转录组高通量测序转录组数据分析差异表达基因分析 PPT
生物信息学中转录组数据分析方法与差异表达基因鉴定
生物信息学中转录组数据分析方法与差异表达基因鉴定近年来，随着高通量测序技术的快速发展，生物信息学成为了生物学研究不可或缺的一部分。
而转录组数据分析作为生物信息学的重要方法之一，在研究生物体内基因表达变化、差异表达基因的鉴定以及功能注释等方面发挥着重要作用。
转录组数据分析的第一步是将测序得到的原始数据进行质控与清洗。
在这个步骤中，需要运用一系列的质量评估工具来评估原始数据的质量，并且对数据中的低质量序列、接头污染等进行去除，以保证后续分析的准确性和可靠性。
之后，对于清洗后的测序数据，可以进行基因定量分析。
基因定量可以通过统计数据中每个基因的发现数目来实现，以探究不同样本中基因的表达量差异。
最常见的基因定量方法是将每个样本的测序数据比对到参考基因组，然后使用一些特定的算法来计算每个基因的读数。
最常用的算法包括RPKM（reads per kilobase million）和TPM（transcripts per million）等。
在基因定量的基础上，可以进行差异表达基因的鉴定。
差异表达分析旨在找出在不同条件下表达水平发生显著变化的基因。
常用的差异表达分析方法包括DESeq2、edgeR和limma等。
这些方法基于统计学原理，通过对基因表达进行归一化、方差稳定化和模型的拟合来找出差异表达基因。
除了差异表达基因的鉴定，还可以进行富集分析，以确定差异表达基因的功能。
富集分析是一种将某一特定基因集与已知功能注释的基因集相比较的方法，可以帮助研究人员了解差异表达基因在生物学过程和通路中的功能变化。
在这个步骤中，通常会使用一些公共数据库，如GO（Gene Ontology），KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）和Reactome等，来获得基因功能注释信息。
除了上述提到的方法，还有一些其他的转录组数据分析方法可供选择。
例如，可以使用聚类分析方法对样本进行聚类，以寻找具有类似表达模式的基因组。
基于转录组数据的差异表达基因分析
基于转录组数据的差异表达基因分析转录组（transcriptome）是指一个生物在一定时间和环境下其全体细胞内的RNA转录产物的总和，即所有可以转录的基因产物，包括编码RNA和非编码RNA。
转录组分析（transcriptome analysis）是一种研究基因表达级别、结构和调控机制的手段，通过对RNA测序数据的研究，可以更好地理解生物体内基因的调控规律和生命活动的本质。
其中，差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）分析是转录组分析的一种重要方法，可以帮助我们研究基因的功能和作用，深入探究生物组织和功能间的关系。
一、差异表达基因的概念差异表达基因是指在相同条件下两种或多种样本中差异表达的基因，即其表达水平在不同样本中差异显著，这种差异有时也称为基因表达的变化或调控。
常用的方法是对不同样本中的转录组进行测序，获得每个基因的表达量，再通过各种差异分析方法，筛选出差异表达的基因，这些基因可能具有重要的生物学功能，可以在不同种类的研究中得到应用。
二、差异表达基因分析的步骤差异表达基因分析一般包括以下步骤：1. 数据处理：包括数据清洗、对齐和定量等步骤。
转录组测序数据从测序平台获取后需要进行数据清洗，包括去除低质量的序列、去除污染序列和引物序列等。
然后需要将原始序列数据对齐到参考基因组或类似序列上，例如转录本、参考转录本或参考基因组等。
最后，需要计算每个基因或转录本在各样本中的表达量，可以通过HTSeq、Cufflinks、RSEM等软件或者简单的读数对齐统计表达量。
2. 差异表达基因筛选：筛选出在不同样本间表达量差异显著的基因。
差异表达基因筛选是转录组分析的重要步骤之一，它可以将表达水平差异显著的基因筛选出来，对于研究基因的生物学功能、分子机制以及生物学意义都非常重要。
目前，常用的差异分析方法包括DESeq2、EdgeR、Limma、Cuffdiff等。
通过统计学方法和多重检验校正，可以筛选出不同样本中具有显著表达水平差异的基因。
基因组和转录组高通量测序数据分析流程和分析平台
基因组和转录组高通量测序数据分析流程和分析平台基因组和转录组高通量测序数据分析是生物信息学领域中的一个重要研究方向。
随着高通量测序技术的发展，获取大规模基因组和转录组数据已经成为可能。
通过对这些数据的分析，可以深入了解生物体内基因的表达和功能等相关信息。
本文将介绍基因组和转录组高通量测序数据分析的基本流程和常用的分析平台。
数据预处理是分析流程的第一步，主要包括测序数据的质控和去除低质量序列。
常用的质控工具包括FastQC和Trim Galore等，它们可以评估测序数据的质量和检测可能的污染。
在质控的基础上，可以使用Trimmomatic等工具去除低质量序列和适配体序列，保证后续分析的准确性和可靠性。
基因定量是分析流程的第二步，用于评估基因的表达水平。
常用的基因定量工具包括kallisto、Salmon和STAR等。
这些工具可以根据测序数据和已知的转录组序列，计算基因的表达水平。
基因定量的结果一般以表达矩阵的形式输出，该矩阵包含了每个样本中每个基因的表达值。
差异表达基因分析是分析流程的第三步，用于寻找基因表达水平在不同样本中存在显著差异的基因。
常用的差异表达基因分析工具包括DESeq2、edgeR和limma等。
这些工具可以对表达矩阵进行统计学分析，找出在不同样本之间具有显著差异的基因。
差异表达基因分析的结果一般以差异表达基因列表的形式输出。
富集分析是分析流程的第四步，用于寻找差异表达基因中富集的生物学功能或通路。
常用的富集分析工具包括GOseq、KEGG和enrichR等。
