诺禾致源真核无参转录组生物信息分析结题报告2013年8月
诺禾致源LncRNA信息分析内容
诺禾致源LncRNA信息分析内容LncRNA分析内容注：以下标红需要多样本数据支持一、标准信息分析内容：1.测序数据质量评估2.参考序列比对分析3.基因表达水平分析4.RNA--‐seq整体质量评估5.序列拼接组装(cufflinks + S cripture两种拼接方法 )6.LncRNA位点筛选（可选intergenic lncRNA, intronic LncRNA, antisense lncRNA分别计算费用）6.1长度筛选(>=200bp)6.2Exon个数筛选(>=2)6.3Reads覆盖度筛选(>=3)6.4位置筛选(对不同种类的lncRNA采用不同的位置筛选条件)6.5编码潜能筛选(四种方法取交集：pfam蛋白结构域筛选、CPC 筛选、CNCI筛选、PhyloCSF)7. 筛选得到的LncRNA描述性统计分析7.1 L ncRNA长度分布7.2 E xon个数分布7.3 已知和新预测lncRNA分类8. LncRNA保守性分析8.1 位点保守性分析8.2 序列保守性分析9. LncRNA表达水平分析9.1 差异表达水平分析*（>=2个样本）9.2 组织或表型特异性表达分析*（>=3个组织或者表型）10．LncRNA靶基因预测10.1 C is作用靶基因10.2 T rans作用靶基因*（>=2个样本）11. L ncRNA靶基因功能注释11.1 C is作用功能注释11.2 T rans作用功能注释*（>=5个样本）12. 差异表达或特异性表达的靶基因功能分析*（>=2个样本）12.1 G O富集分析12.2 K EGG富集分析12.3差异LincRNA与靶基因调控网络分析二、个性化分析内容：1. l ncRNA g ene与转录组coding g ene比较分析（需要转录组数据的分析结果）1.1 长度分布比较1.2 表达水平比较1.3 组织或表型特异性比较1.4 保守性比较2. L ncRNA浏览器辅助建立。
诺禾致源再添一作成果组装新策略完成犬蝠基因组精细图谱并揭示食果蝙蝠免疫基因演化新机制
诺禾致源再添一作成果组装新策略完成犬蝠基因组精细图谱并揭示食果蝙蝠免疫基因演化新机制
近些年来，随着基因组学技术的发展和普及，动物的基因组结构如犬、蝠等动物的基因组分析也开始受到越来越多关注。
基于诺禾致源和其他研
究机构相关研究成果，我们最近又实施了一次新的策略来完成犬蝠基因组
精细图谱，并发现了食果蝙蝠免疫基因演化的新机制。
首先，为了完成精细图谱，我们首先采用了诺禾致源的高通量测序技术，对52份犬蝠基因组和17份食果蝙蝠基因组进行测序与建库，利用该
技术最终获得了更为精细的基因组图谱。
同时，利用该技术也可以获得更
准确的免疫基因定位信息，从而揭示了食果蝙蝠抗病毒免疫基因演化机制。
其次，我们还采用了高通量比对技术来获得犬蝠和食果蝙蝠的基因表
达水平。
我们在犬蝠和食果蝙蝠的基因组中从各种环境中提取和准备组织
样本，然后用高通量比对技术检测各个基因的表达水平，从而更准确地揭
示基因演化的机制。
最后，我们还采用了分子生物学技术，用单链接聚合酶链反应法（SLiP-PCR）来分析食果蝙蝠的基因组片段，获得更多的基因组信息。
多组学关联分析
Total RNA Genomic DNAsRNA文库sRNA序列Bisulfit e文库甲基化序列mRNA文库mRNA序列Illumina HiSeq测序ChIP文库蛋白结合的DNA序列rRNA fr ee文库lncRNA序列生命发展机理包含了多层次、多水平和多功能的复杂结构体系，借助高通量技术发展积累的大量组学信息和数据，整合多组学数据可以对生物系统进行更全面的了解。
目前，诺禾致源提供mRNA转录组数据与miRNA数据、甲基化数据、ChIP-seq数据的关联分析，LncRNA与mRNA、miRNA的关联分析，转录组数据与代谢组数据、蛋白组学数据等的相关生物信息学分析。
1. 根据合作伙伴的研究目的或提供的参考文献，请合作伙伴提供相应的数据；2. 根据合作伙伴提供的数据量和分析内容，评估项目周期；3. 生物信息学分析。
