华大转录组测序内部培训资料
转录组测序ppt课件
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2019/5/5
环境转录组也可以这样做
• 使用RNA-seq手段对实验样本进行转录组分析，关注个体或者组织器 官在不同环境条件下基因表达的动态变化，挖掘生物对逆境适应的分 子机制。
转录组？
• 转录组是特定组织或细胞在某一功能状态下所能 转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码 RNA。
• 转录组（transcriptome）广义上指某一生理条件 下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、 核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有 mRNA的集合。蛋白质是行使细胞功能的主要承担 者，蛋白质组是细胞功能和状态的最直接描述， 转录组成为研究基因表达的主要手段，转录组是 连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必 然纽带，转录水平的调控是目前研究最多的，也 是生物体最重要的调控方式。
3. DNA成簇（Cluster）扩增
4. 高通量测序（Illumina Genome Analyzer IIx）信息分析流程
生物信息分析
基本信息分析
• 数据量产出：>2Gb per sample • 测序策略：HiSeq2000, PE91 or 101 • 插入片段大小：200 bps • 测序质量控制：Q20% >80
相关概念
• 高通量测序中，每测一个碱基会给出一个相应的质量值， 这个质量值是衡量测序准确度的。Q20与Q30则表示质量值 大于等于20或30的碱基所占百分比。
• Q20值是指的测序过程碱基识别过程中，对所识别的碱基 给出的错误概率。
• 质量值Q20，错误识别概率是1%，即正确率是99%； 质量值Q30，错误识别概率是0.1%，即正确率是99.9%； 质量值Q40，错误识别概率是0.01%，即正确率99.99%； Q“N”0的质量值，就是正确率有N个9的百分比。
华大测序原理
华大测序原理华大测序作为一种先进的基因组测序技术，已经在生物学研究、医学诊断和精准医疗等领域得到了广泛的应用。
其原理主要是通过高通量测序仪器对DNA或RNA进行测序，从而获取基因组或转录组的信息。
本文将介绍华大测序的原理，并探讨其在科学研究和临床实践中的重要性和应用。
华大测序的原理基本上可以分为四个主要步骤：DNA提取、文库构建、测序和数据分析。
首先，研究人员需要从细胞或组织中提取DNA或RNA样本，然后将其进行裂解、纯化和酶切等处理，最终得到可用于测序的DNA文库。
接下来，将DNA文库加载到高通量测序仪器中，通过测序仪器对DNA进行高效、快速、准确地测序，生成大量的测序数据。
最后，通过生物信息学分析软件对测序数据进行处理和解读，得到基因组或转录组的信息，如基因序列、基因表达水平、基因变异等。
华大测序的原理主要基于测序仪器中的测序反应：首先，在测序反应中，DNA或RNA样本会被分离成单链，并与引物结合形成DNA-RNA杂交链。
然后，通过引物的引导，DNA聚合酶在模板链上合成新的DNA链，生成DNA-RNA杂交链。
接着，通过碱基测序技术，测序仪器会逐一加入不同的荧光标记的核苷酸，根据荧光信号的强度来确定每个核苷酸的顺序，最终完成整个DNA或RNA序列的测序。
通过这种方式，可以高效地获取基因组或转录组的信息，为后续的生物学研究和临床诊断提供重要的数据支持。
华大测序在科学研究和临床实践中具有重要意义和广泛应用。
在科学研究方面，华大测序可以帮助研究人员解析基因组结构、功能和调控机制，揭示疾病发生发展的分子机制，探索生物多样性和进化等重要科学问题。
在临床实践方面，华大测序可以用于疾病的早期诊断、个体化治疗和精准医疗，为疾病的预防、诊断和治疗提供重要的依据和支持，为患者的健康和生命质量带来显著的改善。
华大测序作为一种先进的基因组测序技术，其原理简单明了，应用广泛多样。
通过高通量测序仪器对DNA或RNA进行测序，可以快速、准确地获取基因组或转录组的信息，为科学研究和临床实践提供重要的数据支持。
华大测序原理
华大测序原理华大测序原理是指利用高通量测序技术对DNA进行分析、检测和解读。
