0512高效液相色谱法
高效液相色谱测定法标准操作规程
标准操作规程STANDARD OPERATION PROCEDURE1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。
2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。
3责任：QC人员对本SOP实施负责。
4容高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
4.1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。
超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
4.1.1.色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2〜8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。
0512高效液相色谱法公示稿
0512高效液相色谱法公示稿一、前言高效液相色谱法（HPLC）是一种高效、精密的分离、检测和定量分析方法，广泛应用于医药、化工、环保、食品等领域。
为了加强对HPLC 法的监管，保障公众健康和安全，特公示我国关于HPLC法的相关规定。
二、高效液相色谱法的定义1. 高效液相色谱法是一种基于溶液中的组分在液相（柱填料）和固相（涂层）之间分配系数差异进行分离和分析的方法。
2. 高效液相色谱法通过注射液体样品进入含有液相的柱内，利用溶剂在固相和液相之间进行吸附、分配、渗透和离子交换等作用，分离样品中的化合物。
3. 高效液相色谱法能够分离样品中微量或追踪成分，提高检测的灵敏度和准确性。
三、高效液相色谱法的应用领域1. 药品分析：用于药物成分检测、纯度分析和质量控制。
2. 食品安全：用于检测食品中的添加剂、农药残留、重金属等有害物质。
3. 环境保护：用于水质、大气、土壤等环境样品中污染物的分析和监测。
4. 化工生产：用于反应物、中间体、产物的分离和纯度检测。
四、高效液相色谱法的标准化1. HPLC法的样品处理和制备应符合国家相关法律法规和标准，确保样品的准确性和可靠性。
2. 检测仪器和设备应定期维护和校准，确保分析结果的准确性和稳定性。
3. 检测人员应具备专业的实验技能和丰富的经验，严格按照标准操作程序进行分析。
4. 检测实验室应具备良好的实验条件和环境，确保分析过程的可控性和干净度。
五、高效液相色谱法的质量保障1. 检测样品的来源应合法合规，确保检测结果的可靠性和真实性。
2. 检测实验室应建立健全的质量管理体系，确保检测过程的可追溯性和规范性。
3. 检测报告应客观、准确地反映样品的分析结果，不得篡改或误导消费者。
4. 对于检测中发现的问题或异常情况，应及时报告并采取有效措施进行处理和纠正。
六、结语高效液相色谱法作为一种先进的分析技术，在现代科学研究和工业生产中发挥着重要作用。
为了保障HPLC法的准确性和可靠性，我们将严格监管HPLC法的相关实施，确保公众利益和健康安全。
通则0512高效液相色谱法
高效液相色谱法：系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高液相色谱仪：是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
2020版0512高效液相色谱法征求意见稿USPEP内容比对
在欧洲药典EP9.0、美国药典USP40-NF35的色谱法通则及2020版《中国药典》通则0512征求意见中可以找到这个问题的答案。
这些通则中列出了液相色谱和气相色谱中的一些性能参数，只要符合系统适用性的要求，这些参数即使改变也无需重新验证，各国药典
的内径dc2：调整后方法中色谱柱的内径dp1：原方法中色谱柱的粒径dp2：调整后方法中色谱柱的粒径；Vinj1：原方法中进样体积；Vinj2：调整后方法中进样体积；L1：原方法中色谱柱柱长L2：调整后方法中色谱柱柱长tG1：原方法的梯度段洗脱时
间tG2：调整后的梯度段洗脱时间，可通过相关软件计算表 1 中流速、进样体积和梯度洗脱程序的调整范围，并根据色谱峰分离情况进行微调。
若调整超出上表中规定的范围，调整的方法应进行相应的方法学验证。
色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数。
按各品种正文项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。
结论：各国药典对系统适用性的要求不尽相同，但涉及的计算公式基本一致，研究中应根据具体品种的特性，制定适合自己的系统适用性要求，确保检测数据的准确，可重现。
2005版中国药典附录-高效液相色谱法 (2)
2005版中国药典附录-高效液相色谱法高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。
注入进样阀的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。
采用微柱液相色谱系统可以减少溶剂的消耗并达到快速分离之目的。
高效液相色谱法的主要分离机制有吸附、分配、离子交换和排阻作用。
1．对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪。
仪器应定期检定并符合有关规定。
（1）色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等）也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或高分子微球等填充剂用于分子排阻色谱等；手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。
填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等因素）以及色谱柱的填充，将直接影响待测物的保留行为和分离效果。
孔径在150?以下的填料适合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在300?以上的填料。
以硅胶为载体的键合固定相填充剂适用pH2～8的流动相。
当pH大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。
当色谱系统中需使用pH大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等。
（2）检测器最常用的检测器为紫外吸收检测器，其他常见的检测器有二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
维生素B6片分析方法验证
一．概述1.维生素B6片有关物质测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。
1.1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.04%戊烷磺酸钠溶液（用冰醋酸调节pH值至3.0）-甲醇（85∶15）为流动相；检测波长为291nm。
理论板数按维生素B6峰计算不低于4000。
1.2测定法取本品细粉适量，加流动相适量，振摇使维生素B6溶解，用流动相制成每1ml中约含维生素B61mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液，精密量取1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
