流式细胞术原理及应用
流式细胞术及其应用(1)
血小板检测指标：
质膜糖蛋白：CD41/CD61（gpⅡb/Ⅲa）、
CD42b(GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ)
颗粒膜糖蛋白：CD62P、CD63、TSP。
活化：gpⅡb/Ⅲa复合物—活化早期标志物
CD62P—活化后期的表面标志
血小ห้องสมุดไป่ตู้抗体（PAIgG）。
网织血小板计数：常用染料为TO。
应用 血小板无力症诊断：
而现代流式细胞术，更是由于结合 了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定 量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、 临床医学、药物学等众多研究领域的应 用将会越来越广泛。
五、流式样品的制备中应注意的几个问题
㈠荧光素和抗体的选择
⒈荧光素的选择：现在国内引进的大多数流式 细胞仪只装有一个激光光源，即488nm光源，所以 我们在选择荧光素时要选择能被488nm激光激发的 荧光素，常用的荧光素有：
选择纯度高的抗体、用同型对照抗 体或双标记排除非特异荧光
在细胞生长状态良好时测试、避 免反复吹打
彻底消化、在用酒精固定细胞时 加入终浓度为1.5-3％的小牛血清
一、 流式细胞术的概念
流式细胞术（FCM）就是对在高速 流动的鞘液包括下的细胞、粒子进行分 析和分选的技术，这种细胞或粒子是经 过特异荧光标记的。其特点是测量速度 快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞， 且可进行多参数测量，另一特点是在分 析的同时可把具有指定特征的细胞分离 出来，这就是分选技术。
FCM(Flow Cytomytry 流式细胞术)
流式样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题
原因
解决对策
细胞密度低 制备过程中细胞损失 增加离心时间、吸弃上清
非特异荧光强 碎片多
细胞聚集
荧光弱
流式细胞术之基本原理及运用
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1.3 流式细胞术光信号检测
光信号的类型 • 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 – 前向散射光(forward scatter, FSC); – 侧向散射光(side scatter, SSC).
• 荧光信号
– 自发荧光 ：微弱 – 特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍。
FITC、Alexa Fluor 488 PE PI PE-Cy5、PerCP APC、AF647
FL3
FL4 640 FL10
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同； • 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
流式细胞仪的发展及商品化
• • • • • • • • 1934 Moldavanl: First try (固定式细胞分析-流动式)； 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统(解决难题)； 1956 Coulter原理(血细胞计数器)； 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用； 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置； 1969 Vandilla等: 第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)； 1972 斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)； 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流 式细胞仪-FACS Ⅰ。 • 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。
• 光路系统
– 激发光源 – 光束收集系统
• 电子系统
– 光电转换器 – 数据处理系统
流式细胞术原理及应用
流式细胞术原理及应用
流式细胞术是通过一种名为流式细胞仪的仪器完成的，它能够以非常
高的精确度进行分析和检测。
流式细胞仪通过一根轴，从这个轴上有三根
弹性管，细胞进行注射，从而使细胞在管中行进，细胞同时也受到外界信
号的影响，这种信号可以来自磁场、电场或光场。
当细胞运行到仪器的另
一端时，它们会被照亮，通过一台摄像机可以拍摄到高清晰度的照片，然
后在计算机上进行分析处理。
流式细胞术广泛应用于早筛检、医学诊断、药物发现、药理学实验和
抗生素耐药性研究等方面，它能够更加精确、快速地进行细胞分析。
此外，流式细胞术也可以用于分析抗原抗体，免疫细胞介导的反应，以及细胞因
子如细胞因子和表面受体等的表达情况。
这种技术还可以用来监测血液中细胞水平的变化，如血小板、红细胞、白细胞等。
流式细胞术分析的工作原理及应用
流式细胞术分析的工作原理及应用1. 工作原理流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域的细胞分析技术。
它基于细胞在流式细胞仪中通过单个细胞传感器单元的原理，可以实时、快速地检测和分析细胞的各种特性。
1.1 流式细胞仪原理流式细胞仪是流式细胞术分析的核心工具。
它将细胞悬浮液注入到一个窄小的液流中，并通过雷射束（Laser Beam）对细胞进行激发。
当细胞经过激发光束时，会发射出特定波长的荧光信号。
流式细胞仪通过光学设备收集并分析这些信号，从而获得关于细胞的信息。
1.2 细胞荧光标记在流式细胞术分析中，细胞通常会被标记上特定的荧光染料，以便测量其特定特征。
这些标记可以是单一的，也可以是多重的，用于同时分析多个参数。
1.3 数据分析流式细胞仪在测量细胞荧光信号的同时，还会记录细胞的大小、形状和荧光强度等参数。