项目流程mRNA、miRNA、LncRNA、全基因组甲基化、ChIP-seq、代谢组、蛋白组学适用范围技术路线技术简介参考文献[1] He G, Chen B, Wang X, et al . Conservation and divergence of transcriptomic and epigenomic variation in maize hybrids [J]. Genome Biol, 2013, 14: R57.[2] Li X Z, Roy C K, Dong X, et al . An ancient transcription factor initiates the burst of piRNA production during early meiosis in mouse testes [J]. Molecular cell, 2013, 50(1): 67-81.案例解析［案例一］ 玉米杂交后代的表观水平变异及转录信息的保守性和 分散性研究[1]该研究旨在通过研究两个玉米（B73，M017）自交系（inbred lines）和正反交系／互交系（reciprocal hybrids）中玉米芽和玉米根的转录组和表观组学，从而获得玉米不同器官和不同遗传背景的玉米中转录水平和表观水平的信息。
水稻响应白叶枯病菌侵染的转录组分析
·815·水稻响应白叶枯病菌侵染的转录组分析张宇1，2，王金开2，陈小林1*，李其利1，唐利华1，黄穂萍1，郭堂勋1，玉延华2*（1广西农业科学院植物保护研究所/农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室/广西作物病虫害生物学重点实验室，广西南宁530007；2广西大学生命科学与技术学院，广西南宁530004）摘要：【目的】分析白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryae ，Xoo ）侵染不同时间点的水稻转录组数据，了解其响应侵染过程中抗病相关基因的表达情况，为明确水稻对白叶枯病菌感病机制以及培育新的抗白叶枯病水稻品种提供理论参考。
【方法】以含有广谱抗性基因Xa23的水稻品系CBB23为试验材料，对其叶片接种高致病性的野生型Xoo 菌株N3-1，将接种0、48和72h 水稻样品总RNA 进行转录组测序（RNA-Seq ）。
以|log 2Fold Change|≥1，且错误发现率（False discovery rate ，FDR ）<0.01为标准筛选差异表达基因（Differentially expressed genes ，DEGs ），并进行GO 功能注释和KEGG 通路富集分析；通过实时荧光定量PCR （qRT-PCR ）验证RNA-Seq 结果的可靠性。
【结果】RNA-Seq 转录组测序结果共获得约54.63Gb Clean data ，样品平均数据量约为6.07Gb ，Q30碱基准确率在94.34%及以上。
与对照组0h 相比，水稻CBB23在接种48和72h 两个时间点分别鉴定出2361和2117个DEGs ，其中48h 上调基因1650个、下调基因711个，72h 上调基因1440个、下调基因677个。
GO 富集结果表明，水稻的DEGs 显著富集于芳香族氨基酸的代谢及二萜类的生物合成。
KEGG 通路富集结果表明，DEGs 富集于苯丙氨酸和苯丙素类的生物合成。
真核Single cell 转录组
项目周期
单细胞转录组测序 分离新鲜的单细胞，推荐使用SMARTer试剂盒配套的裂解液裂解保存，立、8 Gb、10 Gb、12 Gb clean data
基因序列分析
参考基因组比对 基因组分布检查 新基因拼接与注释 可变剪切分析 差异表达外显子分析 反义转录本分析 SNP/InDel分析
[2] Xue Z, Huang K, Cai C, et al. Genetic programs in human and mouse early embryos revealed by single-cell RNA sequencing [J]. Nature, 2013, 500(7464): 593-597.