取对照溶液10μl注入液相色谱仪，精密量取供试品溶液与对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
1.3供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积（1.0%）。
2. 维生素B6片含量测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。
3.1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.04%戊烷磺酸钠溶液（用冰醋酸调节pH值至3.0）-甲醇（85∶15）为流动相；检测波长为291nm。
理论板数按维生素B6峰计算不低于4000。
3.2测定法取本品30片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于维生素B6 0.1g）,置100ml量瓶中，加流动相适量，超声使维生素B6溶解，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取维生素B6对照品，同法测定。
按外标法以峰面积计算，即得。
3.3本品含维生素B6计算，应为标示量的93.0% ～107.0%。
4.工艺处方组成5、仪器基本情况：6.相关术语：6.1准确度:系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。
一般用回收率（%）表示。
回收率限度应在98%～102%之间。
6.2精密度:系指在规定的条件下同一份均匀的供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。
维生素B2片分析方法验证方案
一．概述1.维生素B2片含量测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。
1.1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85∶10∶5)为流动相；检测波长为444nm。
理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。
1.2测定法避光操作。
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于维生素B2 10mg)，置500ml量瓶中，加盐酸溶液(1→2)10ml，振摇使维生素B2 溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图；另取维生素B2对照品约10mg，同法测定。
按外标法以峰面积计算，即得。
1.3本品含维生素B2计算，应为标示量的90.0% ～110.0%。
2. 维生素B2片溶出度测定：照溶出度与释放度测定法（通则0931第二法）测定法避光操作。
取本品，以冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质，转速为每分钟100转，依法操作，经20分钟时，取溶液10ml，滤过，取续滤液，照紫外-可分光光度法（通则0401)，在444nm的波长处测定吸光度，按C17H20N4O6的吸收系数()为323计算每片的溶出量。
限度为标示量的75%，应符合规定。
3. 维生素B2片有关物质测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。
色谱条件照含量测定。
避光操作。
取本品的细粉适量（约相当于维生素B2 10mg)，置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（1→2)5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取1ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
精密量取供试品溶液与对照溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.75倍(1.5% ) ，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍（3.0% )。
2015版药典黄曲霉毒素测定法
2351 黄曲霉毒素测定法第一法1 本法系用高效液相色谱法(通则 0512)测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉 毒素 B1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素 G1 和黄曲霉毒素 G2 总量计)，除另有规定外，按下 列方法测定。
当测定结果不符合规定时，以第二法测定结果为准。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇 - 乙腈 - 水(40∶18∶42)为流动相；采用柱后衍生法检测， （1）碘衍生法：衍生溶液为 0.05％的碘溶液 (取碘 0.5g， 加入甲醇 100ml 使溶解， 用水稀释至 1000ml 制成)， 衍生化泵流速每分钟 0.3ml， 衍生化温度 70℃； （2）光化学衍生法：光化学衍生器（254nm） ；以荧光检测器检测，激发 波长 λex=360nm(或 365nm)，发射波长 λem=450nm。
两个相邻色谱峰的分离度应大于 1.5。
混合对照品溶液的制备 精密量取黄曲霉毒素混合标准品(黄曲霉毒素 B1、 黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素 G2 标示浓度分别为 1.0μg／ml、0.3μg／ml、1.0μg／ml、 0.3μg／m1)0.5ml，置 10ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。
精密量取储备液 1ml， 置 25ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备 取供试品粉末约 15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠 3g，置于均质瓶中，精密加入 70％甲醇溶液 75ml，高速搅拌 2 分钟(搅拌速度大于 11000 转／分钟)， 离心 5 分钟(离心速度 2500 转／分钟)，精密量取上清液 15ml，置 50ml 量瓶中，用水稀释至 刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，量取续滤液 20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟 3ml，用水 20ml 洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱， 收集洗脱液，置 2ml 量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