这些工具可以根据差异表达基因列表，基于GO注释和KEGG通路等数据库，计算差异表达基因在特定功能或通路上的富集度。
生物学注释是分析流程的最后一步，用于解释基因的功能和相关信息。
常用的生物学注释工具包括DAVID、GSEA和STRING等。
这些工具可以根据差异表达基因列表，提供关于基因功能、互作关系和代谢通路等信息。
除了上述基本流程外，还有一些附加的分析步骤，如差异剪接分析、外显子计数等。
转录组分析(RNA-Seq)-PPT文档资料
Random hexamer primed cDNA synthesis
Paired-end
Solexa Sequencing
-6- dT微珠纯化mRNA ������ mRNA片段化处理 ������ 反转录反应合成合成双链cDNA ������ 双链DNA末端修复及3’末端加‘A’ ������ 使用特定的测序接头连接DNA片 段两端
转录组分析（RNA-Seq）
• 李江攀
RNA-Seq 的技术背景 RNA-Seq 的应用领域 RNA-Seq 面临的挑战及发展前景
RNA-Seq 的技术背景
RNA-Seq又称转录组高通量测序（transcriptome sequencing）或称为全转录组鸟枪法测序（Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS）
数字表达谱与芯片的比较
特点
数字化信号 高通量 可重复性高 无需重复实验 检测低丰度基因 检测新转录本 检测反义链转录本
数字表达谱
√ √ √ √ √ √ √
芯片
√
Unigene12000个以上，但转录组大小受基因数目和基因丰度双 重影响，组织差异、状态和实验处理也会影响转录组组成。Βιβλιοθήκη RNA-Seq 的发展前景
转录组测序原理.pptx
激发碱基荧光并收集荧光信号
去除阻断基团和荧光基团
Cycle 2-n:
重复前面的步骤
第16页/共40页
ห้องสมุดไป่ตู้基片段杂交
OH
diol
P7 P5
Flow Cell接头
diol diol
模板杂交
diol diol
延长
diol diol
变性
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Cluster station
• 剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，
Throughput : up to 25 Gb per day
Output 26-35 Gb 75-100 Gb 150-200 Gb
第15页/共40页
基于SBS测序技术
3’-
…-5’
5’-
GTATTTTCGGCACAG
A
G
A
C
T
T
C TG
Cycle 1:按顺序加入反应试剂
合成第一个碱基
清除未反应的碱基和试剂
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鉴定基因可变剪接
exon1
common reads
exon2
exon3
mRNA
exon1
junction reads
exon3
exon1
exon2
exon3
第26页/共40页
鉴定融合基因
第27页/共40页
Paired Reads distribution
Reads cluster
主要内容• 样品检测 • 制备 • Cluster Station • Illumina Sequencing • 生物信息分析
第14页/共40页
新一代测序技术
转录组测序数据分析流程
#流程大放送#转录组测序数据处理和分析
介绍
转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA。
相对于传统的芯片杂交平台，转录组测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。
基于高通量测序平台的转录组测序技术能够全面获得物种特定组织或器官的转录本信息，从而进行基因表达水平研究、新转录本发现研究、转录本结构变异研究等。
该技术可用于以下研究
1.观察疾病发生过程中病灶部位内部的基因表达水平变化
2.在肿瘤研究中，使用RNA-seq技术可以预测潜在的融合基因
3.新lncRNA预测和已知lncRNA表达水平研究
4.新物种的转录组数据构建和功能研究
数据分析流程图
预期图例展示
示例图1 差异表达基因筛选示例2 基因聚类分析heatmap图
示例3 差异基因互作网络图示例4 lncRNA、基因与上游共有miRNA网络图。
转录组测序数据分析（有参考基因组）
转录组测序数据分析（有参考基因组）一、数据分析流程二、数据分析内容1. 数据预处理目的：对原始测序数据进行一定程度的过滤。
原理：根据测序接头以及测序质量对原始的测序数据进行预处理，其中，测序质量Q与测序错误E之间的关系如下：结果：对预处理后质量以及碱基分布统计进行统计2. 比对基因组目的：将经过预处理的测序数据与参考基因组进行相似性比对。
原理：Burrower-Wheeler转换算法与splicing比对算法。
1）Burrower-Wheeler转换算法：由于测序数据量非常大，与整条基因组比对所需资源与时间是较为巨大的。
目前，我们采用Burrower-Wheeler(BWT)算法对基因进行建立索引、碱基压缩等过程，这样可以很大程度上加快比对速度，减少比对过程中所需资源。
2）splicing比对算法：即分段比对算法，当某条测序序列位于转录本剪切位点时，也就是这条序列同时属于两个外显子，如果将它与参考基因组进行比对，由于基因组两个外显子之间含有intron区，那么它将无法找到它合适的位置；但是应用分段比对算法就可以将这条测序序列分割变成多段子序列，然后应用这些段子序列与基因组进行比对，这样就可以找到它们真正的位置。