这一技术在基因组学、转录组学、表观遗传学等领域发挥着重要作用，并成为生命科学研究的重要工具之一。
华大测序原理的基本步骤包括DNA文库构建、片段扩增、测序和数据分析。
其中，DNA文库构建是第一步，也是最关键的一步。
文库构建包括DNA片段的断裂、连接、扩增和纯化等过程，其中使用的酶、引物和缓冲液等组分对文库质量和测序结果有着至关重要的影响。
在文库构建完成后，需要对DNA进行片段扩增。
扩增过程中，利用PCR技术对DNA进行多轮复制，从而得到足够数量的DNA片段用于测序。
片段扩增的过程中需要考虑引物的设计、扩增条件的优化等因素，以确保扩增效率和扩增产物的质量。
接下来是测序阶段。
高通量测序技术包括Illumina、Ion Torrent、PacBio等多种类型，其中Illumina测序技术是目前应用最广泛的一种。
Illumina测序技术采用的是文库桥式扩增法，即将文库DNA 固定在玻璃芯片上，通过桥式扩增法将文库DNA分子扩增成数百万份，然后通过高通量测序仪进行测序。
这种技术具有高通量、高分辨率、高准确度、低成本等优点，已成为目前最常用的测序技术之一。
最后是数据分析。
数据分析是测序中最为复杂和关键的一步，包括序列质量控制、序列比对、变异分析等多个环节。
其中序列质量控制是最基础的一步，主要是对测序产生的序列数据进行质量评估和过滤，以保证数据的准确性和可靠性。
序列比对是将测序产生的序列数据与参考序列比对，以确定样品中的基因型信息；变异分析则是针对比对结果进行靶向分析，以发现样品中的突变或变异信息。
总体而言，华大测序原理是一种高速、高效、高准确度的测序技术。
它已成为生命科学研究中不可或缺的工具，为我们深入了解生命的本质和探索未知领域提供了有力支持。
转录组测序原理.pptx
激发碱基荧光并收集荧光信号
去除阻断基团和荧光基团
Cycle 2-n:
重复前面的步骤
第16页/共40页
ห้องสมุดไป่ตู้基片段杂交
OH
diol
P7 P5
Flow Cell接头
diol diol
模板杂交
diol diol
延长
diol diol
变性
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Cluster station
• 剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，
Throughput : up to 25 Gb per day
Output 26-35 Gb 75-100 Gb 150-200 Gb
第15页/共40页
基于SBS测序技术
3’-
…-5’
5’-
GTATTTTCGGCACAG
A
G
A
C
T
T
C TG
Cycle 1:按顺序加入反应试剂
合成第一个碱基
清除未反应的碱基和试剂
第25页/共40页
鉴定基因可变剪接
exon1
common reads
exon2
exon3
mRNA
exon1
junction reads
exon3
exon1
exon2
exon3
第26页/共40页
鉴定融合基因
第27页/共40页
Paired Reads distribution
Reads cluster
主要内容• 样品检测 • 制备 • Cluster Station • Illumina Sequencing • 生物信息分析
第14页/共40页
新一代测序技术
转录组转录组及转录组测序
第一章转录组及转录组测序第一节前言1953年，沃森与克里克对DNA双螺旋结构的精确描绘开创了生命科学的黄金时代，随后如火如荼的开展起来的人类基因组计划建立起庞大复杂的基因组数据库使人类对了解生命本源和控制生命进程燃起无限憧憬。
随着越来越多的基因测序工作渐渐完成，一本“写满生命密码的天书”呈现在我们面前, 然而，接下来的问题更纷扰而至：1) 这些基因有什么功能？2) 不同的基因参与了哪些细胞内不同的生命过程？3) 基因的表达是如何调控的呢？4) 基因与基因产物之间是如何相互作用的呢？5) 相同的基因在不同的细胞内的表达水平有差异吗？6) 相同的基因处于疾病和治疗状态下的表达水平会有哪些改变？如何读懂这本“天书”是目前横亘在科学家们面前严峻的挑战。
因此，在人类基因组项目后，转录组学，蛋白组学，代谢组学等组学不断涌现，生命科学研究已经跨入后基因组时代。
