荧光细胞化学样品制备和检测技术详解演示文稿
免疫荧光技术PPT课件
细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
2 标本的固定： ⑴ 固定目的
防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
直接法原理示意图
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
抗体
补体
标记 抗补 体抗 体
荧光
光 源
补体结合法原理示意图
㈢荧光显微镜检查： （由实验课介绍）
三、其它免疫荧光技术 1 流式细胞仪 2 时间分辨免疫荧光技术 3 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴 定。
搅拌法
第一步：
第二步：
第三步：
液 第四步：
拌
将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。
加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml
25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶
25℃下搅拌1h，4℃下继续搅
2 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在 用50mg/ml比例重复一次。
SUCCESS
THANK YOU
2019/7/31
3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：
荧光定量PCR检测技术 ppt课件
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号达到设定的域
值时所经历的循环数。
荧光定量PCR检测技术
什么是C(t)值
C(t)
Threshold（域值）
荧光定量PCR检测技术
为什么要引入C(t)值
96 replicates of B7 gene molecular beacon
Ct
荧光定量PCR检测技术
荧光定量PCR检测技术
（FQ-PCR, Fluorescence quantitative PCR）
荧光定量PCR检测技术
实时荧光定量PCR技术
所谓real-time FQ-PCR技术，是指 在PCR反应体系中加入荧光基因，利 用荧光信号累积实时监测整个PCR进 程，最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。
dsDNA = Binds minor groove (intense fluorophore)
荧光定量PCR检测技术
人医现所开展的检测项目
乙肝病毒（HBV）荧光定量PCR检测 丙肝病毒（HCV）荧光定量PCR检测 淋球菌（NG）荧光定量PCR检测 沙眼衣原体（CT）荧光定量PCR检测 解脲支原体（UU）荧光定量PCR检测 结核分支杆菌（TB）荧光定量PCR检测
荧光定量PCR检测技术
（三）选择引物
7、探针与两条引物之间的各种组合形成 的二聚体都较少，特别是引物3’端与探针 配对很少；
光学显微镜观察方法及荧光样品制备
显微镜成像原理：
把小细节看清楚的３个先决条件： 1. 放大：把小物像放大 2. 分辨率：能分辨两点之间的最小距离 3. 反差：辨认已经被放大和具有一定分辨率的细节
只有具备了上述３个条件，才尽可能真实地把物体信息转化为物体图像
Human eye Magnifier Stereomicroscope Compound microscope Electron microscope
准备样品
观察流程
免疫化学染色➢ 组织切片
➢ 免疫细胞化学 ➢ 免疫组织化学
➢ 判断结果好坏 ➢ 做好标记
得到好的图像
免疫化学染色
染料选择—— 根据所配激光器选择最接近的荧光染料
➢ 荧光探针与激光器的激发射波长相匹配 (405, 458, 488, 514, 561, 633) ➢ 当需要对样品进行多重荧光标记时，这些荧光探针的激发波长或发
2. 细胞固定：4％多聚甲醛磷酸缓冲液、丙酮、甲醇和95％乙醇，根 据需要选择不同固定液
➢ 丙酮：组织穿透性和脱水性强，抗原保存好，多用于细胞 爬片
➢ 95％乙醇：脱水性强，易引起组织收缩、变硬
组织切片
冰冻切片
➢ 活细胞 ➢ 细胞爬片
➢ 组织切片
石蜡切片
比较及选择
冰冻切片
石蜡切片
好处