基因表达分析
参考基因组比对 测序饱和度分析 片段分布均一性检查 基因表达水平分析 差异表达基因分析 GO/KEGG富集分析 蛋白互作网络分析 基因共表达网络构建 可视化结果展示
单细胞扩增：10天；建库测序及信息分析：40天
案例解析
［案例一］ 单细胞转录组测序绘制人类胚胎细胞基因表 达图谱
诺禾致源携手北京大学，研究人类胚胎细胞的达情况。转 录组分析通常需要几万到几十万个细胞，然而受人类早期胚 胎样本的来源及特殊性的限制，人类对自身胚胎的认识和发 育机制的了解极其有限。本研究对早期胚胎不同发育阶段的 90个单细胞以及人类胚胎干细胞系（hESCs）的34个单细胞 进行了单细胞转录组测序，并进行详尽的生物信息学分析。
随着生物学研究的逐步深入，在多细胞或组织水平分析一个细胞群体内平均的基因表达水平已不能满足科研需求。单细胞RNA测序（Single cell RNA sequencing） 是在单细胞水平对mRNA进行高通量测序的一项新技术，可以研究单个细胞内的基因表达情况，可以有效解决细胞分子机制研究中常见的细胞异质性（如神经 细胞等）、细胞量少（如胚胎细胞和干细胞等）无法进行常规高通量测序等难题。
诺禾致源高分文章集锦-植物基因组
陆地棉基因组测序揭示四倍体棉进化与纤维发育机制Sequencing of allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum L. acc. TM-1) provides a resource for fiber improvement研究对象：陆地棉遗传标准系TM-1期刊：Nature Biotechnology影响因子：41.514合作单位：南京农业大学发表时间：2015年4月摘 要Upland cotton is a model for polyploid crop domestication and transgenic improvement. Here we sequenced the allotetraploid Gossypium hirsutum L. acc. TM-1 genome by integrating whole-genome shotgun reads, bacterial artificial chromosome (BAC)-end sequences and genotype-by-sequencing genetic maps. We assembled and annotated 32,032 A-subgenome genes and 34,402 D-subgenome genes. Structural rearrangements, gene loss, disrupted genes and sequence divergence were more common in the A subgenome than in the D subgenome, suggesting asymmetric evolution. However, no genome-wide expression dominance was found between the subgenomes. Genomic signatures of selection and domestication are associated with positively selected genes (PSGs) for fiber improvement in the A subgenome and for stress tolerance in the D subgenome. This draft genome sequence provides a resource for engineering superior cotton lines.关键词陆地棉；de novo；四倍体研究背景陆地棉（Gossypium hirsutum L.）隶属锦葵目（Malvales），锦葵科（Malvaceae），棉属（Gossypium），因最早在美洲大陆种植而得名，是世界上最重要的棉花栽培品种，占全球棉花种植面积的90%以上。
诺禾致源资料
CONTENTS
目录
建库测序
06 建库测序服务
基因组测序
08 动植物基因组测序 10 基因组特征评估 11 基因组de novo测序 14 泛基因组测序（pan-genome） 17 动植物重测序 18 变异检测（基于全基因组重测序） 20 变异检测（基于简化基因组测序） 22 单个性状定位 25 遗传图谱（基于全基因组重测序） 27 遗传图谱（基于RAD-seq简化基因组技术） 29 遗传图谱（基于GBS简化基因组技术） 31 群体进化（基于全基因组重测序） 33 群体进化（基于简化基因组测序）
测序策略
每台仪器数据产出
最低测序量
Q30
项目周期
建
PE300
13Gb data / 1 Run 13Gb data (1 Run)
微生物
55 16S/18S/ITS等扩增子测序 58 宏基因组测序 61 细菌基因组测序 64 真菌基因组测序 67 小基因组测序
1
诺禾致源 北京诺禾致源生物信息科技有限公司于2011年3月15日在北京中关村生命科学 园注册成立，以基因组学研究与应用开发为发展方向，致力于成为全球领先的基因组学研究解决方案提供者。专 注于开拓生物学、计算机科学和信息技术在动植物研究以及人类健康领域的应用。
[4] Li M, Tian S, Jin L, et al. Genomic analyses identify distinct patterns of selection in domesticated pigs and Tibetan wild boars[J]. Nature genetics, 2013, 45(12): 1431-1438.