其中，转录组学作为一个率先发展起来的学科是研究细胞表型和功能的一个重要手段，转录组高通量测序技术开始在生物学前沿研究中得到了广泛的应用。
第二节转录组（transcriptome）与转录组学（transcriptomics）读懂基因组这本“天书”，最先要研究清楚基因是怎么表达的。
所谓基因表达，是指将基因携带的遗传信息转变为可辨别的表型的整个过程。
基因表达的第一步, 也即基因表达调控的关键环节，是以DNA为模板合成RNA的转录过程。
转录后的所有mRNA的总称即转录组。
由转录组延伸出来一门学科即转录组学，它是分子生物学的分支，负责研究在单个细胞或一个细胞群的特定细胞类型内所产生的mRNA分子，是从RNA层次研究基因表达的情况。
第三节转录组研究的重要性转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的纽带，转录水平的调控是最重要也是目前研究最广泛的生物体调控方式。
转录组的研究比基因组的研究能给出更高效的有用信息。
比如，人类基因组包含有30亿个碱基对，其中大约只有5万个基因转录成mRNA分子，而转录后的mRNA仅部分被翻译生成功能性的蛋白质。
转录组测序
转录组测序转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA。
转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息。
高通量转录组测序技术，无需了解物种基因信息，能够对任意物种进行转录组分析，并接测定每个转录本的片段序列，精确到单核苷酸的分辨率；动态达6个数量级，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本，以及检测基因家族中相似基因和可变剪接造成的不同转录本的表达；被广泛的应用于转录本结构研究（基因边界鉴定、可变剪切研究等），转录本变异研究（如基因融合、编码区SNP 研究），非编码区域功能研究（Non-coding RNA研究、microRNA前体研究等），基因表达水平研究以及全新转录本发现。
转录组测序的优势1 单次转录组测序实验即可提供全面的转录组信息2 转录组测序无需预先知道任何序列信息3 转录组测序提高了动态检测范围和灵敏度4 转录组测序可提供转录本中序列变异信息技术流程：数据分析：有参考基因组的转录组分析1、测序数据质量评估我们将测序得到的所有序列与目前常见物种进行大规模随机blast，检测可能的样品污染。
同时，我们对测序得到的序列进行深度和覆盖度的计算以评价序列质量。
2、Reads比对到基因组我们将测序结果与参考基因组进行比对, 比对的reads 中mismatch 的数目可以根据客户需要进行分析, 并挑选出unique map的所有reads用于后续peak的分析。
同时进行reads的基因定位，用于后续分析。
3、Reads在基因组上的分布4、新转录本的寻找在每个样本中，都有一部分mapping不上已注释基因，但是能mapping 上基因组上的reads,通过提取这些reads比对在基因组上的序列，利用同源预测或者denevo预测，从而预测一些新的转录本。
华大基因转录组结题报告(de novo)
公认 P value 为
时该基因表达差异极显著。
表 6 两个样品之间 Scaffold-gene 表达差异分析：（以结果表格的一部分示例）
2.1 实验流程说明........................................................... 3 2.2 信息分析流程说明....................................................... 3 三、 项目结果报告............................................................ 4 3.1 数据处理和质控报告..................................................... 4
三、 项目结果报告
3.1 数据处理和质控报告
3.1.1 原始测序数据产量
说明：测序的数据产量是合同的重要指标，按合同规定，1 个样品的测序产量(base pairs) 应不少于 1Gb ，该项工作的完成情况见下表：
表 1 测序数据统计结果 Strains Sample A Sample B