优势 保存组织的抗原免疫活性 保持组织细胞的形态结构
明亮，光谱范围大，相对光 稳定，大的行程移动，尺寸 小，可以做成对环境敏感
特异性标记细胞内蛋白质比 较困难；抗体介导的标记； 细胞通常要被固定
通过融合目标蛋白可以在活 细胞内表达；可以作为结构 破坏的靶；对一些环境参数 敏感
波长选择有限，低光稳定性， 不是很亮，光谱交叉，相对 庞大（5um）
荧光细胞化学测定
荧光寿命测定
总结词
荧光寿命测定是通过测量荧光物质在不同激发条件下的荧光衰减曲线，从而确定荧光物 质的荧光寿命的技术。
详细描述
荧光寿命测定是荧光分析中常用的技术之一，其基本原理是，在激发条件下，荧光物质 会经历从激发态到基态的辐射跃迁过程，这个过程有一定的寿命。通过测量不同激发条 件下的荧光衰减曲线，可以获得荧光物质的荧光寿命，从而了解荧光物质的光物理过程
04 荧光细胞化学测定的数据 分析
荧光光谱分析
总结词
荧光光谱分析是通过测量荧光物质在不同波长激发光下的发射光谱，从而确定荧光物质的成分和浓度的技术。
详细描述
荧光光谱分析的基本原理是，不同的荧光物质具有不同的激发光谱和发射光谱，通过对荧光光谱的测量和分析， 可以确定荧光物质的成分和浓度。在荧光光谱分析中，常用的光谱测量技术包括光谱仪测量和光度计测量。
和性质。
荧光量子产率与浓度关系
总结词
荧光量子产率与浓度关系是通过测量荧 光物质在不同浓度下的荧光发射强度和 量子产率，从而确定荧光物质浓度与量 子产率之间的关系的技术。
VS
详细描述
荧光量子产率与浓度关系是荧光分析中重 要的技术之一，其基本原理是，在一定条 件下，荧光物质的量子产率与其浓度有一 定的关系。通过测量不同浓度下的荧光发 射强度和量子产率，可以获得荧光物质浓 度与量子产率之间的关系，从而用于荧光 物质的定量分析和检测。
无损检测
荧光检测通常采用非侵入性方 法，对样本无损伤，可重复利 用，适用于活体检测和临床应
用。
荧光细胞化学测定的局限性
荧光淬灭
荧光物质在某些条件下会发生淬灭现象， 导致信号减弱或消失，影响检测的准确
性。
灵敏度与特异性平衡
生物荧光样品制备与观察
生物荧光样品制备与观察一、原理（一）什么是荧光，简单地讲，当用一定波长的光（如紫外光）照射某种物质时，经过照射的物质在极短时间内即可发射出一种可见的光，这种光即为荧光。
在生物中，由于产生荧光的方式不同，可以概括地归纳为以下几种：1．自发荧光：在生物的某些组织中，经紫外线照射后能直接发射出荧光的称为自发荧光（或直接荧光）。
如植物组织中的叶绿素，经紫外线照射后，即可发出红色荧光。
2．次生荧光：有些生物组织经紫外线照射后，并不能发出荧光，但是当它吸收荧光染料后也可以产生荧光，这种称为次生荧光（或间接荧光）。
如吖啶橙，DAPI均可检测细胞内的核酸。
3．免疫荧光：这种染色法是利用抗原与抗体反应的原理，将荧光染料与抗体结合，然后，将这种标记荧光染料的抗体再与相应抗原结合，即形成抗原、抗体复合物。
经一定波长的光激发后，即可发射出荧光，以此辨认抗原在组织细胞内的分布状况。
这种方法被称为免疫荧光（或荧光抗体法）。
组织和细胞中所产生的荧光，须借助荧光显微镜方可进行观察，本实验是用普通显微镜配以一种轻便的荧光光源观察荧光现象。
（二）轻便落射光装置落射光装置的组成：此装置是为普通显微镜配套设计的。
它是由两部分组成，一为光源；另一为落射光系统，如图，落射光系统由激发滤片组成。
当光线通过激发滤片到达二向分光镜时，使激发光反射，经物镜后，激发标本，标本辐射荧光，又通过物镜，分光镜而到达目镜，以供观察者观察及记录。
二、目的与要求初步了解生物荧光及荧光染色法，学习几种生物荧光标本的制作与观察。
三、实验内容（一）生物自发荧光的观察（二）生物的荧光染色法（三）荧光抗体法四、实验步骤（一）生物自发荧光的观察1.制片（1）取一干净载玻片（2）用吸管吸取眼虫培养物，滴于载玻片的中央位置。
（3）用镊子取一张盖玻片，沿液体的边缘轻轻的盖上盖玻片。
（4）用吸水纸将盖玻片周边的多余水吸掉。
2.观察（1）将载玻片置于显微镜载物台上。
（2）调节好光源。
免疫荧光 样品制备及体会
免疫荧光细胞样品制备及体会●免疫荧光细胞化学技术：将抗体标记上荧光素（如FITC、TRITC），与细胞内相应抗原（目标蛋白）结合后，通过观察、检测具有特征性的荧光，可以定性、定位及定量的显示和检测细胞内目的蛋白的方法称为免疫荧光细胞化学技术。
●结合了免疫反应的特异性和荧光检测的灵敏性。
●常用方法：直接法、间接法和双标记法。
