姜黄素：一种后期转甲状腺素蛋白

姜黄素：一种后期转甲状腺素蛋白淀粉样变性的多目标疾病修饰试剂院:生命科学学院班级：生物工程卓越314041 姓名：陈健学号：201404896 序号：02摘要：转甲状腺素蛋白淀粉样变性包含各种各样的获得性或遗传性疾病，它们是由有毒的转甲状腺素蛋白聚集体和纤维细胞在全身细胞外聚集所引发的，尤其是在外周神经系统。

由于转甲状腺素蛋白淀粉样变性是典型的复杂进展性疾病，同时瞄准多个分子靶的治疗方法也许会提高治疗效率和治疗结果。

在本研究中，我们评估了生理上可接受剂量的姜黄素对由体外转甲状腺素蛋白低聚物诱导产生的细胞毒素的保护效应。

这种保护是通过降低半胱天冬酶-3的活性以及结合了免疫球蛋白的内质网固定伴侣的水平实现。

拿具有家族性淀粉样多发性神经病的老年小鼠作为模型，姜黄素不仅降低了在胃肠道和背根神经节的转甲状腺素蛋白聚集体沉积和毒性，而且重塑了组织中的刚果红淀粉样物质。

此外，姜黄色通过来自年老的家族性淀粉样多发性神经病的转基因小鼠的原代巨噬细胞，增强了转甲状腺素蛋白低聚物的内化、胞内运输和降解，表明暴露在甲状腺素毒性中间体的初始吞噬细胞的活化受到了损害。

总的来说，我们的研究结果清楚地支持了，姜黄素或者经过优化了的其衍生物，对后期转甲状腺素蛋白淀粉样变性疾病是一种有潜力的多目标疾病修饰剂。

引言：错误折叠的蛋白质作为不溶性淀粉样纤维的积累是许多神经变性疾病的重要病理特征，包括家族性淀粉样多发性神经病（FAP）、II型糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿氏病。

在这些疾病中，最后阶段在组织中积聚的物种主要由6–10 nm扭曲β褶纤组成，其中多肽链被按表排列在垂直于与氢键并行的纤维轴方向[1]。

虽然淀粉样纤维已被报道具有毒性[2]，越来越多的证据表明，非纤维状低聚物介质是神经变形的主要原因，且它可通过不同机制发挥毒性[3]。

甲状腺素运载蛋白（TTR）是一种丰富的血浆蛋白，主要由肝和脑脉络丛合成。

四聚体结构的TTR作为甲状腺激素的载体蛋白和血浆及脑脊液的视黄醇结合蛋白[4]。

细胞外的TTR 聚集和沉积引起了炎症和氧化损伤[5]、钙稳态破坏[6]、细胞外基质重塑[7]、热休克反应和内质网(ER)应激途径的激活[6,8]，包括普通分子参与者和情境，影响中枢神经系统的当地淀粉样变例如阿尔茨海默氏症和帕金森氏病，在许多特征方面类似。

FAP是一种致命的神经变性失调症，以聚集体和TTR突变形式纤维在胞外的沉积为特征，尤其发生在外周神经周围神经系统的神经中枢里。

虽然最常见的TTR突变导致FAP在30号位的缬氨酸被甲硫氨酸取代(TTR V30M)，已有超多100种的淀粉样TTR变体的描述。

TTR基因的不同类型的突变与不同的发病年龄、疾病的外显率，临床表型、预后及临床结果有关[9]。

除了家族性TTR相关的淀粉样蛋白形式，老年全身性淀粉样变性(SSA)是非遗传性，是由典型的野生型TTR淀粉样蛋白在心脏沉积而导致的较晚发病的TTR淀粉样变性，可以导致心功能不全和最终死亡[10]。

通过对化合物库的筛选和流行病学资料的组合查阅，许多低分子量有机化合物被认为是对抗淀粉样变性的有效治疗和预防试剂。

最近的研究中出现的最引人注目的方面是一些小分子，特别是天然来源的多酚，在多步淀粉样蛋白级联中，不对单一靶作用；相反，他们似乎抑制/重定向淀粉样蛋白分子动力学的不同步骤，还可以调节发生了淀粉样沉积的细胞核组织生物学[11,12]。

