SELDI蛋白质芯片筛选差异蛋白分子的二级鉴定ppt_图文.ppt
SELDI
SELDI蛋白质芯片技术传统蛋白质研究的方法如色谱分离纯化技术、二维电泳、质谱等方法因操作过程繁锁、耗时冗长、重复性差、检测样本量小等缺点而不适合对蛋白质开展大规模的筛选研究，蛋白质组学研究迫切需要一种高通量、快速、全自动化的用于对批苗蛋白质进行快速研究的仪器。
SELDI蛋白质芯片技术，又称为表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)。
自2002年日本科学家田中耕一因发明该技术而荣获诺贝尔化学奖后。
该技术发展十分迅速，目前已经广泛应用于生物技术、药学、基因学、临床诊断、生物信息等诸多领域。
其在临床实验诊断学中的主要工作原理是利用蛋白质芯片(proteinchip)和表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱仪对体液中各种蛋白质．包括疾病早期最微小基因表达产物如低分子量蛋白质、多肽等。
进行动态、全景的分析。
获得待检标本中各种蛋白的含量及其分子量等信息，绘制成蛋白质指纹图谱。
再通过计算机软件将正常人、亚健康状态人群、良性疾病和癌症病人的指纹图谱库对照。
比较分析差异。
就能快速、敏感和特异地发现和捕获新的与疾病相关的蛋白。
目前发现通过SELDI蛋白质芯片技术所获得的生物标记物．大多是特异性肿瘤微环境所产生的低分子量的蛋白质，通过对多种肿瘤的检测表明。
其敏感性和特异性均优于传统的肿瘤标记物．对某些肿瘤的敏感性已达到100％。
特异性也超过95％。
因而该技术能在肿瘤早期诊断中具有很重要的临床应用价值。
1 SELDI-TOF-MS系统的组成1.1蛋白质芯片又称蛋白质微阵列(protein mieroarray)。
把制备好的蛋白质样品固定于经化学修饰的玻片或硅片等载体上。
蛋白质与载体表面结合。
同时仍保留蛋白质的理化性质和生物活性，可以高效地大规模获取生物体中蛋白质的信息。
最新第七章---蛋白质检验PPT课件
（一）血浆蛋白质的功能：
①营养作用，修补组织蛋白; ②维持血浆胶体渗透压：白蛋白维持75%～80%的血浆渗透压； ③作为PH缓冲系统的一部分：酸性或碱性蛋白质； ④运输作用：作为激素、维生素、脂类、代谢产物、离子、药物等的载 体； ⑤体液免疫防御系统：抗体与补体等免疫分子； ⑥催化作用：酶的本质； ⑦代谢调控；作为底物、酶或中间产物抑制、激活组织蛋白酶； ⑧参与凝血与纤维蛋白溶解；除Ⅳ因子外均可。
第七章---蛋白质检验
本章内容概要：
第一节 概述 第二节 蛋白质检验
2
本章教学要求：
1、掌握血浆蛋白质的组成、功能及分类；个别血浆蛋白质（前 白蛋白、白蛋白）的来源和生理功能；血清总蛋白和白蛋白的 测定方法和原理。 2、熟悉急性时相反应蛋白的概念和种类；血清球蛋白和纤维蛋 白原的测定方法
3、了解其他蛋白质的来源和生理功能；尿液蛋白和脑脊液蛋白 的检测 。
7
（二）血浆蛋白质的分类： 数血浆蛋白质 其他组织细胞生成：免疫球蛋白和蛋白类激素
8
1.根据分离方法分类
盐析法：白蛋白和球蛋白（pH7.0半饱和的硫酸铵溶液）
醋酸纤维素薄膜电泳：5种
分
电泳法： 琼脂糖凝胶电泳：13种
辨 率
聚丙烯酰胺凝胶电泳：30种
16
（四）α1-酸性糖蛋白（AAG/α1-AG） 急性时相反应蛋白
结构：181个aa残基构成的单链多肽， MW=4万，含45% 的糖，其中唾液酸占11%－12%。
理化性质：pI 值2.7－3.5，肝合成，脓毒症时粒细胞和单核 细胞及某些肿瘤组织也可合成。 位于α1-球蛋白区带。
测定方法：免疫化学法（扩散,浊度）,化学法（间接法）， ELISA法等。
增
