免疫荧光技术操作步骤

免疫荧光技术操作步骤

一. 直接免疫荧光法测抗原

基本原理

将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。

试剂与仪器

磷酸盐缓冲盐水（PBS）：L，

荧光标记的抗体溶液：以L，的PBS 进行稀释

缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9 份+ 碳酸盐缓冲液1 份配制

搪瓷桶三只（内有L，的PBS 1500ml）

有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）

荧光显微镜

玻片架

滤纸

37℃温箱等。

实验步骤

1. 滴加L，的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。

2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一

30min

定时间（参考：30min）。

3. 取出玻片，置玻片架上，先用L，的PBS 冲洗后，再按顺序过L，

的PBS 三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。

4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：

（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++

--++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）

或（-），即可判定为阳性。

注意事项

1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在1：20-100 之

间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，

影响结果的观察。

2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min 到数

小时，一般30 min 已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，

但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染

色过夜较37℃30 min 效果好的多。

3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染

色的干扰。

（1）标本自发荧光对照：标本加1-2 滴L，的PBS。

（2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗

体。

如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。

4. 一般标本在高压*灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。

二. 间接免疫荧光法测抗原

基本原理

染色程序分为两步，第一步，用已知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原（待检标本）

标本上，在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。

第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM 抗体（通常为荧光标记的对应二抗）。

如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的荧光标记的二抗就会和已结合抗原的抗体进一步结

合，从而可鉴定被检测抗原。

试剂与仪器

磷酸盐缓冲盐水（PBS）：L，

缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9 份+ 碳酸盐缓冲液1 份配制。

荧光标记的抗人球蛋白抗体：以L，的PBS 进行稀释。

搪瓷桶三只（内有L，的PBS 1500ml）

有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）

荧光显微镜

玻片架

滤纸

37℃温箱等。

实验步骤

1. 滴加L，的PBS 于未知抗原标本片，10min 后弃去，使标本片保持一定湿度。

2. 滴加以L，的PBS 适当稀释抗体，覆盖未知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。

3. 取出玻片，置于玻片架上，先用L，的PBS 冲洗1-2 次，然后按顺序过L，的PBS 三缸浸泡，每缸

5min，不时振荡。

4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记二

抗

5. 将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。

6. 重复操作3。

7. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。

8. 荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。

注意事项

1. 荧光染色后一般在1h 内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。

2. 每次试验时，需设置以下两种对照：

（1）阴性对照：阴性血清+荧光标记物（需有使用人员自行建立标准）

（2）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物

如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，待检标本呈强荧光，则为

特异性阳性染色。

3. 未知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。

4. 所滴加的抗体或荧光标记物，应始终保持在未知抗原标本片上，避免因放置不平使液体

流失，从而造成非特异性荧光染色。

Storage: Store at –20 oC for one year. Avoid repeated freeze/thaw cycles. The

lyophilized antibody is stable at room temperature for at least one month and for greater

than a year when kept at -20oC. When reconstituted in sterile pH PBS or diluent

of antibody, the antibody is stable for at least six weeks at 2-4 oC.