神经生物学的常用研究方法PPT课件
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第四章递质和内源性活性物质
一.关于神经递质的研究概况 二.鉴定递质的条件 三.递质的类型 四.递质受体 五.各经典递质和内源活性物质的合成、
储存、释放、灭活 六.递质共存和共释放
教学ppt
1
一.神经递质和内源性活性物质的研究概况
1.1904，Elliott，冲动传导到交感神经末梢，可能从那 里释放肾上腺素，在作用于效应器细胞。
教学ppt
10
ionotropic R（促离子通道型受体） ： 受体本身不是独立的蛋白质，它的
一或二个亚基为受体的结合位点同时又 与另外亚基共同构成离子通道，此类受 体能引起通道的快速改变，产生兴奋性 或 抑 制 性 突 触 后 电 位 ， 在 1 ms 内 产 生 在 10ms内消失。 如：nAch受体，GABAA 受体，甘氨酸 受体和谷氨酸受体（3种促离子型受体， 1种促代谢型受体），它们介导了中枢和 周围神经系统的快速突触传递。
教学ppt
11
metabotropic R (代谢型受体)：
信号通过G蛋白介导的细胞内的生物化学反应， 这种反应类似于一种代谢反应。 促代谢型型受体: 7TM， 如 ： adrenergic R，1A，1B，2A，2B， 2C；1，2，3；
DA（D1-D5） 5HT （5HT1A，5HT1B，5HT 1D，5HT 1E，5HT1F，5HT 2A，2B，2C，3-5，6） Ach（M1，M2，M3，M4，M5）
Peptide-binding R: Adrenergic R: G protein-linked R: hormone R; photoreceptor Neurokinin A R Rhodopsin: light;in retinal rod cell;7TM super family;
一.关于神经递质的研究概况 二.鉴定递质的条件 三.递质的类型 四.递质受体 五.各经典递质和内源活性物质的合成、
储存、释放、灭活 六.递质共存和共释放
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一.神经递质和内源性活性物质的研究概况
1.1904，Elliott，冲动传导到交感神经末梢，可能从那 里释放肾上腺素，在作用于效应器细胞。
教学ppt
10
ionotropic R（促离子通道型受体） ： 受体本身不是独立的蛋白质，它的
一或二个亚基为受体的结合位点同时又 与另外亚基共同构成离子通道，此类受 体能引起通道的快速改变，产生兴奋性 或 抑 制 性 突 触 后 电 位 ， 在 1 ms 内 产 生 在 10ms内消失。 如：nAch受体，GABAA 受体，甘氨酸 受体和谷氨酸受体（3种促离子型受体， 1种促代谢型受体），它们介导了中枢和 周围神经系统的快速突触传递。
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metabotropic R (代谢型受体)：
信号通过G蛋白介导的细胞内的生物化学反应， 这种反应类似于一种代谢反应。 促代谢型型受体: 7TM， 如 ： adrenergic R，1A，1B，2A，2B， 2C；1，2，3；
DA（D1-D5） 5HT （5HT1A，5HT1B，5HT 1D，5HT 1E，5HT1F，5HT 2A，2B，2C，3-5，6） Ach（M1，M2，M3，M4，M5）
Peptide-binding R: Adrenergic R: G protein-linked R: hormone R; photoreceptor Neurokinin A R Rhodopsin: light;in retinal rod cell;7TM super family;
神经生物学研究常用方法
1.神经生物学研究的常用方法神经科学的发展与的研究方法的进步密切相关。
总体上，神经生物学的研究方法有六大类：形态学方法、生理学方法、电生理学方法、生物化学方法、分子生物学方法及脑成像技术。
7.1形态学方法神经生物学研究中常用的形态学方法有束路追踪、免疫组化和原位杂交，其他还有受体定位、神经系统功能活动形态定位等方法。
7.1.1束路追踪法追踪神经元之间的联系是神经解剖学研究中的重大目标，它对研究神经元的功能、神经系统的发育和成熟都具有重要意义。
这种方法学的建立始于19世纪末的逆行和顺性溃变（顺行溃变指胞体或轴突损伤后的轴突终末的溃变，逆行溃变指去除靶区之后神经元胞体的溃变）研究。
20世纪40年代主要手段是镀银染色法，根据变性纤维的形态变化来判断变性纤维。
20世纪50年代发展了Nanta法，能遏制正常纤维的染色而仅镀染出变性纤维。