Vps28基因的一个分段比对的结果，蓝线连接的两端即为被分割的子序列，可见此种算法非常的适用于转录组测序。
结果展示：应用比对结果进行一些相关mapping统计，测序饱和度及测序5’，3’ bias统计。
Multi mapping，Unique mapping及Unique gene-body mapping统计。
饱和度分析，当reads达到一定测序量后，基因覆盖率基本达到饱和。
测序3’,5’偏好性统计，测序主要集中于基因bady区，两端偏向性较轻。
3. 基因表达水平研究目的：应用基因组比对结果进行基因定量。
原理：从指定物种基因模型(基因结构)中得到gene、exon、intron以及UTR等位置信息，通过基因组比对结果计算出在不用区域富集片段数目，然后应用RPKM/FPKM标准化公式对富集片段的数量进行归一化。
转录组测序技术原理及应用PPT课件
Total RNA
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation (200nt~700nt)
Random hexamer primed cDNA synthesis
Size selection, then PCR amplification
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation
Random hexamer primed cDNA synthesis
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000 sequencing
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000llumina Sequencing 生物信息分析
.
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Applications of RNA-Seq
Application
Expression-profiling Alternative Splicing Fusion Gene SNP detection
RT ds cDNA
.
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末端修复(防止自连） cDNA 3′末端加A Adapter连接
.14第一天制备第二天第三天消化DNA
↓
mRNA的分离
↓
mRNA的打断
↓
cDNA的合成
末端修复
↓
3’端↓ 加A
↓
加接头↓胶回收质量检测： Aligent 2100：片段大小、纯度、浓度 qPCR：片段大小、浓度 手工检测：跑胶验证。
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并在两个末端加上接头（adapter）。 2） 桥式PCR产生DNA簇
现象（如转录衰减）以外，转录组反映的是特定条件下活跃表达 的基因
3
➢ 转录组的研究可以提供什么条件下什么基因表达什么信息，从而 推断相应未知基因的功能，揭示特定调节基因的作用机制
➢ 对转录本的定量可以了解特定基因的活性和表达量，用于疾病的 诊断和治疗
➢ 通过对转录组的研究，也让个性化医疗的目标，从共性转移到个 性，成为可能
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➢ DNA芯片技术：只适用于检测已知序列，却无法捕获新的mRNA。杂交 技术灵敏度有限，对于低丰度的mRNA，微阵列技术难以检测，也无法 捕获到目的基因mRNA表达水平的微小变化。
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SAGE(基因表达系列分析)：
➢ 可以全面了解特定组织或细胞类型中基因群体表达状态，它的显 著特点是能够大量获取基因组范围基因表达的类别与丰度，该技 术成功地应用于特异组织或细胞的转录组研究和mRNA群体间差 异表达基因鉴定。
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(2)RNA 聚合酶II负责蛋白质编码基因和调控非编码RNA的转录，在 真核生物的不同生理和病理状态下表达量被严格调控，一直吸引着 各生命科学研究领域的重点关注，无比幸运的是，由RNA聚合酶II 生成的转录的末端均含有3’端多聚腺苷尾【3’poly（A）tail】。 转录组测序一般是对用多聚胸腺嘧啶（oligo-dT）进行亲和纯化的 RNA聚合酶II转录生成的成熟mRNA和ncRNA进行高通量测序。这 样的数据有效排除了看家非编码RNA的干扰，可以通过一次测序获 得一种细胞内几乎所有重要基因的表达参数。
1.4转录组测序
➢ （1）RNA聚合酶I和III负责种类稀少、功能重要的看家非编码 RNA基因的转录，包括rRNA，tRNA，snoRNA，snRNA等。由这 两类RNA聚合酶转录的非编码RNA属于看家RNA，在各种生理和 病理状态下都被高水平转录，转录产物占细胞内RNA总量的95% 以上，不是生命科学研究前沿领域的主要关注对象
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1.3转录组研究的技术
主要包括如下三种：
➢1）基于杂交技术的微阵列技术； ➢2）基于Sanger测序法的SAGE (serial analysis of gene expression) 和 MPSS(multiple parallel signature sequencing)； ➢3）基于新一代高通量测序技术的转录组测序。