●使用免疫荧光染色，我们可以方便的观察目的蛋白在细胞中何时表达，对目的蛋白进行定性（有无表达）、定位（胞浆、胞核或胞膜）分析，以及比较其表达量的多少。
●不同的抗体通过标记不同的荧光染料，我们可以同时观察细胞中两种或多种蛋白的表达和分布。
蛋白质的不同定位提示其可能具有的功能：●胞浆：参与细胞内信号转导，蛋白质转运●胞核：可能是转录因子参与DNA转录，基因表达调节因子●胞膜：离子泵，参与构成离子通道、细胞间通讯，细胞内外物质交换，作为细胞因子受体荧光染料●具有吸收一定频率光能，并产生一定光量子的荧光团，在一定波长的激发光作用下可发射不同颜色的荧光。
●尽量了解所使用的荧光染料的特性：如激发光谱和发射光谱。
比较常用的荧光染料：FITC蓝光绿光TRITC绿光红光Cy3、Cy5绿光红光PI绿光红光DAPI紫外蓝光Hoechst紫外蓝光直接法●直接用荧光标记的抗体与细胞中的相应抗原结合。
本法简便快速，非特异性荧光干扰少；缺点是一种标记抗体只能测定一种抗原，需要的抗体量较大，昂贵且敏感性较低。
●未标记抗体（一抗）先与细胞中的相应抗原结合，再用荧光素标记的抗体（二抗）与一抗结合。
本法仅需标记一种抗体（二抗如羊）就可以检测很多由同一种动物（如兔）制备的不同蛋白的抗体；缺点是染色时间较长，出现非特异性染色的机会较多。
但较直接法更敏感，有信号放大作用。
间接法●双标记法：在同一个细胞标本上同时检测两种抗原，进行双重免疫荧光染色。
将两种荧光抗体（如抗A和抗B）以适当比例混合，加在标本上孵育。
抗A抗体用FITC标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TRITC标记，发红色荧光，这样就可以明确显示两种抗原在细胞中的定位。
细胞生物学荧光染色实验 ppt课件
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四、实验方法
(一)利用荧光增白剂观察植物细胞壁 植物细胞壁有强烈的吸附染料的能力，因此很 多荧光染料都能着染细胞壁，但近年来最常用的还 是荧光增白剂，以此来鉴别细胞壁的状况，并常用 于检查原生质体细胞壁是否分解完全，以及原生质 体再生细胞壁的鉴别。
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1．取洋葱表皮细胞(1cm2)置于载玻片，以 荧光增白剂染色5分钟，加盖玻片，荧光显微 镜下观察其细胞壁。 2．取以酶液游离出来的原生质体悬液l滴于 载玻片上，加荧光增白剂一滴，染色 5分钟，加
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（四) 线粒体观察 取洋葱内表皮细胞 (1cm2)置于载玻片，以 0.0l％罗丹明染色5分钟生理盐水冲洗一次，加盖 玻片，荧光显微镜下绿光激发观察。
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五、作业
分别描述DNA，蛋白质及线粒体在细胞内的 分布与颜色。
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实验六 细胞活力的测定
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一、实验目的
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三、实验用品
(一) 材料：新鲜紫鸭趾草花粉或蚕豆原生质体悬液，人口腔上皮细 胞。 (二) 用品：荧光显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，烧杯，牙签等。 (三) 试剂： 1．二丙酸酯荧光素溶液：取l0mg二丙酸荧光素于5ml丙酮中，将 此溶液逐滴加入 5ml PH5-6生理盐水或0.65M的甘露醇溶液中，直到 出现永久性乳白沉淀为止。 2．0.01％吖啶橙的生理盐水溶液。
学习荧光显微镜的使用，了解荧光 显微技术原理和方法，以及荧光技术在 细胞化学方面的应用。
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二、实验原理
荧光显微技术是利用短波光照射被射物质，以激发其发射荧光而 在荧光显微镜下可以检视的方法。 荧光又可分为：自发荧光和次生荧光。自发荧光是指有些生物体 受到短波光照射后，直接发出的荧光。如经紫外光照射后，叶绿体 发出的红色荧光；木质素发出的黄色荧光等。次生荧光是指有பைடு நூலகம்生 物材料受到短波光照射后并不发光，但当它吸附荧光染料后，也同 样产生荧光，这种荧光也称间接荧光。
