酶盐析法生产工艺
胃蛋白酶提取的分离纯化
胃蛋白酶提取的分离纯化Last revised by LE LE in 2021胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。
其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。
纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。
综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。
关键词：胃蛋白酶分离纯化应用．生物提取法生产胃蛋白酶1．1 工艺路线（自溶、过滤）（脱脂、去杂质）猪胃黏膜→自溶液→上清液（浓缩、干燥）→胃蛋白酶成品工艺过程（1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。
一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。
（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。
用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。
（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。
（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。
球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。
2胃蛋白酶的分离技术有机溶剂法可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。
通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。
当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。
丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。
2．2盐析法盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。
发酵液中纤溶酶盐析法分离纯化的研究
填料价格相对较高，常污染色谱填料及减少分离的载量，难以彻底再
生，严重影响色谱填料分离度和使用寿命。因此，酶在精提纯之前，必须
先除去伴有的色素物质。本研究在纤溶酶产生菌发酵条件的优化基础
上［２］，对酶液的纯化方面进行了细致的研究，得以纯化。研究结果在其它
微生物发酵酶液的纯化方面具有一定的借鉴意义。
1. 材料与方法
７４．３５
（下转第 ６４ 页）
作者简介： 韩涛（１９７２－），男，研究生，从事微生物发酵及生物制药方面研究；李宝库，通讯作者。
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科技信息
高校理科研究
“平面四杆机构急回特性”CAI 课件及其应用研究
宜兴技师学院 蒋碧亚
［ 摘 要］ 本文介绍了机械基础 ＣＡＩ 课件“平面四杆机构急回特性”的研制目的，结构特点和独特的动画构思，以及该课件在教学实 践中的应用和教学效果。 ［ 关键词］ 平面四杆机构 急回特性 计算机辅助教学 课件
脑血栓、肺血栓、急性心肌梗死等疾病严重危害人类健康，研发高
效、廉价、不良反应小的溶栓药物已成为医药界关注的热点［１］。纤溶酶是
一种催化纤维蛋白水解酶，并导致血管内凝块溶解的蛋白水解，为了阐
明它的性质、结构与功能，必须获得酶的纯品。
微生物发酵法生产的纤溶酶具有很好的溶栓效果，但发酵液中存
在的一些杂质物质给酶的分离纯化增加了难度，液相色谱精提纯方法，
１．３．１ 发酵液处理 由于纤溶酶对热、ｐＨ 较为敏感，故应在低温、自 ４０％，５０％， ６０％、６５％、７０％，７５％，室温静置过夜，过滤，取续滤液分别测
然 ｐＨ 条件下进行离心。即发酵液经 ４℃、５０００ｒ／ｍｉｎ 离心 ２０ｍｉｎ 处理。 定酶活力，得盐析曲线结果如图 ２。
酶的生产和利用
酶的生产和利用一、微生物酶制剂的生产主要有以下步骤：1、目的酶生产菌株的分离筛选（1）从自然界分离筛选（2）用物理、化学因子处理诱变（3）用基因重组或细胞融合技术选育2、酶的生产（1）要选择好的培养方法，包括培养基组成配比、培养温度、pH 值、通气量等。
图:微生物在相当于三层楼高的发酵罐里生长繁殖，产生所需的酶（2）确定工业规模大量生产的一系列工程和工艺条件，以及培养罐的形式、大小、通气条件、温度和pH 值的控制等。
