人类胚胎干细胞基础培训教材1130
新ES胚胎干细胞课件
这是伦理争议的焦点之一。
动物实验
胚胎干细胞研究通常需要进行动 物实验，这引发了关于动物权利
和福利的伦理问题。
如何解决伦理问题
制定严格的伦理准则
为确保胚胎干细胞研究的道德合理性，需要制定严格的伦理准则， 包括对胚胎来源、研究目的、动物实验等方面的限制和监管。
我们期待看到胚胎干细胞在更多疾病的治疗、药物筛选和研究等方面发 挥重要作用，为人类健康做出更大的贡献。
我们也期待看到胚胎干细胞在组织工程和器官移植方面的应用得到更广 泛和深入的研究和应用，为解决供体短缺和提高移植效果提供更加可靠 的途径。
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生产生物肥料和农药
胚胎干细胞可以用于生产生物肥料和农药，减少化学肥料和化学农 药的使用，提高农业生产效率。
其他领域的应用
环境保护
胚胎干细胞可以用于环境保护， 如修复生态环境、治理污染等。
能源领域
胚胎干细胞可以用于生产生物燃料 ，如生物柴油、生物氢等，减少对 化石燃料的依赖。
材料领域
胚胎干细胞可以用于生产生物材料 ，如生物塑料、生物纤维等，减少 对传统材料的依赖。
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高度增殖能力
胚胎干细胞具有非常强的 增殖能力，可以在培养基 中不断分裂繁殖。
多向分化潜力
胚胎干细胞可以分化成为 各种类型的细胞，包括生 殖细胞、神经细胞、心肌 细胞等。
自我更新能力
胚胎干细胞还可以在特定 条件下自我更新，保持其 多向分化的潜力。
胚胎干细胞的分化能力
神经分化
胚胎干细胞可以分化成为 神经元和神经胶质细胞， 为神经系统Байду номын сангаас病的治疗提 供种子细胞。
基础医学理论综合指导：胚胎干细胞
这可以利用体细胞克隆技术来做。把人的体细胞的细胞核转移到已去掉细胞核的人的卵子中，相当于制造出一个没有精子 参与的受精卵，让它分裂，就能得到胚胎干细胞。不过，人的卵子很不容易拿到，而且制造人的胚胎做实验，在国外一直存在 着社会阻力。如果能用牛或兔子等动物的卵细胞做为材料制造病人的胚胎干细胞，就不存在这些问题了。
成年动物的组织和器官，如上皮和造血系统，之所以具有修复和再生的能力，成体干细胞在其中起着关键作用。在特定条 件下，成体干细胞即可对称分裂为2个新的子代干细胞或2个功能细胞，也可不对称分裂为1个子代干细胞和1个功能细胞，从 而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。过去认为只有造血系统和上皮等组织含有成体干细胞，但最近的研究表明，成体 干细胞普遍存在于人体的各种器官，这为利用成体干细胞治疗疾病提供了可能。
3月份的时候，英国报纸报道称美国科学家已经创造出了含15%的人类细胞的“人兽羊”。最近，英国人类生育与胚胎研究 管理局（HFEA）原则上批准了两项研究计划，允许将人的遗传物质（DNA）放入牛的卵细胞中制造种间杂交胚胎。
这两则新闻之所以会引起这么大的风波，是因为一般公众并不了解实验的具体情况，以为科学家们已经或者将要做人兽杂 交的实验，创造半人半兽的怪物，想想是有点吓人，让人感到恶心。不过这是对这些研究的误解。一般人心目中的人兽杂交， 是指让人和兽的生殖细胞结合，产生出一个半人半兽的杂种，就跟驴、马交配生下骡子一样。这种杂交实验要获得成功，需要 两个物种的亲缘关系很近才行。让人和黑猩猩杂交都很可能不会成功，更不要说和牛、羊了。所以这种一般人心目中的人兽杂 交在目前的技术条件下是不可能成功的。而且，制造这种怪物没有用处，并没有科学家主张做这方面的探索。
第十三章 干细胞ppt课件
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造血干细胞
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HSC主要存在于红骨髓内，约占骨髓有核细 胞的0.5％，另外在脾脏、淋巴组织和外周血中也 有极少量的HSC。
人HSC的表面标志包括CD34+、CD38－、Lin－、 HLA-DR+、Thy-1+、c-kit+、Sca-1+、LFA-l+、 CD45RA－、CD71－等。
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三、ES细胞的生物学特性
形态学特征: ﹡具有稳定的二倍体核型； ﹡细胞相对较小； ﹡核大，有一个或几个核仁，核中多为常染色质； ﹡胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体； ﹡在体外分化抑制培养中呈克隆状生长，细胞紧密
地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清。
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生化特征: ﹡表达早期胚胎细胞的表面抗原； ﹡含有丰富的碱性磷酸酶； ﹡还具有很强的端粒酶活性； ﹡表达干细胞因子（stem cell factor，SCF）、
外源性因素 ﹡分泌因子 ﹡膜整合蛋白介导的细胞间相互作用 ﹡整合素与细胞外基质
内源性因素 ﹡转录因子：如Oct-4和Nanog ﹡细胞内蛋白：如Insc蛋白 ﹡“时钟”因子
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第二节 胚胎干细胞
➢ ES细胞的定义 ➢ 人胚胎干细胞系的建立 ➢ ES细胞的来源 ➢ ES细胞的生物学特性 ➢ ES细胞的开发和利用
cell is progressively restricted.