微生物-扩增子测序
· 属水平物种进化树
为了进一步研究属水平物种的系统进化关系，通过多序列比对得到 top100属的代 表序列的系统发生关系，并结合每个属的相对丰度进行整合展示，由此可以得到这 些属的系统进化关系[3]。
组间群落结构差异显著性检验 Adonis 和 amova 分析
组间群落结构差异显著性检验在 Anosim 和 MRPP 分析的基础上，新增 adonis[4] 和 amova[5] 分析， 深度探索专属于您的样本类型的组间差异检验方法，全方位为您的数据保驾护航。
加量不加价；
福利 二
环境因子关联分析由高级分析免费 升级为标准分析，同时标准分析里 更有众多主流分析内容的增加；
升级内容 数据量
物种注释与统计 组间群落结构差异显著性检验
环境因子关联分析 （高级分析升级为标准分析）
Network 分析
升级点展示 分析点 3W免费升级为5W 5W 免费升级为10W GraPhlAn 图 ternaryplot（三元相图）分析 属水平物种进化树 Adonis 和 amova 分析 Spearman 相关性分析 Mantel test 分析 CCA/RDA 分析 VPA 分析 共发生网络图
升级亮点 深入挖掘低丰度新奇、稀有的物种信息。
让您样本中的优势物种直观显现。 三个样本（分组）间优势物种差异的最佳选择。
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真核无参转录组生物信息分析结题报告建库测序流程Total RNA样品检测文库构建上机测序北京诺禾致源生物信息科技有限公司一、建库测序流程从RNA样品到最终数据获得，样品检测、建库、测序每一个环节都会对数据质量和数量产生影响，而数据质量又会直接影响后续信息分析的结果。
为了从源头上保证测序数据的准确性、可靠性，诺禾致源对样品检测、建库、测序每一个生产步骤都严格把控，从根本上确保了高质量数据的产出。
实验流程图如下：1 Total RNA样品检测诺禾致源对RNA样品的检测主要包括4种方法：(1) 琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染(2) Nanodrop检测RNA的纯度（OD260/280比值）(3) Qubit对RNA浓度进行精确定量(4) Agilent 2100精确检测RNA的完整性2 文库构建及库检样品检测合格后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA（若为原核生物，则通过试剂盒去除rRNA来富集mRNA）。
随后加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成二链cDNA，随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA。
纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库。
文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度＞2nM），以保证文库质量。
文库构建原理图如下：3 上机测序库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina HiSeq/MiSeq测序。
北京诺禾致源生物信息科技有限公司二、生物信息分析流程对于无参考基因组的转录组分析，可先将测序所得的序列拼接成转录本，以转录本为参考序列，进行后续分析。
信息分析流程图如下：三、结果展示及说明1 原始序列数据高通量测序(如Illumina HiSeq TM2000/Miseq TM)得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列（Sequenced Reads），我们称之为 Raw Data或Raw Reads，结果以 FASTQ (简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列（reads）的序列信息以及其对应的测序质量信息。
FASTQ格式文件中每个read由四行描述，如下：@H W I-S T1276:71:C1162A C X X:1:1101:1208:24581:N:0:C G A T G TN A A G A A C A C G T T C G G T C A C C T C A G C A C A C T T G T G A A T G T C A T G G G A T C C A T+#55???B B B B B?B A@D E E F F C F F H H F F C F F H H H H H H H F A E0E C F F D/A E H H其中第一行以“@”开头，随后为Illumina 测序标识别符(Sequence Identifiers)和描述文字(选择性部分)；第二行是碱基序列；第三行以“+”开头，随后为Illumina 测序标识别符(选择性部分)；第四行是对应碱基的测序质量，该行中每个字符对应的 ASCII 值减去 33，即为对应第二行碱基的测序质量值。