但该法不易显示细纤维，1971年Kristenson等将辣根过氧化物酶（HRP）注入幼鼠的腓肠肌及舌肌结果在脊髓和延脑的相应部分运动神经元胞体内发现HRP的积累。
不久LaVail正式使用HRP作为轴突逆行追踪，以后遂广泛应用于中枢神经系统的研究。
HRP可被神经末梢、胞体和树突吸收，轴突损伤部分也可摄入。
在胞体内，HRP的活性可持续4~5天，在溶酶体内对联苯胺呈阳性反应而显现出来。
被标记的神经元可以清晰的显示胞体、树突及轴突。
除了HRP标记法，还有荧光物质标记法、毒素标记法、注射染料等方法。
7.1.2免疫组织化学免疫组织化学术是应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞内多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。
这种方法特异性强，敏感度高，进展迅速，应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。
近年随着纯化抗原和制备单克隆抗体的广泛开展以及标记技术不断提高，免疫组织化学的进展更是日新月异，不仅用于许多基本理论的研究，并取得重大突破，而且也用于疾病的早期快速诊断等临床实际。
神经生物学方法
GFAP-ir
40X
P75-ir
40X
原位杂交(IN SITU HYBRIDIZATION)
原位核酸分子杂交技术（In situ nucleic acid molecular hybridization)简称原位杂交技术。是 用标记的NDA或RNA为探针，在原位检测 组织细胞内待定核酸序列的方法。根据 所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可 分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNARNA杂交。
X40 NADPH-d Staining In Caudate Nucleus
NADPH
免疫组织化学 (Immunohistochemistry)
利用特异性抗体对神经组织中某种特异 成份(抗原)进行抗原--抗体反应,达到检 测组织细胞内是否有此特异性物质。其 本质就是用标记的抗体追踪抗原(以确定 组织细胞内的某种化学物质) 。
10×
40×
HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat
HRP labelling neurons in dLGN
X40
Double-labelling of HRP and
Glutamate in rat lateral geniculate nucleus
Immunohistochemical procedures
1.Tissuue preparation:perfusion,section 2.Blocking:封闭，异种蛋白质间会有非特异 性结合，常用正常羊血清（NGS）或牛血清白 蛋白（BSA）封闭。 3.Incubate in primary antibody:最佳浓度 需摸索，为提高抗体向组织内穿透，可在抗体 稀释液中加入0.1%～0.3%TritonX-100。需长 时间孵育时应加入0.01%～0.3%NaN3防腐。 产生一抗的动物一定要知道，以便选择二抗。
最新0神经生物学-绪论PPT课件教学讲义ppt
5. 生物芯片技术（biochip） 生物芯片技术是在1个平方厘米大小的薄型载体上，
通过微加工技术获得微米级结构，并与生物化学处理 等技术相结合而发展起来的一种新型技术。它可以把 多至几十万个的生命信息集成在一块芯片上，进行各 种与生命科学和医学相关的生物化学反应，对基因、 蛋白、活体细胞及组织等进行分析和检测。
免疫组织化学方法—把神经元的功能与其神经递质的 分析熔为一体。
组织培养、细胞培养—把复杂的神经元回路还原成简 单的单元进行分析。
新的电生理技术和分子生物学方法（重组DNA技术等） －神经信号发生、传递的基本单元-离子通道的结构、 功能特性及运转方式；神经递质的合成、维持、释放 及与受体的相互作用。
(2) 诱发电位有一定的类型，是由于诱发电极和记录 电极记录神经元群相对位置影响电位的波形。
(四)生物化学方法
1. 放射免疫法(radioimmunoassay, RIA)
用抗原－抗体反应原理，将抗原标记上放射性同位 素，用来测定与此抗原性质相同的物质。RIA包括以下 基本步骤：样品采集、加样、反应、分离、测定抗原－ 抗体复合物的放射性（cpm）, 与标准曲线对照计算待测 物质含量。
4. 基因敲除(gene knockout) 基因敲除是80年代初出现的一项新的基因工程技术。