生物荧光样品制备与观察
生物荧光样品制备与观察一、原理（一）什么是荧光，简单地讲，当用一定波长的光（如紫外光）照射某种物质时，经过照射的物质在极短时间内即可发射出一种可见的光，这种光即为荧光。
在生物中，由于产生荧光的方式不同，可以概括地归纳为以下几种：1．自发荧光：在生物的某些组织中，经紫外线照射后能直接发射出荧光的称为自发荧光（或直接荧光）。
如植物组织中的叶绿素，经紫外线照射后，即可发出红色荧光。
2．次生荧光：有些生物组织经紫外线照射后，并不能发出荧光，但是当它吸收荧光染料后也可以产生荧光，这种称为次生荧光（或间接荧光）。
如吖啶橙，DAPI均可检测细胞内的核酸。
3．免疫荧光：这种染色法是利用抗原与抗体反应的原理，将荧光染料与抗体结合，然后，将这种标记荧光染料的抗体再与相应抗原结合，即形成抗原、抗体复合物。
经一定波长的光激发后，即可发射出荧光，以此辨认抗原在组织细胞内的分布状况。
这种方法被称为免疫荧光（或荧光抗体法）。
组织和细胞中所产生的荧光，须借助荧光显微镜方可进行观察，本实验是用普通显微镜配以一种轻便的荧光光源观察荧光现象。
（二）轻便落射光装置落射光装置的组成：此装置是为普通显微镜配套设计的。
它是由两部分组成，一为光源；另一为落射光系统，如图，落射光系统由激发滤片组成。
当光线通过激发滤片到达二向分光镜时，使激发光反射，经物镜后，激发标本，标本辐射荧光，又通过物镜，分光镜而到达目镜，以供观察者观察及记录。
二、目的与要求初步了解生物荧光及荧光染色法，学习几种生物荧光标本的制作与观察。
三、实验内容（一）生物自发荧光的观察（二）生物的荧光染色法（三）荧光抗体法四、实验步骤（一）生物自发荧光的观察1.制片（1）取一干净载玻片（2）用吸管吸取眼虫培养物，滴于载玻片的中央位置。
（3）用镊子取一张盖玻片，沿液体的边缘轻轻的盖上盖玻片。
（4）用吸水纸将盖玻片周边的多余水吸掉。
2.观察（1）将载玻片置于显微镜载物台上。
（2）调节好光源。
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使上皮细胞产生非特异性荧光； （4）固定剂的选择、固定时间、温度和PH值都会影响实验结果。
单纯固定液
（1）4%中性甲醛固定液：最常用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作。中性 甲醛是以PH7.2-7.4的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优 于一般的4%甲醛固定液。此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个 月。
细胞标本的取材 （1）贴壁生长的培养细胞 （2）悬浮的培养细胞：
沉淀涂片，细胞离心涂片器（cytospin）， 载玻片上涂粘附剂—多聚赖氨酸（0.01~0.5%），
甲醛-明胶，铬矾明胶， Vectabond试剂 （3）体液沉淀涂片法 （4）穿刺吸取涂片法 （5）印片法
组织脱水
试剂 中性缓冲甲醛
乙醇 乙醇 乙醇 无水乙醇Ｉ 无水乙醇ＩＩ 二甲苯－无水乙醇 二甲苯Ｉ 二甲苯ＩＩ 石蜡 石蜡 石蜡
荧光的性质
吸收光，必需有激发光源 荧光波长＞激发波长（损失热能） 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率
荧光显微镜的优点和用途
优点：
检出能力高（放大作用） 对细胞的刺激小（可以活体染色） 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察——荧光素 荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
无水醋酸钠
1.25g
升汞
6.0g
蒸馏水
90ml
使用前加入甲醛 10ml
混合固定液
（3）Bouin固定液：特别适用于睾丸活检组织的固定。Bouin液对组织固定较均匀，收缩很 少，不会使组织变硬变脆。需现配现用。
饱和苦味酸水溶液（约1.22%）
75ml
甲醛
25ml
冰醋酸
5ml
（4）Carnoy固定液：穿透能力强，可很好的固定细胞质和细胞核，特别适用于固定外膜致密 的组织，也适用于糖原及尼氏小体的固定。