SDS聚丙烯酰胺凝胶等电双向电泳：300种 高
最新21差异蛋白汇总
21差异蛋白SELDI蛋白质芯片筛选差异蛋白分子的二级鉴定摘要目的探讨以SELDI蛋白质芯片筛选后的细胞差异表达蛋白的分离和鉴定方法及其意义。
方法以经体外培养及10JAM褪黑素药物干预的内皮祖细胞差异表达蛋白质为研究对象，分别采用Tricine—SDS—PAGE和双向凝胶电泳方法进行差异蛋自分离及结果比较，以FTICR—MS二级质谱鉴定。
结果经Tricine—SDS —PAGE分离后，选取的分子量为53kDa左右的趋势性的差异表达蛋白进行FTICR—MS分析，质谱鉴定为微管蛋白一a3(吻合度评分为87)。
经双向凝胶电泳分离后，于凝胶近酸性端、分子量在72—95kD之间区域，选取蛋白表达量较高的一点，质谱鉴定其为人热休克蛋白90一Q(吻合度评分为91)。
结论在本文结果中，Tricine—SDS—PAGE对于大致35—70kDa范围的蛋白分离较清晰、重复性好，且样品用量少。
2-DE对最低上样量有较严格要求，但它能提供分子量、等电点双重参数来更准确定位所感兴趣蛋自点，且对较大分子量蛋白的分离效果更佳。
电喷雾傅立叶变换离子回旋共振高分辨质谱分辨率高且质量稳定性较好。
关键词：SELDI；Tricine—SDS—PAGE；双向凝胶电泳；质谱SELDI蛋白质芯片技术，即表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(surface—enhanced laser desorption／ionization—time of flight—massspectromet巧)，是蛋白质组学研究中的一项新兴技术，在识别特定蛋白质表达物、蛋自质差异分析、测定血清中小分子物质含量方面提供了新的思路与方法。
该技术已经逐渐应用与临床，目前已见其应用于传染病、肿瘤等疾病诊断筛选的临床报道【1,2】。
本课题组前文‘3，41研究建立了SELDI蛋白质芯片技术检测体外培养细胞蛋白质差异表达方法，发现与传统方法比较，SELDI技术对于5kDa以下的低分子量差异蛋白和低丰度的差异蛋白质的检出效果较佳，而且该技术具有高通量、上样量低和灵敏度高等优势。
《蛋白质II》PPT课件
多复肽合与物，Cu5S4O0n4碱m性处溶有液最反大应光，吸生收成。紫红色或蓝紫色的 为肽和蛋白质特有（两个或两个以上肽键），氨基酸
没有该反应。
天然活性多肽
定义：
在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋 白质的亚单位，但是，也有许多分子量比较小 的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有 特殊的生理功能，常称为活性肽
梭状芽孢杆菌蛋白酶（Arg蛋白酶） 专门裂解Arg殘基的COOH所形成的肽键，对不溶性 蛋白质的长时间裂解很有效
某氨基酰…..氨基酸
书写时氨基端在左边，羧基端在右边；以氨基酸的 三字缩写或单字缩写代表对应的氨基酸；用短横线 代表氨基酸残基之间的肽键
肽的物理化学性质
一般物理性质
短肽晶体、熔点很高（离子晶体、偶极离子） 肽的两性解离
决定于游离氨基末端、游离羧基末端以及侧链基团 肽链羧基的pK’比氨基酸的大一些，而氨基的pK’则
比DNFB法高100倍
苯异硫氰酸酯（PITC）法 氨肽酶法 ：
氨肽酶：可以从多肽链的N端逐个 降解氨基酸的肽链外切酶 亮氨酸氨肽酶（LAP）：水解以Leu为N末端的肽键速度为最
大
多肽C末端分析方法
肼解法
蛋白质or 多肽＋无水肼, C末端Aa以游离形式存在，其他 Aa转变为相应的Aa酰肼化物加入苯甲醛可以使Aa酰肼化 物转变成二苯基衍生物沉淀， C末端Aa则在溶液中。
是否有辅基或其他分子,连接方式