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干细胞的分类 ☆ 根据干细胞所处的发育阶段分为：
胚胎干细胞（embryonic stem cell） 成体干细胞（adult stem cell） ☆ 根据干细胞的发育潜能分为： 全能干细胞（totipotent stem cell） 多能干细胞（pluripotent stem cell） 专能干细胞（multipotent stem cell） 癌干细胞（cancer stem cell）
胚胎干细胞(自己做的ppt)
（3）治疗人类胚胎干细胞群
细胞治疗是指用遗传工程改造过的人体细胞直接移 植或输入病人体内，达到治愈和控制疾病的目的。 ES细胞经遗传操作后仍能稳定地在体外增殖传代。 以ES细胞为载体，经体外定向改造，使基因的整合 数目、位点、表达程度和插入基因的稳定性及筛选 工作等都在细胞水平上进行，容易获得稳定、满意 的转基因ES细胞系，为克服基因治疗中导入基因的 整合和表达难以控制，以及用作基因操作的细胞在 体外不易稳定地被转染和增殖传代开辟了新的途径。
（2）无限扩增
理论上，ES细胞具无限扩增的特性。体外无
限扩增的特性是ES细胞研究和应用的一个前 提和关键。早期胚胎细胞具全能性，但其数 量很少，相对说其实际应用意义没有ES细胞 大ES细胞在体外适宜条件下，能在未分化态 下无限增殖，为ES细胞研究和应用提供了无 限的细胞来源。
（3）可操作性
在体外，可以对ES细胞进行遗传操作选择，
（2）生产转基因动物
用ES细胞生产转基因动物，可打破物种的界
限，突破亲缘关系的限制，加快动物群体遗 传变异程度，可以进行定向变异和育种。利 用同源重组技术对ES细胞进行遗传操作，通 过细胞核移植生产遗传修饰性动物，有可能 创造新的物种；利用ES细胞技术，可在细胞 水平上对胚胎进行早期选择，这样可以提高 选样的准确性，缩短育种时间。
胚胎干细胞
概念
发展史
ES的形态学及
生物学特征 应用前景
（一）定义
胎干细胞（embryonic stem cell， ESCs，简称ES或EK细胞。）胚 胎干细胞是早期胚胎（原肠胚期 之前）或原始性腺种分离出来的 一类细胞，它具有体外培养无限 增殖、自我更新和多向分化的特 性。无论在体外还是体内环境， ES细胞都能被诱导分化为机体几 乎所有的细胞类型。胚胎干细胞 研究在美国一直是一个颇具争议 的领域，支持者认为这项研究有 助于根治很多疑难杂症，是一种 挽救生命的慈善行为，是科学进 步的表现。而反对者则认为，进 行胚胎干细胞研究就必须破坏胚 胎，而胚胎是人尚未成形时在子 宫的生命形式。
干细胞培训知识
干细胞入岗培训资料一、干细胞知识问答二、河南省干细胞库介绍及优势三、常见问题解答一、干细胞知识1.干细胞的概念干细胞是在生物个体的生长和发育中起“主干”作用的原始细胞，具有自我复制和多向分化潜能的细胞，它是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生人体各种组织器官的潜能，医学界称之为“万用细胞”。
干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命学科研究领域！1999年干细胞研究被美国《科学》杂志评为1999年度世界十大科学之冠，2000年干细胞研究再次被《科学》杂志评为该年度世界十大科学成就之一。
2、干细胞的类型：胚胎干细胞embryonic stem cells胚胎干细胞主要是指来自囊胚内细胞团的细胞，有自我更新和多向分化潜能，可以分化为内、中、外三个胚层的各类细胞。
成体干细胞adult stem cells成体干细胞是处于干细胞状态的成体细胞，包括成年和未成年动物组织中的各种干细胞，因此又称为组织干细胞。
如神经干细胞、造血干细胞、骨髓间质干细胞、上皮干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞等。
成体干细胞功能：自然条件下成体干细胞倾向于分化成所在组织的细胞，参与组织更新和损伤修复；外界条件诱导下成体干细胞可横向分化成其他组织的细胞，参与这些组织的损伤修复。
3.什么是干细胞治疗？干细胞治疗是一种使用健康的干细胞来代替或修复病人受损细胞和组织的治疗方式，干细胞治疗法就像给机体注入新的活力，是从根本上治疗许多疾病的有效方法。
4.什么是间充质干细胞（MSC）？间充质干细胞是干细胞的一种，因能在体内外特定环境下，分化成为骨、软骨、肌肉、脂肪等间叶组织而得名。
间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）是干细胞的一种，因能分化为间质组织而得名，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞。
间充质干细胞具有干细胞的共性，即具有自我更新和多向分化潜能的生物学特性；此外，间充质干细胞还具有体外扩增的特性。
干细胞 ppt课件
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干细胞基础知识
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什么是干细胞
干细胞(stem Cell)是指一群在胚胎发育早期未分 化的细胞，具有自我更新能力(self-renew)和多向 分化潜能(multipotential) 。干细胞就是在生命的 成长和发育中起“主干”作用的细胞，它对于生命 成长发育的重要性就如同建筑中的钢筋水泥等基本 材料。干细胞是人类的原始细胞，能够发育成人体 任何类型的组织和器官，可塑性很强，因此被称为 “万能细胞”。
