小麦选择性自噬关键基因NBR1的原核表达

收稿日期：2018-12-18基金项目:天津市自然科学基金（17JCZDJC33800）；天津市高校中青年骨干创新人才培养计划（135305JF78）；天津师范大学中青年教师学术创新推进计划（1353P2XC1604）作者简介:刘彦妮（1993—），女，山西人，在读硕士生，主要从事植物遗传学研究。

通讯作者简介:王华忠（1976—），男，天津人，教授，博士，主要从事遗传学研究。

小麦选择性自噬关键基因NBR1的原核表达刘彦妮，杨文文，王华忠（天津师范大学生命科学学院天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）摘要：自噬参与了动植物的生长、发育、衰老和逆境胁迫响应等过程。

NBR1是选择性自噬的底物受体之一，其识别泛素化的特定蛋白底物并通过与自噬膜上的ATG8互作引导底物进入自噬降解过程。

在前期克隆了两个小麦NBR1基因的基础上，本研究通过常规的分子克隆技术构建了两个基因的原核表达载体并将其转化到大肠杆菌中，利用SDS-PAGE 方法鉴定了两个NBR1基因在大肠杆菌中的表达情况。

结果表明，导入大肠杆菌的两个小麦NBR1均能够被IPTG 诱导表达；表达重组蛋白两端含有His(6)标签，其表观分子量与理论分子量基本一致；重组蛋白在诱导后2h 即表现较高的表达量，并在诱导后4h 达到最高的表达量。

研究结果为后续小麦NBR1蛋白的纯化、抗体的制备以及该蛋白的互作性质、表达特征等功能研究工作奠定了基础。

关键词：选择性自噬；小麦；NBR1基因；原核表达中图分类号:S512.1文献标识码:A DOI 编码:10.3969/j.issn.1006－6500.2019.04.001Prokaryotic Expression of The Wheat Key Selective Autophagy Gene NBR1LIU Yanni,YANG Wenwen,WANG Huazhong(Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance,School of Life Sciences,Tianjin Normal University,Tianjin 300387,China)Abstract :Autophagy plays an important role in the growth,development,aging and stress responses of plants and animals.NBR1functions in selective autophagy as a substrate receptor,which recognizes specific ubiquitinated proteins and presents them to the au ⁃tophagic degradation process through its interaction with ATG8on autophagic membranes.Previously,two wheat NBR1genes were cloned in Tianjin key laboratory of animal and plant resistance.In this study,prokaryotic expression vectors for the two wheat NBR1s were constructed and transformed into E.coli .Results from SDS-PAGE showed that wheat NBR1s could express efficiently in E.coli through IPTG induction.The expressed recombinant proteins had N-and C-terminal His (6)tags,and their molecular weights were consistent with the predicted values.High levels of recombinant proteins were detected at as early as 2h after IPTG induction,and the highest levels were reached at 4h after IPTG induction.These results laid a foundation for the preparation of recombinant wheat NBR1proteins and their antibodies for use in assays on the interaction and expression features of wheat NBR1s.Key words :selective autophagy;wheat (Triticum aestivum L.);NBR1gene;prokaryotic expression天津农业科学Tianjin Agricultural Sciences 圆园19,25(4):1-4自噬（autophagy ）是一种保守的真核生物细胞内物质降解过程。

在自噬过程中，细胞质物质被双层膜结构的自噬小体包裹，随后经自噬小体外膜与液泡或溶酶体膜的融合过程以内膜包裹的形式（此时称为自噬小泡）进入液泡或溶酶体腔中进行降解，降解产生的小分子可以作为营养物质重新利用[1]。

自噬过程的执行依赖于多种自噬相关因子ATG （AuTophaGy-related factor ）的参与[1]。

ATG8蛋白定位于自噬膜表面，在自噬小体的组装及其与溶酶体/液泡膜的融合过程中发挥重要作用[2-4]。

自噬分为批量自噬和底物特异性的选择性自噬，ATG8在选择性自噬的底物捕获过程中也发挥了重要作用[1]。

自噬膜表面的ATG8通过直接与特异性底物互作或与其受体互作的方式将底物捕获到自噬小体中[5]。

NBR1（Neighbor of BRCA1gene 1）是目前鉴定到的重要选择性自噬底物受体/ATG8互作蛋白之一。

NBR1含有泛素结合结构域和ATG8互作结构域，其一方面识别并结合泛素化蛋白，另一方面通过与ATG8的互作将其识别的底物引导进入自噬小体[6]。

动物上有关NBR1研究的报道较多，发现其参与了蛋白质聚集体自噬[6]和过氧化物酶体自噬[7]过程的底物识别。

植物NBR1先后在拟南芥[8]和烟草（称为Joka2）[9]上得到鉴定，证实了其与ATG8和泛素化蛋白质底物的互作，参与了胁迫条件下泛素化蛋白质聚集体和入侵病毒相关蛋白的选择性自噬过程[9-13]。