这些数据可以通过特定的软件进行分析和解释，以获得关于细胞数量、细胞类型和细胞功能等方面的信息。
2. 应用领域流式细胞术分析具有广泛的应用领域，在生物医学研究和临床诊断中发挥着重要作用。
2.1 免疫学研究流式细胞术在免疫学研究中广泛应用，可以用于分析免疫系统中不同类型的细胞数量和功能。
通过对白细胞表面标记物的检测，可以检测特定细胞亚群的存在，并研究其在疾病和免疫反应中的作用。
2.2 肿瘤学研究流式细胞术在肿瘤学研究中也扮演重要角色。
它可以用来研究肿瘤细胞的增殖、存活和死亡等关键特性，进而评估药物治疗对肿瘤细胞的影响。
此外，流式细胞术还可以检测循环肿瘤细胞，从而提供肿瘤早期诊断和治疗监测的手段。
2.3 微生物学研究流式细胞术被广泛应用于微生物学研究中，可以用于分析微生物的数量和生物学特性。
通过对细菌、真菌和病毒等微生物的荧光标记，可以确定它们的种类、数量和活性，从而研究其生长规律和致病机制。
2.4 干细胞研究流式细胞术在干细胞研究中也扮演重要角色。
流式细胞术原理及应用
流式细胞仪构造图
流式细胞仪五大系统
• 流动室与液流驱动系统 • 激光光源及光束成形系统 • 光学系统 • 信号检测与分析系统 • 细胞分选系统
流动室与液流驱动系统
1.空气加压进样 2.蠕动泵精确定量进样
流动室，430×180um,鞘液
细胞因子 核酸含量
胞内抗原
医学应用
HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病
科研应用
在免疫学研究中的应用: • 鉴定免疫细胞类型 • 抗原特异性T细胞研究 • 细胞因子分泌细胞研究 • 全血细胞研究 • 凋亡检测 • 细胞增殖检测 • 干细胞向免疫细胞分化的研究 • 转染荧光蛋白细胞系研究 • 稀有细胞检测 • 。。。
流式细胞术原理及应用
一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造
二、怎样设计流式实验？ 三、流式实验中涉及到的关键步骤 四、常见流式细胞术应用
一、流式细胞术基本概念
• 流式细胞术（Flow Cytometry）是对于处在快速直 线流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量 分析和分选技术.
• 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合 成微球等。
补偿调节方法：
FL-2(PE)
FL-2(-)
FL-1(FITC)
FL2 - %FL1
FITC 单标
FL-1(-)
FL1 - %FL2
PE 单标
FL-ation
FL-1(FITC)
FL-1(FITC)
简述流式细胞术的原理与应用
简述流式细胞术的原理与应用一、流式细胞术的原理介绍流式细胞术（Flow cytometry）是一种利用流式细胞术仪（Flow cytometer）对单个活细胞进行多参数分析的技术。
它基于细胞的光学性质和生物化学特性，通过探针标记、荧光染料和细胞表面抗原的相互作用，对细胞进行高速连续检测和分离。
流式细胞术的原理如下：1.细胞悬浮和样本处理：将细胞样品作为悬浮液，通过离心等方法将细胞分散在液体中，去除细胞的团块和碎片，保证单个细胞的流式检测。
2.细胞标记：采用流式细胞术特定的探针和染料对细胞进行标记，以便后续检测和分析。
常用的标记方法包括荧光染料标记、抗体标记和细胞分子探针标记。
3.细胞分离和传送：将标记的细胞悬浮液通过流式细胞术仪，以流速每秒数千个细胞的速度单个分子传送到探测点。
4.光散射与荧光探测：细胞经过流式细胞术仪后，以激光束照射细胞，通过散射光和荧光信号的检测，对细胞进行空间分布和化学信息的获得。
5.数据采集与分析：通过计算机系统采集和记录细胞经过流式细胞术仪后所产生的光散射和荧光信号，在分析软件中对数据进行处理和解读，获得有关细胞的信息。
二、流式细胞术的应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术，它在细胞学、免疫学、血液学、肿瘤学等领域有着重要的应用价值。
下面列举几个流式细胞术的应用示例：1.血液学研究：流式细胞术结合细胞表面标记和荧光染料标记，可以对血液中的不同细胞类型进行快速的鉴定和数量分析。
例如，通过流式细胞术可对血液中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等进行分类和计数，从而判断患者的免疫状态和疾病进展。
2.癌症诊断与治疗：流式细胞术对肿瘤细胞的检测和分析有着重要的作用。
通过流式细胞术，可以检测和定量肿瘤细胞的表面抗原和细胞内信号分子，进一步了解肿瘤细胞的类型、分化程度和增殖状态，为癌症的诊断和治疗提供指导。
3.免疫学研究：流式细胞术能够对免疫系统中的各种细胞类型进行鉴定、计数和功能分析。
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞术分析及应用
Compensation
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二、流式细胞术的应用
细胞表型分析 胞内蛋白的检测 细胞周期分析 细胞因子测定 分选 细胞内钙离子测量 ……
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1.细胞表型分析
CD3 20
CD4
2.胞内蛋白的检测
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3. 细胞周期的检测
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CFSE（羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂）
Capture antibody Beads
Capture beads
+
+
Antigen (cytokines) Fluorescence Detector antibody
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Beads Provide a Flexible Platform