图：通过改变培养基类型、酸碱度、氧气浓度和温度，研究人员现了生产某种酶的微生物的最佳生长条件。
三、酶的提取、分离和纯化1、微生物酶制剂的工业提取步骤大致如下：如果是胞内酶，则首先要分离收集其菌体，使之破碎，将酶提取至液相中，此为出发酶液；如果是胞外酶，它的深层发酵液或固体培养物的抽提液则为出发酶液。
2、制取工业酶制剂的步骤：第一步——除去出发酶液中的悬浮固形物，获得澄清酶液，必要时再进行减压浓缩；第二步——根据质量要求和经济性采用适当方法（如用盐析法、有机溶剂沉淀法、丹宁沉淀法等）将酶沉淀分离；图：只有酶和水能通过转鼓式过滤机；培养基和微生物则被留在硅藻土上。
第三步——收集沉淀、干燥、研粉、加适当的稳定剂、填充剂、做成粉末制剂。
••酶粒是在大型连续运转的水平混合机内生产出来的。
提取的酶与盐、纤维素及其他成分混合形成0.5mm大小的粒状物。
然后用一种聚合体包裹，以防止酶尘在使用过程中可能引起的致敏危险。
图:用多聚体包裹酶以减少酶尘引起的致敏危险。
3、其他方法对于质量要求高可提取液中共存有妨碍目的酶工艺效果的其他酶时，常用一些特殊纯化方法将目的酶与其他酶和杂蛋分开，再分别沉淀制取。
常用的方法有：（ 1 ）蛋白质选择性变性法（ 2 ）分级盐析法•有机溶剂分级沉淀法•等电点法•柱层析法•电泳法•亲和层析法四、酶的化学修饰技术1、金属离子置换修饰2、大分子结合修饰3、肽链有限水解修饰4、侧链修饰图：微生物的基因经修饰能够产生所需的酶五、固定化酶和固定化细胞固定化酶是通过物理或化学的处理，使水溶性酶和固态的水不溶支持物（载体）相结合或被载体包埋，但仍保留酶活力。
发酵产物的分离提取—沉淀与离心
温度
pH
操作方式
有机溶剂法——利用酶蛋白在有机溶液中的溶解度不同，使目的酶
蛋白和其他杂蛋白分开，并浓缩，故此法可以使酶分级提纯。
有机溶剂的种类和用量
温度
影响有机溶剂
提取酶的因素
pH
中性盐浓度
时间
二、 离心
作用：液-液、固-液、液-液-固分离的常用手段
离心沉降
离心分离
离心过滤
（一）离心沉降原理
球形粒子沉降：
盐析法
（1）定义
在高浓度中性盐存在的情况下，随着中性盐的浓度增加，
欲分离蛋白质在水溶液中的溶解度会降低并沉淀析出的现象。
（2）盐析法机理
（1）盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的
有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白质表面的水化膜，
导致蛋白质溶解度下降。
（2）盐离子电荷的中和作用，静电斥力降低，使蛋白质的溶解度
2
式中： ω——旋转角速度，rad/s
r——粒子离转轴中心的距离
ω2 2 2
=
=
≈
900
f——离心分离因数
f<3000
常速离心机
f=30000-50000
中速离心机
f>50000
ห้องสมุดไป่ตู้
高速离心
f>2×105
超高速离心机
（二） 离心沉降设备
① 瓶式离心机
② 管式离心机
③ 多室式离心机
下降。
（3）盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子极化，
使水活度降低。
（3）影响因素
无机盐的加入量
蛋白质的浓度
影响盐析的各种因素
蛋白酶的盐析沉淀实验报告
蛋白酶的盐析沉淀实验报告班级：生工1005 学号：00 姓名：朱同辉实验目的：1.掌握使蛋白质胶体溶液保持稳定的因素；2.了解蛋白质沉淀的几种方法及其意义；3.掌握测定蛋白酶活力的原理和方法；4.学习酶活力的计算方法。
实验原理：盐析法在蛋白质溶液中加入少量中性盐，蛋白质溶解度增加，称为盐溶；而加入大量中性盐达一定浓度，蛋白质就会沉淀，称为盐析。
原理 ： ①大量盐加入后，能与蛋白质争夺水分子，去除水膜；②大量盐能中和蛋白质分子表面电荷，使分子间静电斥力减弱，疏水作用增强，使蛋白质沉淀。
盐析效果： 二价离子 > 一价离子离子半径小 > 离子半径大阳离子∶Mg2+>Ca2+>Ba2+>NH4+>Na+>K+>Pb+>Cs+ 阴离子∶PO43->SO42->Cl->Br->NO3->I->SCN-蛋白质的溶解度与盐离子强度间的关系可以用Cohn 经验式来表示：式中：S —蛋白质的溶解度 I —离子强度β—常数，与温度和pH 有关Ks —盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关其中I 根据下式计算：式中：ci —i 离子的浓度（mol/L ） zi —i 离子所带的电荷 蛋白酶活力的测定福林（Folin ）试剂在碱性条件下可被酪氨酸还原成兰色化合物，蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸，将产物中未被水解的酪蛋白除去后与福林试剂作用，根据显兰色的深浅可以计算出酪氨酸的产生量，从而推断酶活力的大小。
蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算K —在酪氨酸标准曲线上O.D 值为l 时酪氨酸的微克数（μg ），K 值为108.53680D .O N K 104⨯⨯⨯=酶活力IK S log s -β=2ii z c 21I ∑=N—酶液稀释倍数4—酶反应液为4 ml，取出1 ml测定，故乘以410—反应时间为10 min参考稀释倍数：原酶、饱和度20%，30%，40%，50%，60%，70%的上清液分别为1000，200，150，100，100，100，50倍实验步骤：1）蛋白质盐析分两个大组进行实验，每大组取6只烧杯编号，分别加入50 ml蛋白酶液，分别称量5.70，8.80，12.16，15.66，19.5和23.6固体硫酸铵粉末（对应20%，30%，40%，50%，60%，70%饱和度），在磁力搅拌器不断搅拌下，将其缓慢加入酶液中，加完后再搅拌5 min，使硫酸铵完全溶解。
纤维素酶的生产工艺及分离提纯
纤维素酶的生产工艺及分离提纯：朱帅帅学号：4 四院三连通信工程摘要：纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶。
由于纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国外业人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。
是可以将纤维素分解成寡糖或单糖的蛋白质。
关键词：发酵法；盐析法；凝胶过滤；离子交换层析；电泳Abstract：Cellulase is an important enzyme products, a plex enzyme, mainly by the exo-β-glucanase, endo-β-glucanase and β-glucosidase and other ponents, there are very high energy Xylanase. Because cellulase has great market potential in the fields of feed, alcohol, textile and food, it has been regarded as the fourth largest industrial enzyme after saccharifying enzyme, amylase and protease, even in China it is entirely possible to bee the largest enzyme species, so the enzyme enzyme industry is a new growth point. Is a protein that can depose cellulose into oligosaccharides or monosaccharides.Keywords:Fermentation, Salting out, Gel filtration, Ion exchange chromatography, Electrophoresis.一、纤维素酶的概述纤维素酶是一种对纤维素大分子的水解具有特殊催化作用的活性蛋白质，它是一组酶的总称，不是单成分酶，而是由多个酶起协同作用的多酶体系。
酶在生物技术方面的应用
酶在农作物育种中的应用：如利用酶工程技术改良作物品种，提高作物的抗病性、抗逆性和产量。
酶在农产品加工中的应用：如利用酶工程技术改进农产品加工工艺，提高产品质量和生产效率。
酶在农业环境保护中的应用：如利用酶工程技术处理农业废弃物，减少环境污染，提高资源利用率。
酶在环保领域的应用
污水处理：酶可以分解水中的有机污染物，提高水质
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酶在药物生产中的应用：利用酶的生物催化作用，降低生产成本和污染
酶在药物合成中的应用：利用酶的催化作用，提高药物合成效率
酶在药物修饰中的应用：利用酶的特异性，对药物进行修饰，提高药物疗效
酶在药物分析中的应用：利用酶的生物活性，进行药物分析，提高分析速度和准确性
酶在食品工业中的应用
酶在肉类加工中的应用：如蛋白酶、脂肪酶等，可以提高肉类的口感和营养价值。
酶的生产需要复杂的设备和技术，增加了生产成本
酶的稳定性问题