到目前为止，重要农作物小麦上还未见有关选择性•植物生理与生物技术天津农业科学第25卷自噬和NBR1研究的报道。

本研究在前期克隆了小麦两个NBR1基因TaNBR1-1和TaNBR1-2的基础上，构建了两个基因的原核表达载体，实现了两个基因编码蛋白在大肠杆菌中的诱导表达，为后续小麦NBR1蛋白的纯化、抗体的制备和该蛋白的互作性质、表达特征等功能研究工作奠定了基础。

1材料和方法1.1基因、载体及试剂克隆于质粒载体上的两个小麦NBR1基因TaNBR1-1和TaNBR1-2（均为全长cDNA）和原核表达载体pET30a由天津市动植物抗性重点实验室保存。

实验用高保真DNA聚合酶primeSTAR、普通Taq酶、限制性内切酶（Eco RⅠ、Bam HⅠ和XhoⅠ）以及大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）菌株感受态细胞均为TakaRa公司产品；快速连接试剂盒（LigaFast）购自Promega公司；引物合成委托北京六合华大基因科技有限公司完成；其他试剂均为国产分析纯。

1.2原核表达载体的构建设计合成用于扩增TaNBR1-1基因完整开放阅读框（open reading frame，ORF）的引物对NBR1-F （GCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGTCCGGCCTGA GCGCG）/NBR1-R(GTG GTGGTGGTGGTGCTCGAG CTTGTCCTTCTTCTCCCTGGC)和扩增TaNBR1-2基因完整ORF的引物对NBR2-F（GCCATGGCTGATA TCGGATCCATGATGCCTCAACGGGACAC）/NBR2-R (GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCATCAGTTCCTTCA GCTCCGC)，扩增片段两端能够带上Eco RⅠ和Xho Ⅰ酶切位点（TaNBR1-1）或Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位点（TaNBR1-2）。

使用引物对和高保真DNA聚合酶primeSTAR，分别以克隆有两个TaNBR1基因的质粒为模板进行PCR扩增。

对扩增片段进行Eco R Ⅰ/XhoⅠ或Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切，对载体pET30a 质粒进行相应的双酶切。

使用快速连接试剂盒（LigaFast）连接片段和载体。

连接产物转化大肠杆菌DH5α后，使用菌落PCR和酶切方法鉴定重组克隆即目标基因的表达载体。

鉴定到的表达载体经测序进行进一步确认。

采用热激法将表达载体导入到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中。

1.3原核表达接种含有表达载体质粒的大肠杆菌BL21（DE3）到2mL含50mg·L-1卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

按1%的比例扩大到10mL相同的液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期（3h左右）。

加入终浓度为0.5mmol L-1的IPTG，于28℃条件下震荡培养诱导目标基因的表达。

分别于诱导后0，2，4，6，8h取1mL菌液用于总蛋白的SDS-PAGE电泳分析。

1.4SDS-PAGE电泳将收集的1mL菌液于10000rpm条件下离心10min，倒掉上清，用80μL的ddH2O重悬沉淀，再加入20μL的5倍上样缓冲液并混匀，沸水浴10min 裂解细胞变性蛋白。

将裂解液于12000rpm条件下离心5min，取20μL上清进行SDS-PAGE电泳（12%分离胶，4%浓缩胶）。

电泳后用考马斯亮蓝R-250染色液染色1h，脱色液脱色至背景无色后观察并拍照。

2结果与分析2.1两个小麦NBR1基因原核表达载体的构建TaNBR1-1基因原核表达载体的构建流程如图1A所示，设计合成5’端分别添加了Eco RⅠ和Xho Ⅰ位点的正、反向引物，使用该引物对并以克隆有TaNBR1-1全长cDNA的质粒为模板进行PCR扩增获得两端添加了相应酶切位点的TaNBR1-1基因ORF片段，对ORF片段和pET30a载体进行Eco R Ⅰ/XhoⅠ双酶切和连接，连接产物转化大肠杆菌后通过菌落PCR方法初步鉴定重组克隆。