这在这些多酚里，姜黄素，从姜黄中分离出的一种天然来源二芳基庚酸，被发现能够调节齐聚和几种淀粉样蛋白纤维的形成，包括TTR[12,13]、α-突触核蛋白[14]和淀粉样蛋白[15]。

姜黄素具有抗氧化和抗炎作用，被建议在各种慢性病症中发挥保护作用，例如癌症、动脉粥样硬化和神经变性疾病[16]。

此外，姜黄素能有效地螯合与淀粉样相关的金属离子，如Fe2+、Zn2+ 和Cu2+，它们可以减少体内淀粉样蛋白聚集或氧化性神经毒性[17]。

此外，姜黄素在中国和印度草药医学中作为治疗剂被广泛用，而且是美国食品和药品管理局所认定的“公认安全”。

在姜黄素被高度消耗的印度，进行的一些流行病学研究表明，这儿的阿尔茨海默病的发病率明显低于西方世界所报道的[18]。

这些现象同姜黄素在体外解体TTR淀粉样纤维[11]、激活促进淀粉样清除先天免疫系统[19]的发现一起，促使我们探讨加入姜黄素在FAP的晚期小鼠模型中的作用。

结果，姜黄素可以减少内质网应激以及在暴露于TTR聚集体的情况下，保护死亡细胞免进入凋亡信号通路。

我们将RN22细胞暴露在无或者存在一系列浓度的姜黄素中形成的TTR低聚物中，研究了姜黄素对由TTR 聚集体引起的内质网应激响应和细胞凋亡的影响。

正如由先前工作[6]所预期的那样，不具有可溶性的TTR低聚物引发了BiP在细胞内的数量明显增加，内质网应激反应的中枢调节因子[20]显示出细胞毒性(图1)。

作为强烈的对比，当相同数量的在姜黄素的存在下形成的低聚物被加入到RN22细胞时，我们并没有观测到此种效应，这表明这些物质比未经处理的低聚体介质毒性要少（图1）。

此外，将细胞单独暴露于姜黄素中(达到11 μM)并不干扰本测试中BiP在一系列使用浓度中的表达。

图1：姜黄素抑制了内质网伴侣BiP激活的TTR低聚物依耐性。

(A) 从Schwannoma细胞中提取出的抗BiP蛋白印迹，这些细胞暴露在可溶性的TTR Y78F (TTR) 中，或者是TTR Y78F低聚物(低聚物) ，或者是经姜黄素提前处理了24个小时的TTR Y78F 低聚物中（在细胞培养基中，蛋白质的最终浓度为2 μM，姜黄素为0.001–11 μM）。

同时，使用最高浓度姜黄素单独培养细胞（姜黄素11 μM）。

(B)条形图是数据的量化，以 ± SEM的平均值表示。

此外，通过在Schwann细胞株中，进行一个标准的半胱天冬酶-3检测，我们研究了TTR 聚集介质的毒性。

不同于可溶性的TTR，TTR低聚物诱导了RN22 细胞里半胱天冬酶-3极大的活性，预示了细胞的损伤以及进入细胞凋亡信号通路。

另一方面，将细胞暴露在经姜黄素处理过的低聚物中，导致了半胱天冬酶-3活性的降低有显著的剂量依赖性（图2）。

另外，当细胞单独用姜黄素(11 μM)培养时，并未观测到酶活性的显著改变（图2）。

图2：姜黄素减少了与细胞外TTR低聚物有关的半胱天冬酶-3活性测量了Schwannoma 细胞中半胱天冬酶-3的活性，这些细胞被暴露于可溶性TTR Y78F (TTR)中，或者是TTR Y78F 低聚物(低聚物)，又或者是经姜黄素预处理（与图1中的条件一致）了24小时的TTR Y78F 低聚物中(**p < 0.01; ***p < 0.001; N.S. = non-significant)。

对姜黄素在后期FAP老鼠模型中的评价鉴于以上所描述的具有前景的数据，以及相关的体内和体外研究的文献[12,13,21]，我们利用后期FAP 小鼠模型来代表在Hsf-1杂合子背景下的人体TTR V30M变体的淀粉样变（(hTTR V30M/Hsf）[8]，研究了姜黄素的膳食补充剂对TTR淀粉样蛋白形成的效果。