采用同源重组的方法,用体外合成的无效基因或突变基因取 代相应正常基因,再应用转基因方法孵育出转基因动物,即 为基因敲除动物。通过分析基因敲除动物单基因缺陷来研 究基因调控、基因功能、建立疾病模型、药物作用及基因 治疗。
液中选择性地大量扩增某一种核酸分子的特定序列。该方法 具有极高的灵敏度和特异性，在含有多种杂质的条件下，可 选择性扩增细胞基因组中一个特定的DNA片段达数百万至数 千万倍。
神经生物学课程课件
N型受体： （烟碱受体）
周围型
骨骼肌/电器官烟碱受体 神经节烟碱受体
受体（Receptor） 能够对特定的生物活性物质具有识别、选择15性的结合能
力的生物大分子。
激动剂：能够与受体特异性的结合并产生生物效应的化学物质称为激动剂 （agonist）。
拮抗剂：仅能与受体发生特异性的结合，但不产生生物效应的化学物质称为 拮抗剂（antagonist）.
γ –氨基丁酸转位酶
2. reuptake
location and Projection
GABA 琥珀酸半醛
Receptor
location Structure,
Agonist, Antogonist,
GABAA
GABAB GABAC
CNS
CNS
视网膜
4TM 7TM
苯二氮，安定 荷包牡丹碱 苯巴比妥 ，利眠宁
location and Projection Pons，modulla oblongata Receptor
alpha1,alpha2,,beta1.beta2
5-羟色胺能神经系统
Biosynthesis
29
tryptophan,TP
tryptophan hydroxylase, TPH (色氨酸羟化酶)
苯乙醇胺-N-甲基转位酶
(phenylethanolamine-N-methyl-transferase，
PNMT)
肾上腺素(adrenaline, AD/epinephrine, E)
多巴胺能神经系统
23
Biosynthesis
Inactivation reuptake enzyme degradation（MAO，COMT） location and Projection
神经生物学(新版)课件：第六讲 神经科学研究技术
通过MR成像半定量 地测定体内某种代 谢物质的浓度，反 映活体内某些物质 的代谢过程。
正电子发射扫描（PET，Positron emission tomography）
The PET scanner detects metabolically active areas of the brain by picking up signals from a radioactive tracer injected into the subject before the procedure
任务激活磁共振功能成像 (task-activated fMRI)
Holdsworth SJ, Bammer R. Magnetic resonance imaging techniques: fMRI, DWI, and PWI. Semin Neurol. 2008 Sep;28(4):395-406.
/index.php/publications/ observer/obsonline/optogenetics-stranger-than-fiction.html
思考题
神经科学研究方法有哪些？你是怎样理解光 遗传学的应用的？
视觉刺激——1991年进行的初级视觉皮层定位fMRI研究
右足主动持续背屈
右足电刺激持续背曲
+N + H + L + H + L + N
+
Time 16 32 32 32 32 32 32 32 32 32 32 32 32
400s Image 1… 200
N: Chinese Numerals H: High Frequency Words L: Low Frequency Words
正电子发射扫描（PET，Positron emission tomography）
The PET scanner detects metabolically active areas of the brain by picking up signals from a radioactive tracer injected into the subject before the procedure
任务激活磁共振功能成像 (task-activated fMRI)
Holdsworth SJ, Bammer R. Magnetic resonance imaging techniques: fMRI, DWI, and PWI. Semin Neurol. 2008 Sep;28(4):395-406.