肽键
蛋白质是氨基酸通过脱水缩合形成肽键而形成的
实验证据
（1）蛋白质分子中游离的α-氨基，α-羧基很少。若水解，游离α氨基，α- 羧基以等mol数增加 →说明α氨基，α-羧基参与某种结 合，水解时，这种结合断开。 （2） 人工合成肽可以被蛋白酶水解
蛋白质芯片.ppt
的相互作用关系。
蛋白质芯片的关键技术
1
提出生物学问题
（实验目的）
2
蛋白质芯片制备
6
数据分析和建模
（图象量化，标准化，
采集蛋白信息，建立模型）
检测
（荧光和比色扫描或拍照， 参数设置）
5
样品预处理
3
（重组蛋白，制备一、二级抗体，
荧光标记，配蛋白印记缓冲液）
生化反应
化学偶合，加底物， 反应温度和时间， 冲洗条件
亲和结合 亲和结合
Agarose thin film 3D gel pad
扩散
蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需生物素化
蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需His x6标记
表面蛋白分布均一容量
无需蛋白修饰过程，高结合容量
制作难，未商品化
蛋白质芯片的应用
疾病诊断和预警 药物开发 蛋白质组学
加入His6-RB 加入含 PepC抑制剂的 His6-RB A 1500 个点阵的微阵列 B 局部点阵放大图及SPR信号 Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 4427–4431.
蛋白质组学 人动脉平滑肌细胞蛋白谱
4.7% 抗原（一组细胞-细胞间相 互作用分子）表达上调； 13.4%抗原（结构蛋白，体液响 应蛋白）表达下降
4
蛋白质芯片的制备
固相载体及其处理
载体（滴定板、滤膜、凝胶、载 玻片）
蛋白质的预处理
选择具有较高纯度和完好生物活 性的蛋白进行溶解
点制微阵列
可使用点制基因微阵列的商品化 点样仪或喷墨法等
固定微阵列上的蛋 白样点
膜为载体：芯片放入湿盒， 37°C 1h
应用SELDI-TOF-MS技术分析VKC泪液的差异表达蛋白
ｔ ｌ ｗｎ ｒ ｅ ｄ ｅ ｅ Ｊ ． ｃ ｅ ｄｎｓ２ １ ， （ ）３ － ． ｉ ｆｌ ｉ Ｇａ ｓ ｉ ａ ［］ Ａ ｔ Ｍ ｄ ｎ ｏｅ，００ ４ １ ：１ ５ ｓ ｏｏ ｇ ｖ ＇ ｓ ｓ ａ Ｉ ２ ３ ［ ］ 陈在君 ， ４ 蒋宁一． 治疗 甲亢后致 甲减 的研究 变迁 ［ ］ 国外 ”Ｉ Ｊ．
参考 文献
［ ］ 李少林 ， １ 张永学 ． 医学 ［ ． １版． 核 Ｍ］ 第 北京 ： 民卫生 出版社 ， 人
２ ０ ２ ４． ０ ４： ３
［ ］ Ｓ ｉ Ｒ，Ｓｎ ｅｓ ，ｕｍａｉ ． Ｓ ｅｅｔｒ ｔ ｏｉｓ［ ］ ２ ｍｔ Ｂ ｈ ａｄｒ Ｆ ｒ ｎａ Ｊ Ｔ Ｈ ｒｃｐｏ ｉ ｄｅ Ｊ ． Ｊ ｋ ｎ ａ ｂ
一
是Ｇ Ｄ患者”Ｉ 。 治疗后发生甲减 的主要预示 因子 ， 阳性 预告率 分别为 ９ ． ％和 ７ ．％。本文结果 显示 ， 治疗前 和治疗后 １６ ９５ ”Ｉ
６ 月 Ｔ Ａ和 Ｔ 个 Ｇ ＭＡ的 阳性 率 均较 高 ， 治 疗后 的 Ｔ Ａ和 且 Ｇ Ｔ ＭＡ值比治 疗 前升 高 ， 明在 Ｇ ａｅ 说 ｒ ｓ病转 归 过程 中， Ｇ ｖ Ｔ Ａ、
友射 免疫 学 杂 志 ２ １ 第 ２ ０ ２年 ５卷 第 ３期 Ｊｏ ａ ｉｍｍｕｏ ｇ２ １ ２ （ ｆＲ ｄｏ ｉ ｎｌ ｙ ７ — —
３ 讨 论
ＴＡ Ｒ ｂ是 自身免疫性 甲状腺疾病 （ ｕ ｉ ｍ ｎ ｙｏｄｄｓ ａｔ ｍ ｕ ｅｔ ｒｉ ｉ ｏ ｈ — ｅｓ ， ＩＤ 患者体 内常 见并 在其发病 机制 中起重 要作 用 的 ａｅ ＡＴ ） 种异质性多克 隆 自身抗体 ， 被认为是 Ｇａｅ 病 的主要致病 ｒｖｓ 因子 ｊ 。它与 Ｔ Ｈ一样 可促 进 甲状腺激 素 的合成 与 释放 ， Ｓ