干细胞可以通过自我复制，产生与亲本完全相同的子代
细胞，以保持干细胞数量的恒定可通过分裂维持自身细
胞的特性和大小；
➢ 多向分化：
干细胞在一定条件下可以进入分化程序，可进一步多向
（或定向）分化为逐步成熟的次级子代细胞，最终形成
功能特异的组织细胞，在组织修复和新陈代谢中起重要
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干细胞研究
2010年11月15日
温家宝总理考察中
国科学院广州生物
医药与健康研究院
时强调“干细胞研
究代表着科技事业
未来发展的重要方
向。”
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干细胞研究
奥巴马2009年签署 行政命令，宣布联邦 政府资金可用于支持 胚胎干细胞的研究。
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干细胞研究
医药界的诺贝尔奖——美国盖伦奖包括三个奖项：最佳药 品，最佳生物制品和最佳医疗器械。 Hemacord——美国纽约血液中心的首个脐带血干细胞产 品获得2014年美国盖伦奖的最佳生物技术产品奖。
干细胞的四大特性
干细胞概述ppt课件
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干细胞是目前人类组织器官功能再生的唯一希望
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Part 1 干细胞
干 细 胞 （ Stem-cell ） 即 为 起
源细胞，是指尚未发育成熟的细胞， 它具有多分化潜能和自我复制的功能 ，在特定条件下，可以分化成不同的 功能细胞，形成多种组织和器官。
干细胞形态
干细胞分类
✓ 按分化能力可分为全能干细胞 (totipotent stem cells)、多能干细 胞 (pluripotent stem cells)以及单能干细胞 (unipotent stem cells) ；
以往认为，中枢神经系统的神经元在出生前或出生后不久，就失去再生能力。但近年的一些研究表明，成年哺乳动 物的脑组织仍可不断产生新的神经元，成人脑组织中同样存在NSC,主要是在侧脑室下层(SVZ)和海马齿状回两处。
目前多使用基因转移的方法，建立神经干细胞系，即诱导NSC的细胞周期不断循环往复，从而阻止其分化过程。永 生化的NSC具有较好的生物学特性，它们能自我复制并在体外大量增殖，在移植人体内后仍具有多向分化潜能，同 时可被转染并稳定地表达外源基因。
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神经干细胞
根据部位分类神经嵴干细胞(neural crest stemcell，NCSC)和中枢神经干细胞(CNS-SC)。
外周神经干细胞(PNS-SC)，既可发育为外周神经细胞、神经内分泌细胞和Schwann氏细胞，也能分化为色素细胞 (pigmented cell)和平滑肌细胞等。NSC一般是指存在于脑部的中枢神经干细胞(CNS-SC)，其子代细胞能分化成为 神经系统的大部分细胞。
两位科学家山中伸弥和汤姆斯共同获得诺贝尔医学奖
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不能神话也不能妖魔化干细胞
心脑血管疾病、恶性肿瘤、病毒性疾病、遗传病仍是医学领域4大生 命科学难题，目前全球治疗效果有限，干细胞也不例外。
胚胎干细胞培养与应用
第四步：合子形成。雌雄原核融合形成合子(受精卵)。
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4．动物排出卵子的成熟程度不同，有的可能是 次级卵母细胞，如猪、羊等；有的可能是初级卵 母细胞，如马、犬等，但它们都要在输卵管内进 一步成熟，当达到减数第二次分裂的中期时，才具 有与精子受精的能力。
分化。对它可以进行冷冻保存，也可以进行遗传改造。
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3、来源：早期胚胎囊胚的内细胞团
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内细胞团：
内细胞团（未分化的细胞）具有很强的分化能力，可 以进一步分裂、分化，形成组织和器官，再逐步发育成个 体。
这些细胞被认为具有全能性，称为胚胎干细胞。
答案 培养液成分
盐类：无机盐和有机盐 营养物质：氨基酸、核苷酸 调节物质：维生素、激素 特有物质：动物血清
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三、胚胎移植
1、胚胎移植成功与否的两个重要条件 （1）同种动物之间进行胚胎移植易于成功。这里的“同种”是指“
同物种”。 （2）供、受体生理状态要相同，为此必须做到：
第三，受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排 斥反应，这为胚胎在受体内的存活提供了可能。 第四，供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联 系，但移入受体的供体胚胎的遗传特性，在孕育过程 中不受任何影响。
5．胚胎早期培养过程中有两次用到了显微镜进行检 查：
