环介导等温核酸扩增技术快速检测食物中的大肠杆菌O157

环介导等温核酸扩增技术快速检测食物中的大肠杆菌O157王丽;徐振波;赵喜红;钟青萍【摘要】The specificity and sensitivity of a loop-mediated isothermal amplification （LAMP） method was developed and evaluated for rapid detection of the food-borne Escherichia coli O157 strains. Six primers, including outer primers, inner primers and loop primers, were specially designed for recognizing eight distinct sequences on three targets, which were rfbE, stxl and stx2. The detection limits were found to be 100, 100 and 10 fg DNA/tube for rfbE, stxl and stx2, respectively. Application of LAMP assays were performed on 417 food-borne E. coli strains, the sensitivity of LAMP assays for the rfbE, stxl and stx2 was 100% , 95.3% and96.3% , and the negative predictive value （NPV） was 100%, 96.7% and97.1% respectively; with a 100% specificity and positive predictive value （PPV） for all three targets. The results showed that the LAMP assay has proven high specificity, sensitivity and easy operation features in the detection of Escherichia coli 0157. It also implied that the assay owned good application prospect in food safety detection.%建立了环介导等温核酸扩增技术（LAMP）检测食源大肠杆菌O157，并对该方法的灵敏度和特异性进行了评价。

分别针对大肠杆菌0157三个特异基因frbE，stx1和stx2的8个独立靶区域设计了外引物、内引物和环引物进行LAMP扩增检测，同时将检测结果与PCR方法做比较。

研究结果表明，frbE，stx1和stx2基因的LAMP方法检测限分别为100，100和10fgDNA／管，灵敏度是PCR方法的10倍以上；将建立的环介导等温扩增法用于417株食物分离的大肠杆菌的检测，发现LAMP检测frbE，stx1和st【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2011(037)005【总页数】5页(P146-150)【关键词】环介导等温核酸扩增（LAMP;大肠杆菌O157;快速检测【作者】王丽;徐振波;赵喜红;钟青萍【作者单位】华南农业大学食品学院,广东广州510642;华南理工大学轻工与食品学院,广东广州510640;华南理工大学轻工与食品学院,广东广州510640;华南农业大学食品学院,广东广州510642【正文语种】中文【中图分类】TS207.4志贺毒素大肠杆菌是一种重要的病原菌，其中大肠杆菌O157:H7是最为人们熟知和研究较多的一种重要血清型。

该致病菌传播途径复杂多样，主要经食品传播，被感染者出现腹泻、呕吐、剧烈腹痛、出血性结肠炎溶血性贫血、溶血性尿毒症等临床症状［1］。

大肠杆菌O157:H7产生的志贺毒素主要包括志贺毒素1(Stx1)和志贺毒素2(Stx2)，已报道的Stx2变种与Stx1在物理化学、免疫学和分子遗传学方面具有不同的特征。

大肠杆菌O157引起的危害受到广泛关注，是我国进出口食源性产品必检的致病菌之一［1］。

基于国家标准的分离培养、生化及血清学鉴定需要耗费大量的时间，达几天之久。

还有一些快速检测方法，比如应用较广泛的酶联免疫技术，其中，免疫磁珠技术［2－3］和胶体金免疫层析技术［4］具有易操作和快速的特点，但是，检测样品特异性不够高，容易出现误判。

PCR技术和实时定量PCR技术在过去几十年里被大量用于病原菌的检测，灵敏度高和特异性较传统方法有较大提高，但是，PCR 方法必须有精密的温度循环装置，且仅限于实验室操作，另外反应过程容易受污染物影响，假阳性较高，从而使其无法满足实地检测的需要［5］。

因此，亟需开发建立灵敏、快速的检测技术实现对大肠杆菌O157:H7及其志贺毒素的高效检测。

而新型的核酸扩增技术，环介导恒温核酸扩增技术(LAMP技术)就具有诸多优越性［6］。

该技术依赖Bst DNA聚合酶在恒温条件下实现靶基因的自循环链置换合成反应，引物能识别基因的6个或8个独立区域，特异性较PCR大大提高，反应原理如图1所示。

另外，反应的温度处于恒温条件60～65℃，普通水浴锅就可以满足扩增的需求，节省了检测费用。

检测结果可以方便地通过目视判别，大量目标DNA合成的同时伴随有白色的副产物焦磷酸镁沉淀产生。

目前，LAMP技术在食品安全检测、疾病诊断及环境安全等方面有成功应用的报道［7－9］。

本研究，将以志贺毒素基因为研究对象，建立环介导等温核酸扩增反应实现对大肠杆菌O157:H7的检测，并对一大批食物分离的样品进行检测，以验证其灵敏度和特异性。

研究结果和方法将为其他食源致病细菌的快速检测提供理论基础。

1.1 菌种34株参考菌株，包括不同菌种种类的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌在本研究中用于检测LAMP方法的灵敏度和特异性，菌株信息及携带基因信息如表1所列。

