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摘 要

人白细胞介素13

（interleukin 13，IL －13）是近年来发现的一种细胞因子，是造血因子家族的新成员，具有调节B 淋巴细胞及单核细胞、抑制HIV 复制、促进原始造血前体细胞的增殖及分化等功能。本论文用超声波核化学渗透两种细胞粉碎方法对IL －13基因工程菌进行了细胞破碎实验，并系统地考察了pH 、温度、时间、化学试剂等因素对细胞破碎效果的影响，得出了最佳的细胞破碎核包涵体融解工艺条件。将破碎后的菌悬液用双水相萃取的方法进行了目标产物的初步分离纯化，并对双水相体系的各影响因素进行了深入细致的研究。这将为我们进一步地研究以包涵体形式存在于基因工程菌内地目标产物分离纯化新方法打下良好的基础。

关键词

Abstract

Interleukin (IL-13) is a recently descried protein and a member of the family of hematopoietics. It is a protein in vitro modulator of B lymphocyte and monocyte functions. Recently, it was

reported that it also could

inhibit the HIV replication in monocyte and regulate proliferation and differentiation of primitive hematopoietics progenitor cells. In this study, we try disrupting JM109 cells by means of ultrasonic and chemical osmosis, primarily testing the functions of pH,temperature,time,chemical reagent and so on, and achieving an optimal process of cell disruption and inclusion solution. In addition, we carry on the partition of GST-IL-13 by aqueous two-phase

Key words ：IL-13,inclusion, celldisruption, aqueous two-phase, Partition

目录

第一章 前言1

1.1 发展生化“下游”技术的意义错误!未定义书签。 1.2基因工程蛋白质分离纯化的原则1 1.3现有白细胞介素－13的分离纯化方法7 1.4蛋白质分离纯化的方法9 1.5本论文的立项背景及研究内容12 第二章 实验材料与方法13

2.1概述13

2.2实验材料与方法15 第三章 实验结果与讨论17

3.1GST －IL －13的诱导培养17 3.2GST －IL －13总含量的测定20 3.3化学破碎22

3.4GS 双水相萃取的研究23 第四章 结论与展望24

4.1结论24

4.2对进一步研究的展望26 参考文献27 致 谢28 附 录29

第一章前言

1.1 发展生化“下游”技术的意义

现代生物技术的迅猛发展使当今世界发生了日新月异的变化。迄今为止，人

1.2

生物产品有许多使生物高分子，必须考虑到产品的变性和活性恢复等问题。如果选取的条件合适，也可以通过耦合不同技术来改进分离工艺。一般认为，要实现基因工程蛋白质分离纯化的高效率、高纯度和低成本必须做到以下几点：① Prokopakis 等提出了优化分离纯化步骤的基本规则，用以指导分离纯化操作的改进。具体规则如下：

① 选择分离操作必须基于产品的物理化学性质和生化性质； ② 高产量的杂蛋白必须要除去；

③ 最高效率地利用目标产物与杂质间地理化性质差异； ④ 尽可能地将高效的步骤放在前面； ⑤ 把操作最困难的步骤放在最后[1, 2]。

1.3 现有白细胞介素－13的分离纯化方法

1993年，Mckenzie 首次提出白细胞介素－13（IL －13）的名字，此后，人们逐渐发现了IL －13的许多生物学活性：刺激前髓样细胞（TF －1）的增殖，直接诱导原始造血前体细胞（Lin －Sca －1＋

）的增殖及分化；……

第二章实验材料与方法

2.1 概述

本论文主要从IL －13地分离纯化入手，将传统的细胞破碎和双水相萃取（选择PEG 盐系统）用于IL －13的提纯。

2.2.实验材料与方法

……

1

．菌种培养 ①母液的配置 …… ② 操作方法

按事先计算，取一定量的PEG 母液、盐母液核细胞碎片固体（超声波破碎，4000r/min 离心收集），用NaOH 或盐酸调节pH 值，加水至要求的浓度；

…… ③ 计算

GST －IL －13的萃取率：

b

b b t t t t t t g v w

c v w c v w c ⨯⨯+⨯⨯⨯⨯=φ（2－1）

……

第三章实验结果与讨论

3.1 GST-IL-13的培养

3.2 GST-IL-13总含量的测定

3.3化学破碎

3.3.1 pH的影响

pH对蛋白质释放的影响见图3.8。pH的作用主要是影响蛋白质的电离平衡，从而影响到其融解性。JM109菌的细胞壁蛋白在微碱性师的融解性较高，同时这又很接近细胞本身的生长环境，故蛋白质不会发生结构上的改变。从图中也可以知道，pH以8.0左右为宜。

本文分别考察了PEG600，PEG1540，PEG4000，PEG6000与不同的盐（硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、磷酸钠）构成的双水相体系，系统分析了蛋白质、GST －IL－13和细胞碎片的分布规律。