蛋白质芯片技术.ppt
主要封闭试剂：BSA
（二）抗原抗体的固化
1 化学性固定
化学性配基包括疏水基团、阴离子、阳离子、金属 离子、混合离子等
2 生物性固定
生物性配基包括受体、配体、酶、抗体 -抗原等
（三）捕获分子
1 抗体
由于具有高度的特异性和亲和性，单克隆抗体是比较好的一 种探针蛋白质。用其构筑的芯片可用于检测蛋白质的表达丰 度及确定新的蛋白质。
（一）蛋白质芯片的制备
一 固相载体及其处理
载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）
二 蛋白质的预处理
选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解
三 点制微阵列
可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等
四 固定微阵列上的蛋白样点
膜为载体：芯片放入湿盒,37°C 1h 载玻片为载体：化学修饰产生醛基固定蛋白
1 以质谱技术为基础的直接检测法
如表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术 (SELDI-TOFMS),可以使吸附在芯片表面的靶蛋白离子化,在电场力的作 用下飞行,通过检测离子的飞行时间计算出质量电荷比,用以 分析蛋白质的分子量和相对含量。
2 蛋白质标记法
常用的芯片信号检测是将芯片置入芯片扫描仪中,通过采集 各反应点的荧光位置、荧光强弱,再经相关软件分析图像,即 可以获得有关生物信息。
特点
可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用； 很容易蒸发；不适合用于多步反应；造价便 宜；容量较小；容易发生交叉污染
可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用； 不易蒸发；可以用于多步反应，但是有其较 固定的缓冲条件；造价昂贵；容量较大；不 易发生交叉污染
微孔板上构建的 可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用； 蛋白质芯片 不易蒸发；适用于多步反应；造价便宜；容 量较大；不易发生交叉污染
质谱分析技术-PPT课件
2）SELDI-TOF MS Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization 表面增强激光解吸附离子化 MW: 2,000-50,000
3）MS/MS Tandem MS串连质谱技术 MW: 200-3,000
1）MALDI-TOF MS （原理示意图）
The following components are ACCEPTABLE Acetic or formic acid, Acetonitrile, ethanol,
Guanidine/HCl 4M,
Hexafluoroisopropanol up to 40%, Methanol, Sodium chloride 10 mM,
Urea 1M
八、质谱数据分析软件使用 （以Mascot为例） ExPASy Proteomics Tools
Matrix Science主页
PMF分析 MS/MS分析
GLSDGEWQQVLNVWGK VEADIAGHGQEVLIR LFTGHPETLEK HGTVVLTALGGILK KGHHEAELKPLAQSHATK GHHEAELKPLAQSHATK YLEFISDAIIHVLHSK HPGDFGADAQGAMTK ALELFR