Total Reads 17,524,548 17,604,310
3.2.5 Scaffold-gene表达差异分析
说明：我们利用软件 soap 将不同样本中得到的 Reads 比对到 scaffold-gene 上，获得 scaffold 上 reads 的数目，然后计算 scaffold 在不同样本之间表达差异的 P value，一般
6
华大基因转录组分析（de novo）结题报告
结果已审阅，同意交付。
签名：
日期：
年月日
测序方向培训课程第七节：《测序问题troubleshooting》 [修复的]
![测序方向培训课程第七节：《测序问题troubleshooting》 [修复的]](https://img.taocdn.com/s3/m/365c2dc3852458fb760b5610.png)
判断。 • 改：找出问题本质，针对问题选择可行措
施。 • 跟：对问题改进措施的效果跟进。
看
• BMS参数：
关注点
判断标准
备注
Raw cluste
80
Q20，30
质量产量标准
Illumina官方公布平均 Q30>80
control lane
• 目的： 作为校正phasing/prephasing等matrix。
• 注意事项： 1. Miseq并无control lane，illumina认为加入
Phix是其不需要control lane的原因。 2.rol3;目的片段+8bp index+6bp index+A+目的片段
R1
R2
Recognize a problem
Forsmid PINhwwDMSZMB0所以 前6bp（或11bprol & control lane
原理：
早期聚焦仅以T channel来看，目前改进为：
A/C (红激光）：至少有一种碱基，且 >50k/mm2
G/T(绿激光） ：至少有一种碱基，且 >上机异常情况，试剂批次：C转化为T，R1 无C碱基，R2 无G碱基。 由于AC光谱有重叠，GT光谱有重叠，所以会有crosstalk,AC>GT。
crosstalk
滤波片
A
C
A
Cห้องสมุดไป่ตู้
光谱
光谱
不利：不能直接比较光强度大小而得到碱基 有利：利用图片中共同的亮点，将所有图片对齐重叠，解决offset
• 当在cycle72和cycle73之间补N后，数据重新 比对，错误率恢复正常~
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（内部资料，请勿外传）动植物转录组（Transcriptome ）产品说明书科技服务体系 动植物研究方向版本信息：2011年07月08日目录1产品概述 (1)1.1 什么是转录组测序 (1)1.2 转录组测序的产品功能 (1)1.3 转录组测序产品优势 (1)1.4 转录组测序产品发展史 (1)1.5 项目执行时间 (3)1.6 产品交付结果 (3)2转录组测序研究方法 (4)2.1 产品策略 (4)2.2 样品准备 (5)2.2.1 RNA样品要求 (5)2.2.2 RNA样品送样标准 (6)2.2.3 RNA提取的组织用量建议 (6)2.3 样品运输要求 (7)2.3.1 样品包装 (7)2.3.2 样品标识 (8)2.3.3 样品运输条件 (8)2.4 文库的构建及测序 (9)2.4.1 实验流程 (9)2.4.2 测序及数据处理 (10)2.5 转录组生物信息学分析 (10)2.5.1 没有参考序列的转录组De novo (10)2.5.2 有参考序列的转录组Re-sequencing (18)2.5.3 参考文献 (24)3成功案例 (25)3.1 华大成功案例 (25)3.2 相关文献解读 (26)1产品概述1.1什么是转录组测序？转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA。
转录组测序是指用新一代高通量测序技术对物种或者组织的转录本进行测序并得到相关的转录本信息。
1.2转录组测序的产品功能1.获得物种或者组织的转录本信息；2.得到转录本上基因的相关信息，如：基因结构，功能等；3.发现新的基因；4.基因结构优化；5.发现可变剪切；6.发现基因融合；7.基因表达差异分析。
1.3转录组测序产品优势覆盖度高：检测信号是数字信号，几乎覆盖所有转录本；检测精度高：几十到数十万个拷贝精确计数；分辨率高：可以检测到单碱基差异，基因家族中相似基因及可变剪切造成的不同转录本的表达；完成速度快：整个项目周期只需要50个工作日时间；成本低：基本上每个实验室可以承担相关研究经费。