包埋步骤 先将熔化的石蜡注入包埋托内，而后用镊子将经过浸蜡的组织块从脱水盒中取出，放入包埋 托中央，放在小冷台商，用镊子轻按组织块，以达到组织块平整，盖上脱水盒底，再加好 石蜡，移至冷冻台上，待冷冻好后，卸下组织蜡块待切。包埋时应根据组织的不同，选择 大小型号合适的包埋托；有要求直立包埋的组织要用镊子将组织固定在蜡块中央稍停片刻， 以使组织组织在蜡凝时立住，达到立埋的要求。
切片
石蜡切片 其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能连续切片（薄片），
组织结构清晰，抗原定位准确。 用于免疫组织化学技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同，主要是要在比较低的温度下进行。 ①脱水、透明等过程应在4℃下进行，以尽量减少组织抗原的损失； ②组织块大小应限于2cm x 1.5cm x 0.2cm，使组织充分脱水、透明、浸腊； ③浸腊、包埋过程中，石蜡应该保持在60℃以下，以熔点低的软腊最好（低温石蜡包埋）； ④石蜡切片应放在37℃恒温箱过夜，这样烤片可减少染色中脱片现象。切片如需长期贮存，
无水乙醇 60ml
氯仿
30ml
冰醋酸
10ml
混合固定液
（5） Zenker固定液：经此液固定的标本，细胞核和细胞质染色颇为清晰，但成本较高且需 特殊处理汞。该固定液要避免接触阳光，以免引起化学变化而失效。
升汞
5.0g
重铬酸钾
2.5g
硫酸钠
1.0g
蒸馏水（加至）
100ml
取材
组织取材：按病理诊断和研究的目的和要求，从标本上切取适当大小和数目的组织块，供后续 制片和显微镜下观察用于诊断以及相关研究。
甲醛（40%） 无水磷酸氢二钠 磷酸二氢钠 蒸馏水
100ml 6.5g 4.0g 900ml
单纯固定剂
（2）乙醇固定液：使用时以80%-95%的浓度为宜，具有硬化、固定、脱水等作用，对组织渗 透力较弱，因此很少单独使用，但其保存组织中的核酸强于中性甲醛，故常用于有核酸操 作的实验或检查，如果用于证明尿酸结晶和保存糖原，可用于100%乙醇固定组织。
（3）4%多聚甲醛固定液：主要用于培养细胞的固定。
混合固定液
（1）乙醇-甲醛（乙醇-福尔马林，AF）固定液：适用于皮下组织中肥大细胞的固定。该固定 液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入95%乙醇脱水。
甲醛（40%） 100ml
95%乙醇
900ml
（2）B5（醋酸钠-升汞-甲醛）固定液：多用于固定淋巴组织。染色前应进行脱汞沉淀处理。
标本制作的顺序
组织固定、取材、组织脱水、包埋、切片、染色、封片 培养的悬浮细胞、粘附细胞
组织固定
活体组织一旦停止血液循环和物质代谢就会因物质代谢障碍产生一系列的生物化学和组织学改 变，并导致形态学上可见的细胞器变化和细胞组织的形态改变直至腐败自溶。
选择最佳固定液标准是： （1）最好地保持细胞和组织的形态结构； （2）最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化和细胞化学技术中
荧光细胞化学样品制备和检测技术详解演示文稿
优选荧光细胞化学样品制备和检测技术
落射荧光与透射光观察的区别
落射荧光与透射光观察的区别
什么是荧光 ?
• 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度 辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
• 显微镜荧光利用光源激发——光化荧光
浓度／温度 ４％
８０％ ９０％ ９５％
体积比为１：１
６０℃ ６０ ℃ ６０ ℃
时间设定 ３．００ｈ １．００ｈ １．００ｈ
过夜 ２．００ｈ ２．００ｈ ３０ｍｉｎ ３０ｍｉｎ １．００ｈ １．００ｈ １．００ｈ １．００ｈ
Байду номын сангаас
包埋
组织块经过固定、脱水、透明、浸蜡等处理后，用包埋剂（如石蜡、树脂、塑料等）将其包制 成含组织块的蜡块或塑料块等的过程称为包埋。
切片
冰冻切片 为免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够比较完好地保存多种抗
原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应该采用冰冻切片。新鲜的组织及已经固定的组织 均可作冰冻切片。 冰冻切片后如果不染色，必须吹干，贮存于低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存于冰箱中保 存。 要注意刀片等接触阳性物质的污染问题。