ALELFR
最新21差异蛋白
21差异蛋白SELDI蛋白质芯片筛选差异蛋白分子的二级鉴定摘要目的探讨以SELDI蛋白质芯片筛选后的细胞差异表达蛋白的分离和鉴定方法及其意义。
方法以经体外培养及10JAM褪黑素药物干预的内皮祖细胞差异表达蛋白质为研究对象，分别采用Tricine—SDS—PAGE和双向凝胶电泳方法进行差异蛋自分离及结果比较，以FTICR—MS二级质谱鉴定。
结果经Tricine—SDS —PAGE分离后，选取的分子量为53kDa左右的趋势性的差异表达蛋白进行FTICR—MS分析，质谱鉴定为微管蛋白一a3(吻合度评分为87)。
经双向凝胶电泳分离后，于凝胶近酸性端、分子量在72—95kD之间区域，选取蛋白表达量较高的一点，质谱鉴定其为人热休克蛋白90一Q(吻合度评分为91)。
结论在本文结果中，Tricine—SDS—PAGE对于大致35—70kDa范围的蛋白分离较清晰、重复性好，且样品用量少。
2-DE对最低上样量有较严格要求，但它能提供分子量、等电点双重参数来更准确定位所感兴趣蛋自点，且对较大分子量蛋白的分离效果更佳。
电喷雾傅立叶变换离子回旋共振高分辨质谱分辨率高且质量稳定性较好。
关键词：SELDI；Tricine—SDS—PAGE；双向凝胶电泳；质谱SELDI蛋白质芯片技术，即表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(surface—enhanced laser desorption／ionization—time of flight—massspectromet巧)，是蛋白质组学研究中的一项新兴技术，在识别特定蛋白质表达物、蛋自质差异分析、测定血清中小分子物质含量方面提供了新的思路与方法。
该技术已经逐渐应用与临床，目前已见其应用于传染病、肿瘤等疾病诊断筛选的临床报道【1,2】。
本课题组前文‘3，41研究建立了SELDI蛋白质芯片技术检测体外培养细胞蛋白质差异表达方法，发现与传统方法比较，SELDI技术对于5kDa以下的低分子量差异蛋白和低丰度的差异蛋白质的检出效果较佳，而且该技术具有高通量、上样量低和灵敏度高等优势。
蛋白质序列二级结构的搜索ppt资料
– 最后一个桶：长度>=k的所有分区
– k=100:足够小;足够大 – 248,375蛋白质、10,288,769分区，13‘建立直方图，
query 优化器1ms/谓词，99%的分区占1.2KB空间
第十二页，编辑于星期五：十四点 三十一分。
–
第七页，编辑于星期五：十四点 三十一分。
3. 查询语言和例子
• 3类原子查询
– 3类二级结构（h、e、l）；成组出现；按类型 和长度表示二级结构序列
– 查询：分区谓词序列
第八页，编辑于星期五：十四点 三十一分。
4. 查询估计技术
• Complex Scan of Protein Table（CSP） • 普通分区技术
第五页，编辑于星期五：十四点 三十一分。
1.3 内容
• 定义了简单、直观的查询语言：基于分区的二
级结构查询
• 识别不同的算法，有效地估计查询。
– 由于查询和分区选择，算法选择对查询的执行有突出的 影响
• 查询优化框架：
– 基于查询和数据特征选择最优查询计划
– 直方图：精RDBMS上实现：
5.2 复杂直方图
• 整个query结果的选择，而不是给定的query谓词：
– 寻找同一个字符串里多属性以某个次序出现的概率。
– 单个属性、多个无序属性
• 4维矩阵
– Protein id
– Start position
– 长度
– 类型
– [3][4][7][2]代表第3个bucket的蛋白质的第4个bucket 的 开始位置<h 7 7>