/index.php/publications/ observer/obsonline/optogenetics-stranger-than-fiction.html
思考题
神经科学研究方法有哪些？你是怎样理解光 遗传学的应用的？
视觉刺激——1991年进行的初级视觉皮层定位fMRI研究
右足主动持续背屈
右足电刺激持续背曲
+N + H + L + H + L + N
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Time 16 32 32 32 32 32 32 32 32 32 32 32 32
400s Image 1… 200
N: Chinese Numerals H: High Frequency Words L: Low Frequency Words
神经生物学的常用研究方法ppt课件
用木瓜蛋白酶水解IgG分子，可将其裂解为两个完全相同的Fab和一个Fc片段。
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多克隆抗体 （polyclonal antibody, PcAb） 大多数天然抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等)往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。多克隆抗体是多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的多种抗体的混合物。 PcAb 特异性差，易出现交叉反应。
单克隆抗体 （monoclonal antibody, McAb）
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组织（细胞）化学是介于细胞学与化学之间的一门科学。细胞化学的目的是使用细胞学和化学的方法使细胞（组织）内的某些化学成分发生反应，在局部形成有色反应物，藉此对各种活性物质在显微镜水平进行定性、定位和定量分析。 酶组织化学：利用酶对底物的催化作用，使底物发生颜色变化，其次对该酶进行定位、定量分析。
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研究方法： 20世纪从40年代，镀银染色法，根据银染溃变纤维的形态变化来判断、追踪溃变纤维的方法。 20世纪从50年代，Nauta法，一种改进的溃变镀银法，能抑制正常纤维的染色而仅染出溃变纤维。 20世纪70年代，变性束路追踪法逐渐被轴浆运输追踪法所代替。 可与逆行标记法、顺行标记法、免疫组织化学、原 blue labelling neurons
DRG
Spinal cord
20×
20×
.
Fast Blue Ladelling Ganglion Cells of Retina
20×
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优点：可靠性，灵敏性， 利用其不同颜色可同时追踪和显示多重神经联系。因此可选择一种或两种以上的荧光素分别对神经元进行单标、双标或多重标记。 双重标记和多重标记可用来研究神经元轴突的分支投射。若在脑内不同核团或区域分别注射两种（或三种）不同荧光，在同一神经元胞体内能观察到两种（或三种）不同颜色的荧光，即说明该神经元的轴突分支分别投射到注射这些荧光剂的两个（或三个）脑内不同核团或区域。 需要注意的是各种荧光素逆行运输的速度不同，所以动物存活时间也有差异。双重标记是，有时需要做两次手术先注射运输慢的荧光素，过一定的时间后，再注射运输较快的荧光素。 缺 点：激发光照射下很快褪灭，因此允许观察的时间较短，保存时间也有限。 应 用：研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。可与免疫组织化学结合，研究投射神经元的化学性质。
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多克隆抗体 （polyclonal antibody, PcAb） 大多数天然抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等)往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。多克隆抗体是多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的多种抗体的混合物。 PcAb 特异性差，易出现交叉反应。
单克隆抗体 （monoclonal antibody, McAb）
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组织（细胞）化学是介于细胞学与化学之间的一门科学。细胞化学的目的是使用细胞学和化学的方法使细胞（组织）内的某些化学成分发生反应，在局部形成有色反应物，藉此对各种活性物质在显微镜水平进行定性、定位和定量分析。 酶组织化学：利用酶对底物的催化作用，使底物发生颜色变化，其次对该酶进行定位、定量分析。
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研究方法： 20世纪从40年代，镀银染色法，根据银染溃变纤维的形态变化来判断、追踪溃变纤维的方法。 20世纪从50年代，Nauta法，一种改进的溃变镀银法，能抑制正常纤维的染色而仅染出溃变纤维。 20世纪70年代，变性束路追踪法逐渐被轴浆运输追踪法所代替。 可与逆行标记法、顺行标记法、免疫组织化学、原 blue labelling neurons
