转录组测序结题报告

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1．mRNA纯化：

抽提得到的总RNA首先利用10U的DNaseI（Ambion，美国）在37℃消化1小时；然后利用Micropoly(A)PuristTM mRNA purification kit（Ambion，美国），进行mRNA纯化：把RNA稀释到250μl的体积，按照Kit的操作步骤（Cat.No:

1919）进行；最后得到的mRNA用100μl预热的THE缓冲液洗脱，利用NanoDrop 进行定量。

2．cDNA合成：

cDNA合成是在Ng等2005年发表的方法基础上改进而成（文献1，图1）。第一链cDNA合成利用GsuI-oligo dT作为反转录引物，10μg的mRNA作为模板，用1000 单位的Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen，美国)在42℃作用1小时完成；随后利用NaIO4（Sigma，美国）氧化mRNA的5’帽子结构，并连接生物素；通过Dynal M280磁珠（Invitrogen，美国）筛选连接了生物素的mRNA/cDNA，并通过碱裂解释放第一链cDNA；然后通过DNA ligase（TaKaRa，日本）在第一链cDNA的5’末端加上接头，然后通过Ex Taq polymerase (TaKaRa，日本)合成第二链cDNA。最后通过GsuI酶切去除polyA和5’端接头。

图1. 全长cDNA合成示意图

3．cDNA测序：

合成的cDNA利用超声仪（Fisher）打断到300-500bp的范围，利用Ampure beads（Agencourt，美国）进行纯化。随后纯化的cDNA利用TruSeq TM DNA XXmple Prep Kit – Set A (illumina，美国)制备文库，并利用TruSeq PE Cluster Kit (illumina，美国)进行扩增。最后在illumina机器上进行测序反应。

测序得到的数据统计见表1.

表1. Solexa测序统计

样品对照 1 2

Reads数目(对) 5,500,000 10,254,848 11,160,428

Clean data 5,442,815

（98.96%）

10,160,130

（99.08%）

10,998,951

（98.55%）

平均长度100 100 100

5．EST拼装：

利用trinity进行拼装。共得到45,308个EST cluster(contigs)。具体拼装结果见表2和图2。

表2. 拼装统计

样品XX

Contig数目45,308

Contig平均长度698

Contig长度范围201-16,169

图2. Contigs长度分布(横坐标为基因长度分布，纵坐标为基因数量分布)

6．数据分析：

6.1 基因预测：采用EMBOSS工具包(参考文献2)中的’GetORF’对拼装得到的contigs进行基因预测，从不同contigs中找到蛋白编码序列。

6.2 基因注释：将预测得到的蛋白编码序列与GenBank的NR、GO、KEGG、KOG等数据库利用blastp进行比对，条件为E value<1e-5，选择匹配最好的一项作为注释信息。

详细结果见annotation.xls，由左至右分别为拼接软件产生的contig名称、基因功能注释、ORF起始与终止位点坐标、正反义链、氨基酸长度、KOG分类。

6.3 GO分析：GO分析利用GoPipe（参考文献3）进行，预测蛋白首先与Swiss-Prot 和TrEMBL数据库进行比对，条件为blastp，E value<1e-5，然后比对结果利用GoPipe程序，根据gene2go，得到预测蛋白的GO信息。共有4,823个预测蛋白，匹配28,168项GO terms,如图3所示。

详细结果见annotation.xls中“GO”sheet栏。

图3. GO分布

6.4 代谢通路构建：利用KEGG数据库（参考文献3），将预测蛋白与KEGG数据库进行比对，条件为双向blast，E value <1e-3；得到预测蛋白的KO number，再根据KO number，获得预测蛋白参与的代谢通路信息。结果共有2,706个蛋白获得了KO number，它们参与的代谢通路如如图4所示。

详细结果见annotation.xls中“KEGG pathway ”sheet栏。

图4. 编码蛋白所参与的代谢通路类别

6.5 表达丰度分析：首先去除低值序列得到clean reads（图5），然后mapping 到拼接的contig上（图6，图7显示mapping的结果），统计每个conig中分别来自2个样品的reads数目，接着转换成RPKM（参考文献4），最后利用DEGseq 程序包中的MARS (MA-plot-based method with Random XXmpling model)模型（参考文献5），计算每个contig代表的基因在2个样品中的表达丰度差异，FDR 值小于0.001的即被认定为具有显著性差异。

详细结果见annotation.xls中“DGE”sheet栏或”express.xlsx”。

图5. 序列质量分析（clean reads为不含N且质量大于5的碱基数至少占全长的一半）

图6. 测序饱和度分析(横坐标为reads number，纵坐标为gene number)

图7.基因覆盖率统计

样本间差异统计详见annotation.xls中“DGE”sheet栏：由左至右分别是基因名称、基因长度、样品A 统计reads数、样品A RPKM值、样品B统计reads 数、样品B RPKM 值、样品A相对样品B表达差异倍数（取Log值）、q-value、显著性判断。

表3. 样品间显著性差差异基因统计

样品上调基因数（p<0.001）下调基因数(p<0.001)

1/对照2,961 1,005

2/对照2,257 36

2/1 3,352 2,541

图8.上下调基因变化(横坐标为gene，纵坐标为统计值)

6.6 富集分析：对于每一个代谢通路和GO类别，我们利用超几何分布统计，计