酶的高效利用问题
酶的稳定性：如何在不同环境下保持酶的活性和稳定性
酶的产量：如何提高酶的产量以满足工业生产的需求
酶的选择性：如何提高酶的选择性以减少副产物的产生
酶的成本：如何降低酶的生产成本以提高经济效益
酶在生物技术中的未来发展前景
酶工程：通过基因工程和蛋白质工程改造酶的结构和功能，提高酶的稳定性和活性
定向进化技术的应用：在生物技术、制药、环保等领域有广泛应用
定向进化技术的优点：可以提高酶的活性和稳定性，降低生产成本，提高生产效率
定向进化技术的挑战：需要解决酶的结构和功能关系、酶的稳定性和活性等问题
酶的基因工程技术应用
基因工程技术：通过基因改造和重组，提高酶的活性和稳定性
酶的改良：通过基因工程技术，对酶进行改造，提高其性能和功能
盐析法沉淀酶
盐析法沉淀酶”通常指的是利用盐析法对酶进行提纯和分离的方法。
盐析法是一种常见的蛋白质分离技术，通过调节盐浓度使蛋白质发生沉淀，从而实现蛋白质的提纯和富集。
在酶学中，盐析法通常用于酶的富集和提纯过程。
一般步骤如下：
1.溶液制备：将含有酶的混合物在适当的缓冲液中溶解，并去除杂质。
2.盐析操作：逐渐加入盐类（如硫酸铵）至溶液中，使得蛋白质发生沉淀。
通过盐的逐渐
加入，可以控制沉淀的蛋白质种类和纯度。
3.沉淀收集：将沉淀的蛋白质用离心或其他方法分离出来。
4.溶解和保存：将沉淀的酶溶解在适当的缓冲液中，根据需要进行进一步的纯化和储存。
这种方法能够根据酶的生物化学特性和蛋白质的溶解度进行选择性分离，是酶学研究和工业生产中常用的一种技术手段。
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部份酶液中添加少量盐后就检测到滤液中酶的真实含量，导到不能及时发现盐
析中存在的问题，影响收率，如蛋白酶，蛋白酶发酵液中只要添加10%以上的 元明粉就检测不到滤液中的酶活力，这时就要通过其他方法来确定盐析效果。
盐析法生产设备
盐析罐（带搅拌） 板框压滤机，臌膜式 气流烘干机，沸腾烘干机（粉料） 粉碎机、混合机（粉料） 造粒成套设备（颗粒料）
3.盐析原材料质量的影响
酶盐析工艺与其他工艺比较
其他需求技术交流
喷雾及喷雾制粒
喷雾液的配制 喷雾参数的调节：温度、风压等控制
酶制剂造粒
造粒颗粒与设备选型； 原料选择与配方；
盐析滤饼直接造粒。
谢 谢！
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盐析比例
盐析用盐的添加量一般根据发酵液或酶液的固形物含量、蛋白
质浓度、蛋白质的颗粒大小、亲水性的程度不同，在盐析时需 要盐的浓度也不一致。各酶种的添加比例有较大区别。
如何确定盐的添加量？
一般通过盐析试验来确定，试验中通过盐析 效果确定盐的 添加量
盐析效果的检测
盐析结束后必须检测盐析效果后才能进行下道工序； 盐析效果检测一般通过测定滤液中酶的含量来确定，一般废液中酶的含量小于
盐回收设备：收集池、多效浓缩结晶设备、离心机等。
盐析收率
提取收得率是后处理中判断工艺是否优越的重要指标。 对于同一种发酵产品，提取工艺不同时，其技术经济指标的差异
很大 。
目前酶的盐析收率在75-85%之间 影响盐析收率的主要因素有：
1.温度影响，元明粉盐析需要恒温
2.PH影响，必要时需调PH
盐 滤饼
造粒 气流干燥
沸腾干燥 沸腾干燥
发酵液
盐析
板框压滤
滤 液
离心脱水
浓缩结晶
粉碎
混合包装
盐析原料选择
原料：来源广泛（易采购、价廉）, 利用率高； 盐析效果好，常温溶解度高； 通过比较，目前硫酸钠（元明粉）、硫酸铵是常用盐析原料， 硫铵不能用于饲料添加剂，因此饲料酶生产用硫酸钠盐析.
盐析原理 原料选择 盐析比例 盐析效果检测 盐析设备 盐析收率 盐析与其他工艺比较 其他需求技术交流
盐析原理
一般是指溶液中加入无机盐类而使溶解的物质析出的过程。如： 加硫酸铵、硫酸钠(饲料中允许添加)蛋白质凝聚的过程。蛋白
质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化
膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性 盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于
是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加
入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大 量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集
而沉淀。
酶盐析工艺流程图