DRG
Spinal cord
20×
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Fast Blue Ladelling Ganglion Cells of Retina
20×
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优点：可靠性，灵敏性， 利用其不同颜色可同时追踪和显示多重神经联系。因此可选择一种或两种以上的荧光素分别对神经元进行单标、双标或多重标记。 双重标记和多重标记可用来研究神经元轴突的分支投射。若在脑内不同核团或区域分别注射两种（或三种）不同荧光，在同一神经元胞体内能观察到两种（或三种）不同颜色的荧光，即说明该神经元的轴突分支分别投射到注射这些荧光剂的两个（或三个）脑内不同核团或区域。 需要注意的是各种荧光素逆行运输的速度不同，所以动物存活时间也有差异。双重标记是，有时需要做两次手术先注射运输慢的荧光素，过一定的时间后，再注射运输较快的荧光素。 缺 点：激发光照射下很快褪灭，因此允许观察的时间较短，保存时间也有限。 应 用：研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。可与免疫组织化学结合，研究投射神经元的化学性质。
神经生物学研究方法
组织培养：下丘脑、垂体、海马、活体脑切片培养 等
体 （胚胎、成年）
外
基因功能
实
原代细胞 细胞通路
验
细胞培养
膜片钳 肿瘤细胞系
细胞系
永生化细胞：P19
一、 组织培养：
下丘脑、垂体、海马、活体脑切片培养 等 （胚胎、成年）
Brain slice cultures
Both figures shows slice cultures of the cerebellum. Left picture: The typical cytoarchitectonic organization of the cerebellar cortex is maintained, and it is possible to nicely distinguish the molecular layer (ML) with the Purkinje cell dendrites (red), the Purkinje cell layer (PCL) with the Purkinje cell bodies (red) and the granule cell layer (GCL) with the granule cells. (green). Right picture: Besides the dendritic arbours, also the axonal projection of the Purkinje cells is present in the slice cultures.
电镜：观察细微结构和亚细胞机构
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双光子显微镜：观察活细胞
• 双光子荧光显微镜是结合激光扫描共聚焦 显微镜和双光子激发技术的一种新技术。
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HRP：1.游离HRP： 通过非特异性整体胞饮的方式被摄入
2.结合HRP：通过与细胞膜的特异性受体结合的介导进入神经元 麦芽凝集素（WGA）-HRP 霍乱毒素（CT）-HRP 优点：灵敏度高，用量较少，
HRP在胞内降解时间明显延长， 能清晰地显示包括细微分支在内的整个神经元的全貌。
注意：因为HRP到达预定部位的时间取决于运输速度和距离，运 输速度因动物及纤维种类而异。同时HRP被运至胞体后即被送入溶酶 体内水解。因此在聚集和降解两个相反的过程中求得最佳存活期必须 具体测试。
需要注意的是各种荧光素逆行运输的速度不同，所以动物存活时 间也有差异。双重标记是，有时需要做两次手术先注射运输慢的荧光 素，过一定的时间后，再注射运输较快的荧光素。
• 缺 点：激发光照射下很快褪灭，因此允许观察的时间较短，保存时 间也有限。
• 应 用：研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。可与免疫组织化 学结合，研究投射神经元的化学性质。
HRP即可作逆行追踪剂使用，也可作顺行追踪剂使用。
基本步骤： 将HRP注射至实验动物中枢核团或周围器官、
神经的一定部位；存活一定时间后灌注、固定动物，取材 作苯冰胺冻（T切M片D；）然或后二用氨双基氧联水苯（胺H（2OD2A）B及）呈显色示剂HR四P甲反基应联产 物。
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5
将HRP注射于周围神经感觉末梢 或神经干逆向标记背根神经节细 胞后，HRP还可进一步沿背根节 细胞的中枢突顺向标记其在脊髓 的中枢终止部位，称作跨节标记。
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3
（1）轴浆运输追踪法
轴浆运输：神经元有长短不等的轴突，由于轴突内缺 乏参与蛋白质合成的核糖体，所以需要从细胞体不断地将 各种成分运输至轴突及其分支以维持其代谢；在神经末梢 释放的神经肽及合成经典递质的酶也需在胞体合成；从末 梢也有影响细胞代谢的物质如神经营养因子等逆向传送至 胞体。不同物质的运输速度不同。
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• 优点：可靠性，灵敏性，