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（1）色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的 载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅 胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基硅烷键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常 见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合 硅胶也可用作反相色谱。 离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱 柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键 合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色 谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室 温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但不宜超过 60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相 pH 值一般应在 2～8 之间。烷基 硅烷带有立体侧链保护、或残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物 色谱柱可耐受更广泛 pH 值的流动相，适合于 pH 值小于 2 或大于 8 的流动相。
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2020 年版第一次征求意见稿
（2）检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检 测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、电喷雾检测器、示 差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应 值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器、电喷雾检测 器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸 发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。
正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己 烷等。
流动相注入液相色谱仪的方式（又称洗脱方式）可分为两种：一种是等度洗 脱，另一种是梯度洗脱；用梯度洗脱分离时，通常以表格的形式在品种项下规定， 其中包括运行时间和流动相在不同时间的成分比例。
品种正文项下规定的条件，除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改 变外，其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、 柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变调整。，以达到系统适用性试验 的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例 X 小于等于 33%时，
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0512 高效液相色谱法
高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱 柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱内， 各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理 色谱信号。
1. 对仪器的一般要求和色谱条件
紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响 应值与被测物质的量在一定范围内呈线性关系;，但蒸发光散射检测器的响应值 与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。; 电喷雾检测器的响应值 与被测物质的量通常也呈指数关系，一般需经对数转换或用二次函数计算，但在 小质量范围内可基本呈线性。
不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应 符合紫外-可见分光光度法（通则 0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时， 还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器、 电喷雾检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐成分的流动相。
（3）流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫 外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用 时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中 有机溶剂一般应不低于 5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。
进样体积
Vinj2=Vinj1×(L2×dc22)/(L1×dc12)，并根据灵敏度的需求进行
调整。 即便没有对色谱柱尺寸进行调整，进样体积也可调整以满 足系统适用性的要求
梯度洗脱程序 （等度洗脱不适
用）
tG2=tG1×(F1/F2)×[(L2×dc22)/(L1×dc12)]，保持不同规格色谱 柱的洗脱体积倍数相同，从而保证梯度变化相同，并需要 考虑不同仪器系统体积的差异
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允许改变范围为 0.7X～1.3X；当 X 大于 33%时，允许改变范围为 X-10%～X+10%。 若需使用小粒径（约 2μm）填充剂以提高分离度或缩短分析时间，输液泵的
性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配，如有必要时，色 谱条件（参数）可适当调整。
参数变量
参数调整
固定相
填料粒径(dp)， 柱长(L)
不得改变固定相的理化性质，如填料材质，表面修饰及 键合相均需保持一致；从全多孔填料到表面多孔填料的 改变，在满足上述条件的前提下是被允许的 改变色谱柱粒径和柱长后，L/dp 值(或 N 值)应在原有数值 的-25%～+50%范围内
Hale Waihona Puke 流速F2=F1×[(dc22×dp1)/(dc12×dp2)]，在此基础上可以根据实际 使用时系统压力和保留时间，允许流速在±50%的范围内 进行调整
调整后，系统适用性应符合要求，且色谱峰出峰顺序不变。若减小进样体积， 应保证检测限和峰面积的重复性；若增加进样体积，应使分离度和线性关系仍满 足要求。
对于梯度洗脱，调整其色谱参数应比调整等度洗脱色谱参数时更加谨慎，因 为此调整可能会使某些峰位置变化，造成峰识别错误，或者与其他峰合并。
色谱参数允许调整范围见表 1。 表 1 色谱柱、填料粒径和相应参数允许调整的范围