1.4转录组测序产品发展史转录组的研究手段大体包括：EST序列构建及研究，芯片研究，运用第二代测序技术研究等。
EST是从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次sanger测序获得的短的cDNA 部分序列,代表一个完整基因的一小部分,在数据库中其长度一般从20 到7000 bp不等,平均长度为360 ±120 bp。
EST 来源于一定环境下一个组织总mRNA 所构建的cDNA 文库,因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。
基因芯片研究（microarray）是将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析基因表达差异。
高通量测序技术研究转录本则是利用第二代测序技术，直接对全部转录本进行研究，无需繁琐的建库流程，就可以得到高覆盖度高精度的转录本信息。
尤其是基于Illumina高通量测序平台的转录组测序技术使能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测。
在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），提供最全面的转录组信息。
表1-1转录组研究技术比较高通量测序技术研究转录本以低成本为主要特征，目前世面上的转录组测序产品主要有Roche 454和Illumina HiSeq 2000为平台的产品。
Roche 454测序仪读长较长，但是在判断连续单碱基重复区时准确度不高；Illumina HiSeq兼有高通量、高准确度、低成本的优点，美中不足的就是读长低于454。
为此，华大基因专门针对Solexa，开发了专门的基因组组装软件SOAPdenovo。
随着第一篇完全利用Solexa技术完成的熊猫基因组文章的发表，华大SOAPdenovo软件的组装效果也同时获得了科学界的一致肯定。
至此，华大基因组测序与组装走在了世界的前列。
同时，华大的基因组测序也走向了产业化，大量的转录组项目为华大的信息分析人员积累了更多的测序和组装经验，将为客户提供世界顶级的转录组测序组装服务。
1.5项目执行时间从样品检测合格开始，不包括由于样品问题停滞的时间，动植物转录组测序、及生物信息分析整体的完成周期为50个工作日。
1.6产品交付结果交付指标：数据量1.基因组极大的物种，如：小麦，玉米等，建议8 Gb；2.普通基因组物种，建议4 Gb。
交付数据：标准信息分析（无参考序列）1. 对原始数据进行去除接头、污染序列及低质量reads的处理2. 数据产出统计及测序数据的成分和质量评估3. 组装结果分析（Contig长度分布、Scaffold长度分布、Unigene长度分布）4. Unigene功能注释5. Unigene的GO分类6. Unigene的COG分类7. Unigene代谢通路分析8. 预测编码蛋白框（CDS）9. Unigene表达差异分析（两个或两个以上样品）10. Unigene在样品间的差异GO分类（需两个或两个以上样品）和Pathway富集性分析●定制化信息分析1.多个样品做de novo分析时，分析并提供每个样品的Unigene的GO、pathway等结果2.将Hiseq数据与其他数据如EST等联合组装（需要客户提供其他数据）标准信息分析（需提供参考基因序列、参考基因组序列及基因注释结果）1. 对原始数据进行去除接头、污染序列及低质量reads 的处理2. 测序评估（比对统计、测序随机性评估、Reads在基因组上的分布）●高级信息分析（基于1-2标准分析）3. 基因表达注释（基因覆盖度、覆盖深度分布等）4. 基因差异表达分析（两个或两个以上样品）5. 对基因结构进行优化（仅针对真核生物）6. 鉴定基因的可变剪接（仅针对真核生物）7. 预测新转录本8. SNP分析（仅针对真核生物）●定制化信息分析1.将两个样品之间的可变剪切进行比较分析, 统计几个样品间的可变剪切和新转录本的异同2.基因融合分析3.组与组之间的的差异分析4.重复间的数据相关性分析2转录组测序研究方法2.1产品策略转录组de novo产品策略：图2-1：转录组de novo产品策略有ref的转录组re-sequencing产品策略：图2-2：有ref的转录组re-sequencing产品策略2.2样品准备2.2.1RNA样品要求1.