ctDNA 部 分 突 变 是 一 致 的［8，17，23］。近期，以 PCＲ 技术为基础的下一代序 列（ NGS） 还能从复杂的 DNA 混合物中识别出罕 见的突变。Bettegowda C 等［24］针对不同类型的肿 瘤采用了突变特异性探针结合 / PCＲ、SafeSeqS、外 显子测序等不同的检测方法以确定 ctDNA 的存 在。由 Stanford 大学医学院研究出的 CAPP-Seq （ 深度测序肿瘤个体化建档法，cancer personalized profiling by deep sequencing） 具有高敏感性，在 II ～ IV 期 的 NSCLC 中 检 测 ctDNA 的 敏 感 性 为 100% ，可 以 检 测 到 比 例 低 至 0． 019% 的 ctDNA［25］。这些技术不仅拓展了检测单点突变的能 力，还可以在同一样本中研究多个目的基因的扩 增、重排以及非整倍体［26-31］。
循环肿瘤细胞（ circulatingtumor cells，CTC） 是 从实体肿瘤脱离进入血液循环的肿瘤细胞。CTC 具有很强的活力，有抗脱巢凋亡活性，并有侵袭和 转移的潜能。研究已经发现 CTC 的数量、携带的 基因信息和肿瘤的预后密切相关，同时它是恶性 肿瘤 术 后 复 发 和 转 移 灶 出 现 的 重 要 原 因［35］。 ctDNA 和 CTC 有相关性，而且与 CTC 相比，ctDNA 和肿瘤负荷的关系更亲密［29］。Johns Hopkins 的研究小组发现，当同时检测到 ctDNA 和循环肿 瘤细 胞 时，ctDNA 的 数 量 是 循 环 肿 瘤 细 胞 的 50 倍。能够检出循环肿瘤细胞的就一定会检出 ctDNA，但是检出 ctDNA 的，却未必能找到循环肿瘤 细胞［24］。因此，ctDNA 在数量和灵敏度上比循环 肿瘤细胞更适合成为癌症的生物学指标。
3 ctDNA 检测技术的优势
虽然组 织 标 本 病 检 是 临 床 研 究 测 序 的 金 标 准，但除其侵入性、不方便、费用高等特点外，更重 要的是伴随有临床并发症［32］。此外，大多数肿瘤 组织是保存在福尔马林固定石蜡包埋块（ FFPE） 里的，福 尔 马 林 易 造 成 DNA 交 联，这 种 交 联 的 DNA 易随机降解，从而导致后续研究工作受限。 组织活检的另一个限制因素是异质性。患者体内 的转移癌与原发灶完全不同，即使同一个组织中， 所有肿瘤细胞共有的突变大约 只 占 1 /3［33］。故 组织活检如管中窥豹，不足以准确诊断癌症。
中图分类号： Ｒ968 文献标志码： A 文 章 编 号： 1009-2501（ 2016） 05-0595-06
肿瘤治疗前需有一个明确的组织学或细胞学 诊断才能选择有效地治疗方式。目前常用的活检 方式属于侵入性及获得的疾病信息具有局限性等 缺点。近年来，随着肿瘤分子生物学研究的进展， 具有微 创、可 重 复 性 等 优 势 的 新 一 代“液 体 活 检”—血浆游离循环肿瘤 DNA（ Cell-free Circulating Tumor DNA，ctDNA） 在肿瘤的诊断、治疗及预 后检测等方面开始发国临床药理学与治疗学 中国药理学会主办
CN 34-1206 / Ｒ，ISSN 1009-2501 http： / / www． cjcpt． com
2016 May； 21（ 5） ： 595 － 600
ctDNA 在肿瘤诊断和预后应用的研究进展
郑玲杰1，2 ，刘舒1，2 ，王春阳1，2 ，谭志荣1，2
在一个多变量分析中，246 个晚期非小细胞 肺癌患者统一接受一线治疗方案后，血浆中检测 到 KＲAS 突变的个体呈现出一个较差的预后效 果［37］。Dawson 等［29］ 首 次 报 道 了 ctDNA 在 乳 腺 癌患者 预 后 监 测 中 的 应 用。该 研 究 采 用 数 字 PCＲ 和 全 基 因 组 测 序，对 30 例 携 带 TP53、 PIK3CA 基因突变患者治疗过程中的的 ctDNA 水 平全程监控发现，ctDNA 的动态变化与患者术后 效果呈现一致性。在一个对 44 名胰腺癌患者血 液游离 DNA KＲAS 突变检测与预后关系的研究 发现，KＲAS 突变的患者与 KＲAS 野生型患者之 间的生存率差异有统计学差异（ 6 个月生存率比 为 17% ∶ 41% ，12 个月生存率比为 0% ∶ 24% ） 。 ［38］ 4． 1． 2 追踪微小残留病灶 ctDNA 另外一个潜 在的应用就是可以探测外科手术或药物治疗后疾 病的复发。目前，病人术后采用放射影像学监控 疾病是否复发。这种方法价格昂贵且不能频繁使 用。此外，影像学在检测微小转移灶的敏感性还 不够高。Diesel 等［8］研究发现，通过监测大肠癌 患者 术 后 血 浆 中 肿 瘤 特 定 基 因 APC、TP53 和 KＲAS，预 测 疾 病 复 发 的 敏 感 性 和 特 异 性 达 到 100% 。循环肿瘤 DNA 还可用来追踪乳腺癌微小 残留病，为乳腺癌的复发提供线索。研究监测了 55 名早期乳腺癌患者手术前后及化疗过程中血 液 ctDNA 的变化。治疗后血液 ctDNA 呈阳性的 患者比 ctDNA 呈阴性的患者复发率高 12 倍，且 在复发前 8 个月即可检测到 ctDNA［39］。此外，癌 细胞休眠是很多癌症的一个共同特征，包括乳腺 癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤等，很难用常规方 法检测该阶段的病情［40］。在对 50 名乳腺癌患者 的研究中发现，通过追踪比较病人血浆中术前和
2016-03-05 收稿 2016-04-19 修回 长沙市科 技 局 一 般 平 台 项 目 （ K1403075-61 ） ； 研 究 生 创 新 课 题 （ 2016zzts522 ） ； 国 家 重 大 新 药 创 制“ 十 二 五 ”实 施 计 划 （ 2012ZX09303014-001） 郑玲杰，女，硕士研究生，研究方向： 遗传药理学和临床药理学。 Tel： 18373115527 E-mail： 18373115527@ 163． com 谭志荣，通信作者，男，硕士生导师，副研究员，研究方向： 遗传药 理学和临床药理学。 Tel： 13907496238 E-mail： tanzr@ 163． com