荧光分析法的应用PPT课件

相互作用，使荧光物质的荧光量子效率降低或激发态寿命缩
短，从而导致荧光强度降低的现象。荧光强度降低分为：动
态猝灭和静态猝灭。动态猝灭是指猝灭剂与荧光物质的激发
态分子之间所发生的与扩散有关的相互作用过程；静态猝灭
是猝灭剂和荧光物质分子在基态时生成不发光的配合物，从
而导致荧光强度降低的过程。
MB对三种氨基酸发生的荧光猝灭，其应遵循Stem-
色氨酸(Tryptophan，简称Trp)、酪氨酸(Tyrosine，简称Tyr)及 苯丙氨酸(Phenylalanine，简称Phe)是三种芳香族氨基酸，是构成 蛋白质和多肽的主要物质，是生物体中不可缺少的营养成分之 一。这三种氨基酸具有荧光，也是蛋白质天然荧光的主要来源， 其具有广泛的用途。
开展药物与氨基酸的相互作用研究，有助于深入了解药物作 用机制及在体内运输、代谢过程，而且对于新型药物的设计具有 重要的指导作用。
荧光分析法的应用
•荧光光谱法研究亚甲蓝与三种 芳香族氨基酸的相互作用
•荧光分析法测定肉类食品中诺氟 沙星的残留
荧光光谱法研究亚甲蓝与三种
芳香族氨基酸的相互作用
前言：
亚甲蓝(Methylene blue，简称MB)，即3，7-双(二甲氨基)吩 噻嗪-5-翁氯化物，是一种常见的吩噻嗪类药物，其与蛋白质具有 很好的亲和力，可以改变药物在生物体内的分配和代谢。其可用 作癌症光化学治疗剂、起到协同抗肿瘤作用，以及肿瘤染色标记 等；另外，亚甲蓝对细胞具有明显的解毒功效，在镇痛、抗菌、 抗病毒等方面也有明确的治疗作用。因此研究亚甲蓝的药理作用 是十分有意义的工作。
由图可见，Trp、Tyr和Phe的最大荧光发射波长分别为346、 303nm和282nm，随着MB浓度递增，Trp、Tyr和Phe荧光强度均逐渐 降低，荧光光谱峰形保持不变，MB-Trp最大吸收位置红移约3nm， MB-Tyr红移约5nm，MB-Phe荧光峰蓝移约3nm。以上实验结果说明 MB与Trp、MB与Tyr以及MB与Phe发生相互作用导致Trp、Tyr和Phe 发生了荧光猝灭现象。
荧光光谱测定：
分别恒定温度在298.15K和310.15K条件下，按实验需要，准确 移取一定量的MB和各氨基酸标准溶液于10mL容量瓶，用 pH7.4的Tris-HCI缓冲溶液定容，水浴恒温振荡1h，然后冷却 至室温，置于1cm的石英比色皿中，设置荧光光谱仪的激发和 发射光栅狭缝均为5nm，光电倍增管电压为700mV，扫描速度 为300nm·min-1，在此条件下记录280nm～550nm范围内的荧光 光谱。
与三种芳香族氨基酸均形成基态复合物而导致的静态猝灭 过程，而非由扩散过程控制的动态猝灭过程 。
三、亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的表观结合常 数Kc与结合位点数n
小分子间结合的表观结合常数Kc和结合位点数n可由式 (2)求出：
lg[(F0-F)/F]=lgKc+nlgc (2) 在298.15K和310.15K下分别作MB与三种氨基酸作用的 lg[(F0-F)/F]～lgc的双对数图，如图5所示。
插图为荧光猝灭值(F0-F)对cMB(2×10-6～2.3×10-5mol/L )的线性 拟合曲线，其中F0和F分别表示不加入和加入MB的荧光强度。相应 回归方程的相关系数均在0.99以上，呈现很好的线性相关性，表明该 法可用于痕量MB的测定。
二、亚甲蓝对三种芳香族氨基酸的荧光猝灭机理
荧光猝灭是溶液中猝灭体分子和荧光物质分子之间发生
由图5线性拟合的截距和斜率，分别获得两温度下的Kc、n 和线性回归系数R2，结果见表2：
得出以下结论：(1)MB与三种芳香族氨基酸的摩尔结合 比n接近1：1，表明MB分子与氨基酸分子体积较为接近，一 分子亚甲蓝基本是与一分子氨基酸结合；(2)相应的结合平衡 常数Kc值的数量级均在105以上，表明MB与Trp、Tyr和Phe之 间有较强的结合作用。
结果显示，MB-Trp、MB-Tyr和MB-Phe作用过程中， 随着温度升高Ksv减小，说明升高温度可能降低了复合物的 稳定性，从而使猝灭常数下降。由此推断MB对Trp、Tyr和 Phe均为静态猝灭作用。
Trp、Tyr和Phe的荧光寿命分别为3.1×10-9s、3.6×10-9s 和6.8×10-9s。根据式(1)，由Ksv值计算得到Kq值及各线性回 归方程相关系数R1 ，结果列于表1。表明，MB与上述三种 氨基酸的线性拟合程度较好，且得到的Kq值均在1013数量级 以上，远大于各种猝灭体对生物大分子的最大扩散猝灭常 数2×1010L·mol-1·s-1，由此推断其荧光猝灭机制是由于MB
四、亚甲蓝与三种芳香族氨基酸相互作用力类 型的确定
药物和生物分子之间的相互作用力主要包括氢键、范 德华力、静电作用和疏水作用等。本文在298.15K和 310.15K下，基于范特霍夫方程计算相应的热力学参数 ， 研究MB与三种芳香族氨基酸之间的相互作用力。由于△ rHm随温度变化很小，故将△ rHm近似为常数，由式(3)～ 式(5)计算MB与三种芳香族氨基酸结合的热力学参数△ rHm，△rGm 和△rSm ，结果列于表3。
溶液配制：
配制浓度为2×10-4mol/L 的MB储备液；Trp、Tyr和Phe储备液 的浓度分别为2×10-4mol/L、2×10-4mol/L 和2×10-3mol/L (2×10-3mol/L、2×10-3mol/L 和2×10-2mol/L )；配制0.02mol/L 的ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液(含0.1mol/L 的NaCl以恒定的溶液离 子强度)。光谱测定所需溶液均使用缓冲溶液稀释、定容。
结果与讨论
一、亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的荧光猝灭光谱
分别固定Trp、Tyr和Phe浓度，依次递增MB浓度，设置Trp、 Tyr和Phe激发波长为277nm、273nm和260nm，在相同实验条 件下，分别测定298.15K和310.15K时MB与Trp、MB与Tyr以及 MB与Phe相互作用荧光光谱。
Volmer方程：
F0/F-1=Ksvc=Kqτ0c
(1)
式中，F0和F分别表示不存在和存在猝灭剂的荧光强度；
c为猝灭剂浓度，Ksv为动态Stern-Volmer猝灭常数，Kq是由扩
散过程控制的双分子动态猝灭速率常数，τ0为没有猝灭剂存
在下荧光分子平均寿命。
根据式(1)绘制三种氨基酸分别在298.15K和310.15K下的( F0/F-1)～C的线性拟合曲线(如图4所示)。