①在进行卵母细胞成熟培养前，要抽取卵母细胞第30页，此课件共56页哦
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（1）受精的标志和受精完成的标志分别是什么？
受精的标志是卵黄膜和透明带的间隙出现两个极体； 受精完成标志是雌雄原核融合为合子。
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人类胚胎干细胞基础技术 高级培训班
2010-12 上海斯丹赛生物技术有限公司 www.SiDanSai.com
目 录 1. 绪论......................................................................................................................... 3 2. 饲养层细胞的制备................................................................................................. 4 2.1 从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） .............................................. 4 2.2 MEF的传代 ................................................................................................. 5 2.3 MEF的冻存 ................................................................................................. 5 2.4 MEF的失活 ................................................................................................. 6 3. 饲养层细胞的准备................................................................................................. 7 4. ES/iPS细胞的复苏 ................................................................................................ 9 5. ES/iPS细胞的传代 .............................................................................................. 10 6. ES/iPS细胞的冻存 .............................................................................................. 12 7. 人类胚胎干细胞的无滋养层培养....................................................................... 13 7.1 人类胚胎干细胞条件培养基（CM）的收集 .......................................... 13 7.2 无饲养层人胚胎干细胞系的培养及传代 ................................................ 13 8. 拟胚体的形成....................................................................................................... 14 9. 胚胎干细胞全能性的鉴定................................................................................... 15 9.1碱性磷酸酶活性检测.................................................................................... 15 9.2干细胞表面marker的免疫染色检测.......................................................... 16 9.3干性因子的去甲基化程度分析.................................................................... 17 9.4干细胞内源基因的表达分析........................................................................ 19 9.5端粒酶活性检测............................................................................................ 