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2.3三种常见的测序平台
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Illumina Genome Analyzer
• 专利核心技术“DNA 簇”和“可逆性末端终结”，达成自动化样 本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。具有高准确性， 高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势，可以同时完成传 统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及 调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。
➢ 缺点是需要大量的mRNA
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大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ下，但要小声点
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MPSS(多重性平行定序)：
➢ 对于功能基因组研究非常有效，能在短时间内捕获细胞或组织内 全部基因的表达特征；对于鉴定致病基因并揭示该基因在疾病中 的作用机制等发挥了重要作用。
➢ 可以侦测到极为罕见的基因表现
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2.1高通量测序优势？
➢ 价格比第一代大幅度降低 ➢ 可扩展的高通量 ➢ 需要样品量少 ➢ 新颖的测序化学技术 ➢ 单个或配对末端支持
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2.2高通量测序技术的应用
➢ 重头测序(de novo sequencing) ➢ 重测序(resequencing) ➢ 全转录组测序(whole transcriptome resequencing) ➢ 小分子RNA测序(small RNA sequencing) ➢ 染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)
• 单细胞转录组分析 • 转录组测序确定RNA结构 • 转录组测序在疾病中的应用
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2.高通量测序
➢ 测序技术的发展 ➢ 高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“第二代”测
序技术(“Next-generation” sequencing technology)，高通量测序 使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能 ，所以又被称为深度测序(deep sequencing)
➢ 从RNA层次研究基因表达的情况，即为转录组学（ transcriptomics），是研究细胞表型和功能的一个重要手段。
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1.2转录组研究的重要性
➢ 转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的纽带，转 录水平的调控是最重要也是目前研究最广泛的生物体调控方式。
➢ 转录组的研究比基因组的研究能给出更高效的有用信息。 ➢ 与基因组不同，转录组更有时间空间性。除了异常的mRNA降解
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几种转录组研究所用技术的比较
转录组所用技术 Microarray SAGE和MPSS RNA-seq
原理
信号 分辨率 分辨率 背景 成本 起始RNA用量
寡核苷酸杂交 Sanger测序 高通量测序
荧光信号 数个-上百个 高 高 高 多
数字化信号 单碱基 低 低 高 多
数字化信号 单碱基 高 低 相对较低 少
• 1.转录组 • 2.高通量测序 • 3.转录组数据分析 • 4.差异表达基因分析 • 5.趋势性上调和下调基因分析 • 6.基因集功能富集分析
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1.1transcriptome
➢ 转录组（transcriptome）是指特定生物体在某种状态或某一生 理条件下，细胞内所有基因转录产物的总和，包括信使RNA 、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有 mRNA的集合。
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转录组高通量测序的优势？
• 高通量、更精确的数字信号、无需已知序列、能够在单核苷酸水 平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和 表达水平的同时，还能够发现未知转录本和稀有转录本，精确的 识别可变剪接位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），提供 最全面的转录组信息。
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转录组前沿研究简介