样品类型：去蛋白并进行DNase处理后的完整总RNA；2.样品需求量（单次）：植物样品：≥ 20 μg；人、大鼠、小鼠样品：≥ 5 μg；其他类型动物：≥ 10 μg；3.样品浓度：植物样品：≥ 400 ng/μl；人、大鼠、小鼠样品：≥ 80 ng/μl；其它类型动物样品：≥ 200 ng/μl；原核生物样品：≥ 500 ng/μl；4.样品纯度：OD260/280= 1.8~2.2；OD260/230 ≥ 2.0；动物植物样品：RIN ≥ 7.0，28S:18S ≥ 1.0；原核生物样品：RIN ≥ 6.0，23S:16S= 1.2~2.2。
2.2.2RNA样品送样标准合作伙伴需要提供Nanodrop、Gel-Electrophotometric 或者Aglient中一种或多种形式的样品分析结果；应仔细纯化样品，尽量避免多糖、蛋白质、和外切酶的残留；样品必须注明溶剂成分。
表2-1：转录组送样标准2.2.3RNA提取的组织用量建议表2-2：转录组RNA提取组织用量建议注：不同类型的样品RNA产量差别较大，像人或哺乳动物的全血中红细胞没有细胞核，每毫升血液中实用细胞数少，RNA得率低，送样量需要加大；鸟类或鱼类的血液中红细胞含有细胞核，可适当减少送样量；含肌纤维和脂肪一类物质以及含多糖多酚较高的复杂植物，RNA得率一般较低，送样量需要增加；代谢活跃的肝脏组织细胞量旺盛，每50 mg组织可达20~30 ug RNA，可适当降低送样量。
2.3样品运输要求2.3.1样品包装对于RNA样品，我们建议合作伙伴尽量用1.5 ml Eppendorf管装载样品，为了防止Eppendorf管在运输过程中受到挤压破裂，导致样品损失，最好将Eppendorf管装在50 ml离心管（或其他支撑物）中，里面还可以添加棉花、吸水纸等固定。
如是大批量样品，请用冻存盒之类的存放盒装好样品，防止样品受损。
（注意：切勿在50 ml管内或其他支撑物内加入液氮等危险品）。
图2-3：在15 ml EP管中装棉花或包膜固定样品管对于组织样品，一般建议用1.5 ml的Eppendorf管，或2 ml的螺旋管装载。
在样品运输过程中请用parafilm膜将管口密封好。
不建议样品溶于无水乙醇、异丙醇等有机溶剂邮寄，因为有机试剂比较容易泄露、泄露后容易使管壁字迹模糊，甚至造成样品交叉污染。
如果一定需溶于有机溶剂运输，那么Eppendorf 管的管口至少要用parafilm膜封5圈以上。
图2-4：用封口膜封好对于血液样品，可用5~10 ml 抗凝管装载，但为了防止抗凝管在运输过程中受到碰撞而破裂，需要将抗凝管放在泡沫或棉花中固定，并彼此隔开。
2.3.2 样品标识不建议用油性笔直接在管壁或管盖上写样品名称等信息，最好将样品名称等各种信息写在标签纸上，贴在管壁，外面再用透明胶带缠绕一圈（一方面防止样品名称被泄露的有机溶剂溶掉，另一方面也可以防止标签纸没有粘牢脱落，导致样品无法应用）。
图2-5：管壁上先用纸条写好，再用胶片缠绕；PCR 板请在侧面标记，再用胶布贴好 邮寄样品时，必须附有我们华大提供的标准格式的样品信息单（电子版、文字版），请合作伙伴仔细检查，务必保证信息单中填写的样品名称、数量需要与实际邮寄的样品名称标识、样品数量完全一致。
2.3.3 样品运输条件a) DNA 样品如果用乙醇沉淀，则可以常温运输，否则在运输过程中，应放于干冰中，时间不要超过72小时；或利用冰袋运输，时间最好不要超过24小时；b) RNA 、组织样品无论溶于什么溶剂，都需放于干冰中运输，时间不要超过72小时；c)血浆要保存在干冰中运输，确保样品送达接收地点时有足量的干冰剩余，并及时存放血浆于-80℃冰箱中，禁止将样品在室温状态下放置；全血要在生物冰袋条件下运输，且在12小时内送达；d)运输过程中需要添加的干冰和冰袋的量与季节、运输时间长短、泡沫盒的薄厚有关（为更有利于保温，尽量选用大块的干冰，如果条件允许，建议可在邮寄的泡沫盒的上下填充一些棉花等，以隔绝热量的传递）。
2.4文库的构建及测序2.4.1实验流程图2-6：转录组实验流程提取样品总RNA后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA（若为原核生物，则用试剂盒去除rRNA后进入下一步）。