利用其不同颜色可同时追踪和显示多重神经联系。因此可选择一 种或两种以上的荧光素分别对神经元进行单标、双标或多重标记。
双重标记和多重标记可用来研究神经元轴突的分支投射。若在脑 内不同核团或区域分别注射两种（或三种）不同荧光，在同一神经元 胞体内能观察到两种（或三种）不同颜色的荧光，即说明该神经元的 轴突分支分别投射到注射这些荧光剂的两个（或三个）脑内不同核团 或区域。
五、神经生物学常用的研究方法
（一）形态学方法 （二）生理药理学方法 （三）生物化学方法 （四）电生理学方法 （五） 分子生物学方法 （六）脑成像（Brain imaging）技术
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（一）形态学方法
1、束路追踪法 2、免疫组织化学法 3、原位杂交法 4、受体定位法
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束路追踪法
研究神经元之间的纤维联系是神经科学研究领域 的一个基本问题，其研究方法主要有三： （1）利用神经元轴浆运输现象的追踪法，是目前应用 最广者； （2）利用神经元胞体受损或轴突离断后远侧轴突的变 性，或轴突切断后胞体的反应特性的变性追踪法； （3）利用某些荧光染料在神经细胞质膜扩散的神经元 质膜荧光追踪法。
呈色在剂的：情况下，1.二能氨使基DA联B苯发胺生(氧DA化B，): 生DA成B不作溶为性供棕氢褐体色，反H应RP产在物H沉2O淀2存， 定位在抗原所在处。
2.二盐酸联苯胺(BDHC) 3.邻-联茴香胺(OD) 4.四甲基联苯胺(TMB)
用途： 研究脏器的神经支配、中枢内核团间的联系等。还可与免疫组
顺行运输：从胞体向轴突及其终末的运输。
逆行运输：从轴突及其终末向胞体的运输。
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常用方法：
a 辣根过氧化物酶追踪法
1971年，Kristenson和Olsson首先报道辣根过氧化物 酶（horseradish peroxidase，HRP）可被神经末梢摄取， 经轴浆逆行运输至神经元胞体，然后用组织化学方法即可 显示出神经元的轮廓，从而创建了HRP追踪神经元示踪技 术，即HRP法。
织化学、电镜技术等结合。 -
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HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat
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HRP labelling neurons in dLGN
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b 荧光素追踪法-主要作逆向追踪 1977年，荷兰著名神经解剖学家Kuypers及其同事首
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• 荧光素追踪剂是一种暴露在一定激发波长光照下，以一定 发射波长发出一定颜色荧光的化合物。每一种荧光素都有 各自的激发波长和发射波长，不同的发射波长决定了这些 荧光素发出的荧光颜色各异。
• 不同荧光素在神经元内的标记特征不பைடு நூலகம்：
绝大多数标记细胞质，如荧光金（Furogold，灵敏度 高，能较好显示树突分支，只标记胞浆；在胞体内分解慢， 甚至在注射后存活2个月标记强度仍无明显变化；比较耐 紫外线的照射，褪色比较缓慢；可以经受许多组织学染色 处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等结合使用）， fast bule（固蓝）等。
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（2）变性束路追踪法
利用神经元的轴突被损伤之后，在损伤的近 侧端和远侧端分别发生逆行和顺行溃变；神经元 胞体受损后，其发出的轴突从胞体向终末方向的 远侧端发生顺行溃变，来研究纤维的联系。
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损伤手段：
• 物理性方法 锐器的切割、电凝、电离破坏、超声破坏等
特点：无选择性，除了损伤神经元和发出的纤维以外， 也能破坏通过此损伤部位的纤维，导致非特异性标记。
先发现部分荧光化合物可被神经纤维的末梢摄取，并通过 轴浆流逆行运输到各自的神经元胞体，切片后在荧光显微 镜下可直接观察到这些胞体的定位，从而建立了研究神经 纤维联系的荧光素逆行追踪法。
原 理： 将荧光物质注射至神经元的轴突分布区, 经分支 的末梢吸收后，循轴突逆行输送至胞体。在荧光显微镜 下可看到胞体内呈现荧光标记物。
只有少数仅标记细胞核，如nuclear yellow（核黄 ）, diamidino yellow（双脒基黄）等。
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Spinal cord
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Fast blue labelling neurons
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Fast Blue Ladelling Ganglion Cells of Retina