Beads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometer
Shades of a color
Antibody coupled PE label, emitting at FL2 intensity proportional to analyte conc.
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Example 6-bead assay
IL-8 IL-1b
IL-6 IL-10 TNF
Detector Antibodies
3
现代流式细胞仪包括
液流系统
聚焦细胞以供检测
光学系统
激发和收集光信号
电子系统
将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计 算机分析
4
液流系统
液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处
5
Sample Flow in Optical CuRate
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流动室与液流驱动系统
1.空气加压进样 2.蠕动泵精确定量进样
流动室，430×180um,鞘液
Injector Tip Sheath
fluid
Fluorescence signals
Focusedbleaasmer
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激光光源与光束成形系统
1.氩离子气体激光器，22×66um 2.固体激光器 405nm, 488nm,561nm,635nm
? FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值 。
5%
默认阈值
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32%
升高阈值后
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荧光信号
?细胞自发荧光 ?特异荧光素标记激发的荧光信号 ?荧光信号的线性测量和对数测量---光电倍增管
1）检测光子，转换成电信号 2）将电信号等比例的放大 ?荧光信号的面积、宽度和高度
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? 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
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粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
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? 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
? 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合 成微球等。
? 对生物颗粒的物理参数及生物学特性进行定性和定量 分析。
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流式细胞仪构造图
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流式细胞仪五大系统
? 流动室与液流驱动系统 ? 激光光源及光束成形系统 ? 光学系统 ? 信号检测与分析系统 ? 细胞分选系统
流式细胞术原理及应用
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一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造
二、怎样设计流式实验？ 三、流式实验中涉及到的关键步骤 四、常见流式细胞术应用
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一、流式细胞术基本概念
? 流式细胞术（ Flow Cytometry ）是对于处在 快速直 线流动中的细胞和生物颗粒进行 多参数、快速的定量 分析和分选技术 .
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光学系统
透镜、滤光片、小孔； LP：long-pass filter BP：band-pass filter
460 500 540
SP：short-pass filter
LP 500Βιβλιοθήκη SP 500BP500/50
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信号检测与分析系统
物理参数 ?FSC：前向角散色光， 代表细胞大小 ?SSC：侧向角散色光，代表细胞颗粒度
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? 由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信 号的放大可以使用线性或对数两种方式。
? 一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大 ，多使用对数放大。
?线性测量：DNA 含量、RNA 含量、总蛋白含
量
?对数测量：细胞膜表面抗原检测
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直方图（Distribution Histogram） 散点图（Dot Plot）
?横坐标：道数
?横坐标：某细胞参数
?纵坐标：细胞数
相对含量
?纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
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