417株食物分离的大肠杆菌菌株，其中154株为大肠杆菌O157菌株，263株为非O157大肠杆菌菌株。

这些菌株是2003－2007年从各种不同的食物样品中分得，现保存于中山市质量计量监督检验所临床微生物学实验室。

1.2 引物设计针对大肠杆菌的特异基因rfbE基因、志贺毒素基因stx1和stx2分别设计引物。

选择基因的保守区域，针对8个独立区域，分别设计一对内引物(包括前内引物FIP和后内引物BIP)、一对外引物(包括F3和B3)以及环引物(包括LF和LB，加速反应进行)，如表2所列。

前内引物FIP包括互补序列F1，一个T－T－T－T链桥和F2;后内引物包括B1C，一个T－T－T－T链桥和互补序列B2C;外引物F3和B3分别位于F2和B2区域的外侧;环引物分别位于F2和F1之间，B1和B2之间。

1.3 LAMP方法和PCR方法的建立34株参考菌株的DNA提取方法按照参考文献进行［10－11］。

为了验证 LAMP 方法和 PCR方法的检测限，将大肠杆菌O157 WF01201的模板DNA进行十倍系列稀释，分别用于rfbE基因、stx1基因和stx2基因的检测。

25 μL的 LAMP反应体系包括各1.6 μmol/L的引物FIP和BIP，各0.2 μmol/L的引物 F3和 B3，各0.8μmol/L的引物 LF 和 LB，1.6 mmol/L 的 dNTP，6 mmol/L的 MgSO4，1 mol/L 甜菜碱(sigma)，1 ×恒温缓冲液 (New England Biolabs)，8 U/μL的Bst大片段DNA聚合酶以及一定数量的靶基因组DNA。

将混合物置于65℃恒温反应60 min，最后在80℃下5 min结束反应。

设阴性对照和阳性对照，防止反应过程中的交叉污染。

LAMP的外引物F3和B3用于PCR反应扩增。

50 μL PCR 反应体系包括:1 μL DNA 模板、各 30 pmol外引物、1.25U Taq DNA聚合酶、10 mmol/L dNTP 2 μL 和5 μL 的l×thermopol buffer。

扩增循环条件为:94℃ 预变性5 min，之后94℃变性30 s;50℃退火30 s;72℃延伸1 min，共30个循环，最后延伸7 min。

取PCR产物5 μL，在1.5%琼脂糖凝胶电泳上100 V电泳20 min，EB染色后在凝胶成像系统下照像检测。

1.4 应用LAMP方法检测食物分离的大肠杆菌利用以上建立的LAMP方法和PCR方法分别检测从食物中分离的417株大肠杆菌。

大肠杆菌的模板利用简易煮沸法制备，具体为:采用培养过夜的细菌培养物用含有1 mmol/LEDTA的10 mmol/L Tris-HCl溶液进行10倍稀释，悬液煮沸10 min后置于冰上，然后12，000 g离心 3 min，上清液用于 LAMP 和PCR反应的模板。

LAMP反应结果检测，一是通过凝胶电泳检测:65℃ 恒温反应60 min后，产物在2%琼脂糖凝胶上100 V电泳分离25 min，加样量为7μL/上样孔，阳性反应会在凝胶上产生梯型条带。

凝胶置于EB中染色10 min，在凝胶成像系统下照像检测。

同时，利用目视观察(为了方便LAMP技术用于现场快速、方便检测，利用目视观察就能区别结果是最简便的一种手段)。

扩增反应结束后，观察反应小管混合液的外观变化，向各反应小管中加入1 μL(1∶100)的SYBR Green I荧光染料。

SYBR Green I染料与双链DNA结合会发绿色荧光，所以，在自然光下目视观察，如果染料颜色由开始的橙色变为绿色则为阳性，同时将染色结果放置在紫外灯下，阳性结果有荧光产生。

同时用PCR方法对比验证LAMP检测方法的灵敏度和特异性。

以上检测过程均重复2次，以验证方法的重现性。

2.1 LAMP方法用于检测大肠杆菌O157 WF01201的灵敏度和特异性将一系列稀释的大肠杆菌O157 WF01201用煮沸法简易提取DNA分别用于LAMP反应和PCR反应，检测结果如图2。

LAMP方法对rfbE基因的检测限是100 fg DNA/管，PCR为10 pg DNA/管;LAMP方法对stx1基因的检测限是100 fg DNA/管，PCR为10 pg DNA/管;LAMP方法对stx2基因的检测限是100 fg DNA/管，PCR 为100 pg DNA/管，表明，LAMP 方法的检测灵敏度是PCR方法检测灵敏度的10倍以上。

为了验证引物的特异性，将LAMP方法用于27株革兰氏阴性菌和7株革兰氏阳性菌的检测，未发现假阳性结果的产生，说明建立的LAMP方法具有高特异性。