Illumina测序标识符详细信息如下：HWI-ST1276Instrument – unique identifier of the sequencer71run number – Run number on instrumentC1162ACXX FlowCell ID – ID of flowcell1LaneNumber – positive integer1101TileNumber – positive integer1208X – x coordinate of the spot. Integer which can be negative2458Y – y coordinate of the spot. Integer which can be negative1ReadNumber - 1 for single reads; 1 or 2 for paired endsN whether it is filtered - NB：Y if the read is filtered out, not in the delivered fastq file, N otherwise0control number - 0 when none of the control bits are on, otherwise it is an even number CGATGThao Illumina index sequences2 测序数据质量评估2.1 测序错误率分布检查如果测序错误率用e表示，Illunima HiSeq TM2000/Miseq TM的碱基质量值用Q phred表示，则有：Q phred=-10log10(e)。
Illunima Casava 1.8版本碱基识别与Phred分值之间的简明对应关系见下表：Phred分值不正确的碱基识别碱基正确识别率Q-sorce 101/1090%Q10201/10099%Q20301/100099.9%Q30401/1000099.99%Q40对于RNA-seq技术，测序错误率分布具有两个特点，具体见图1：(1)测序错误率会随着测序序列(Sequenced Reads)的长度的增加而升高，这是由于测序过程中化学试剂的消耗而导致的，并且为illumina高通量测序平台都具有的特征(Erlich and Mitra, 2008; Jiang et al.)。
(2)前6个碱基的位置也会发生较高的测序错误率，而这个长度也正好等于在RNA-seq建库过程中反转录所需要的随机引物的长度。
所以推测这部分碱基的测序错误率较高的原因为随机引物和RNA模版的不完全结合所致(Jiang et al.)。
一般情况下，单个碱基位置的测序错误率应该低于1%。
图1 测序错误率分布图横坐标为reads的碱基位置，纵坐标为单碱基错误率前100bp 为双端测序序列的第一端测序 Reads的错误率分布情况，后100bp为另一端测序reads 的错误率分布情况。
2.2 A/T/G/C 含量分布检查GC 含量分布检查用于检测有无AT 、GC 分离现象。
对于RNA-seq 来说，因随机性打断及G/C 和A/T 含量分别相等的原则，理论上GC 及AT 含量每个测序循环上应分别近似相等(若为链特异性建库，可能会出现AT 分离和/或GC 分离)，且整个测序过程基本稳定不变，呈水平线。
但在现有的高通量测序技术中，反转录成cDNA 时所用的6bp 的随机引物会引起前几个位置的核苷酸组成存在一定的偏好性，这种波动属于正常情况。
如图 2 所示：图2 GC 含量分布图横坐标为reads 的碱基位置，纵坐标为单碱基所占的比例；不同颜色代表不同的碱基类型前100bp 为双端测序序列的第一端测序Reads 的GC 分布情况，后100bp 为另一端测序reads 的GC 分布情况。
2.3 测序数据过滤测序得到的原始测序序列（Sequenced Reads）或者 raw reads，里面含有带接头的、低质量的reads，如图3所示。
为了保证信息分析质量，必须对raw reads过滤，得到clean reads，后续分析都基于 clean reads。
数据处理的步骤如下：(1) 去除带接头(adapter)的reads；(2) 去除N(N表示无法确定碱基信息)的比例大于10%的reads；(3) 去除低质量reads(质量值sQ <= 5的碱基数占整个read的50％以上的reads)。
RNA-seq的接头信息：TruSeq® RNA and DNA Sample Prep Kits (v1 and v2) 2,5TruSeq Universal Adapter（5’端接头）5’ AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTruSeq Adapter（3’端接头，带下划线的 6bp 的碱基为 Index，共有24种Index）5’ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG图3 原始数据组成不同颜色的比例分别代表不同成分比例(1)Adapter related：因有接头，过滤掉的 reads数及其占总 raw reads数的比例。
(2)Containing N：因 N含量超过 10%，过滤掉的 reads数及其占总raw reads数的比例。
(3)Low quality：因低质量，过滤掉的reads数及其占总raw reads数的比例。
(4)Clean reads：最终得到的 clean reads 数及其占总 raw reads 数的比例。
2.4 测序数据质量情况汇总样品测序产出数据质量评估情况详见表1。
表1 数据产出质量情况一览表Sample Raw Reads Clean reads Clean bases Error(%)Q20(%)Q30(%)GC(%) VIYCK_15145489450205417 5.02G0.0397.8992.4845.55 VIYCK_25145489450205417 5.02G0.0397.6892.7845.45 VIYCd_14283315141793838 4.18G0.0398.4694.4645.45 VIYCd_24283315141793838 4.18G0.0397.5492.9745.38 Sample: 样品名。
1为左端reads，2为右端reads。
样品的 clean reads 总数为左端+右端。
Raw reads：统计原始序列数据，以四行为一个单位，统计每个文件的测序序列的个数。
Clean reads：计算方法同 Raw Reads、Raw bases，只是统计的文件为过滤后的测序数据。