21 9.6核型检测........................................................................................................ 21 9.7拟胚体形成.................................................................................................... 21 9.8畸胎瘤形成实验............................................................................................ 22 10. 干细胞技术培训及服务一览表 ....................................................................... 23 11. 附录 ................................................................................................................... 24 上海斯丹赛生物技术有限公司 www.SiDanSai.com
1. 绪论 本操作手册将为您详细介绍人胚胎干细胞/iPS细胞培养的基础知识、技术细节及相关的产品信息。目的是为了让您更好地培养您购买的细胞，请按照此手册进行培养操作直至获得可靠的冻存细胞。上海斯丹赛生物技术有限公司专业提供各类胚胎干细胞/iPS细胞及成套产品服务，为您的干细胞研究提供一站式解决方案。 上海斯丹赛生物技术有限公司 www.SiDanSai.com
2. 饲养层细胞的制备 材料与仪器 成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01 胰酶，货号M-005-1 成纤维细胞冻存液（2x），货号EFFM-01 基质胶（Matrigel matrix），BD Pharmingen，货号356235 CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），货号MEF-CF1-01 T25透气培养瓶，NUNC，货号156367 T75透气培养瓶，NUNC，货号156499 2 ml移液管，NUNC，货号159617 5ml移液管，NUNC，货号159625 10 ml移液管，NUNC，货号159633 15ml离心管，货号366036 50ml离心管，货号373660 冻存管，NUNC，货号377267 Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头 生物安全柜，货号 CO2培养箱，Thermo，HERA cell 150i 电子计数器，millipore，货号PHCC00000 电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800 低速离心机，Thermo Scientific CL10 液氮罐，Thermofisher，货号CN50900
2.1 从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） 1. 拉断颈椎处死怀孕12-13天的CF-1小鼠，浸入70％的酒精中消毒。 2. 将小鼠放在超净台无菌的解剖盘中，在腹中线处做一横向切口。 3. 剪开的皮肤拉向切口的上下两侧，提起腹膜，将其剪开，充分暴露腹腔。 4. 找出子宫，一只手用无菌钝口镊子轻轻提起子宫，另一只手持无菌镊子小心分离子宫周围的结缔组织。当两侧子宫都与其相连的组织分离好后，用剪刀将左右两侧的子宫在输卵管与子宫角的衔接处剪下，小心剪下子宫的联体部分，置于无菌的60mm培养皿中。 上海斯丹赛生物技术有限公司 www.SiDanSai.com
5. 用无菌的剪刀在子宫头与子宫尾分别剪去输卵管及子宫角部分。 6. 将子宫置于15ml离心管中，用10mlPBS洗三遍。 7. 用尖镊子撕开子宫壁和胎膜，取出胎鼠，放在新的培养皿中。 8. 用8mlPBS 将胎鼠洗三遍。 9. 用灭菌的眼科剪刀去除胎鼠的胚囊，释放胚胎，并胚胎计数。 10. 将胚胎移到干净的培养皿中，PBS洗三次。 11. 用镊子小心的去除胚胎的头和肝脏，PBS洗三次。 12. 将胚胎转移至新的培养皿中，用无菌剪刀将组织充分剪碎，加入0.25％胰酶同时吹打几分钟使其消化均一并彻底酶解。 13. 用同样体积的MEF完全培养基中和胰酶。 14. 一个T75瓶加10ml MEF完全培养基，按照每2-3个胚胎一个T75瓶，将已消化的胚胎加入培养瓶中，放在5％CO2培养箱中培养，培养瓶注明细胞名称，代数及日期。
2.2 MEF的传代 1. 将T75瓶中的MEF培养基吸出。 2. 加入大约3ml胰酶 ，于37℃的CO2培养箱中放置3-5分钟 3. 取出瓶子，轻轻晃动，可以看见白色的细胞层开始从瓶子的底壁掉落。确保瓶盖是拧紧的。用手掌根轻拍瓶侧3-5次。在灯下观察细胞是否已从瓶子上脱落。 4. 加入同等体积（3ml）的MEF培养基，混匀，吹打几次以形成单细胞悬浮液。 ▲Note: 这一培养基是包含血清的，将会完全抑制胰酶的活性。 5. 补加42mlMEF培养基到瓶子中，使总体积达到50ml，混匀。 6. 将上述细胞悬浮液均分至5个新的T75瓶子中，每瓶10ml。 7. 放在5％CO2培养箱中培养，逐日观察。
2.3 MEF的冻存 1. 吸去培养液，加3ml0.25％胰酶至完全覆盖瓶底（以T75为例）。 2. CO2培养箱中孵育3-5分钟，不时轻拍瓶壁，使细胞层脱落。