HSF-1的表达障碍导致了在数个组织内非纤维TTR沉积广泛和过早沉积，包括胃肠道及周围神经系统。

在小鼠第3到第6个月的时候，非纤维TTR 物开始累积，并逐渐演化成刚果红材料，尤其是在小鼠12个月大的时候。

因此，用于测试新的针对不同阶段的病理的治疗策略与小鼠模型是高度相关的。

在本研究中，我们旨在评估姜黄素对晚期疾病的效果，在其组织中，非纤维TTR与双折射刚果红材料并存。

方案设计、药物剂量和终点的选择是基于来自先前研究的信息[13]。

正如预期的那样，姜黄素在老年小鼠体内的耐受性很好，并且不会产生任何可观测的副作用。

在经姜黄素处理和年龄匹配的对照组间动物间，并无观测到体重或者死亡率的改变。

此外，在用苏木精和伊红染色的肝区域里进行的形态评估中，并未观测到组织学异常（数据未展示）。

姜黄素与血浆TTR的甲状腺素结合位点结合，提高了它对解离的耐受性。

为了进一步验证姜黄素在体内与TTR结合，从被喂养富含姜黄素饮食的小鼠和标准饮食的小鼠身上，抽取血液，然后用放射性标记的甲状腺素(T4) ([125I]-T4) 培养，且在天然条件下进行凝胶电泳。

通过荧光成像分析可将标记甲状腺素结合蛋白可视化，，如补充图1中所示。

结果表明，来自经过姜黄素处理的小鼠的样品显示出可观的较少TTR带密度，表明经过肠道吸收以及分布全身之后，姜黄素选择性地和T4竞争同TTR的键合（竞争率41.74%）（补充图1）。

IEF凝胶光密度分析表明，在相同条件下，同未经处理动物身上的血浆TTR相比，姜黄素的慢性补充显著提升了TTR的耐解离性。

姜黄素减少了TTR沉积和缓解了组织毒性血浆里TTR的水平通过放射免疫扩散来定量，在用富含姜黄素的饮食喂养的小鼠组和控制喂养的小鼠组（556.8 ± 5.1 μg TTR/ml and 556.2 ± 5.5 μg TTR/ml,分别）之间并无统计学差异，这表明添加姜黄素并不影响TTR在肝脏中的合成和在体内的周转。

通过利用SQ-IHC和蛋白印迹法检测不同靶器官，我们分析了补充姜黄素对TTR沉积和组织损伤的影响。

在治疗结束时，小鼠的平均寿命为15.5个月，正如预期的那样，控制组动物在DRG的间质结缔组织、神经元胞体周围展示出广泛的TTR沉积，并且与卫星神经胶质细胞有密切接触[8]。

作为强烈的对比，姜黄素亚慢性的添加抑制了TTR在与脊神经相关联的神经中枢里的沉积，如图3和图4所示。

在胃中也发现了相似的结果（图5和图6）。

图3：姜黄素减少了年老hTTR V30M/Hsf老鼠组的TTR的沉积和DRG里的相关毒性。

姜黄素处理的老鼠组（右图；n=12）和年龄匹配控制老鼠组(左图；n=14)的免疫组织化学分析的代表性图片，分析包括TTR、BiP、Fas死亡受体、活化半胱天冬酶-3、NF-κB、IL-1β和DRG里的TNF-α；增大40倍。

条形图：免疫化学组织图像的量化用占用面积的比例± SEM 表示(***p < 0.001)。

这些观察结果受GAPDH信号强度归一化之后的TTR水平的蛋白印迹分析的支持（图4）。

（A）姜黄素处理组(n = 6) 和控制老鼠组(n = 6)的DRG里代表性的抗BiP 和抗TTR蛋白印迹。

(B) 条形图阐明了归一化的BiP/GAPDH和TTR/GAPDH密度量化± SEM (***p < 0.001)。

在整个胃肠道里发现了相似的结果，尤其是在胃里（图5和图6）。

图5：姜黄素减少了年老hTTR V30M/Hsf老鼠组胃部的TTR聚集体沉积和相关毒性。