血凝抑制试验结果判定
实验四血凝和血凝抑制试验
3. 0.85%生理盐水. 4. 被检血清,采自被检鸡的血清.
四、操作步骤 〔一血凝试验〔HA
1. 在血凝板第一排的1~12孔加入50μl生理盐水. 2. 在第1孔中加入50μl病毒抗原,反复吸取混匀后
〔Hemagglutination and Hemagglutination
Inhibition, HA and HI
动物病原学实验之六
一、实验目的
掌握血凝和血凝抑制试验的原理,以及使 用该试验测定血清抗体水平的操作步骤和结 果判定方法.
二、实验原理
〔一血凝试验〔HA
➢ 有些病毒能够促使某些动物〔如鸡、鹅、豚鼠、 绵羊和人的红细胞发生凝集,这就是红细胞凝集 现象,称做血凝试验.
以50%的红细胞发生凝集的病毒悬液的最高稀释度 作为血凝价的终点,即一个血凝单位.
〔二血凝抑制试验〔HI
1. 在血凝板的1~12孔加入50μl生理盐水,最后一孔加 100μl.
2. 第1孔加入待检血清50μl,混匀后吸50μl至第2孔,倍比 稀释直至第10孔,混匀后弃50μl.
3. 从1~11孔,每孔加稀释好的50μl 4个血凝单位的病毒悬 液.
放映结束 感谢各位的批评指导！
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让我们共同进步
➢ 象各种脑炎病毒、口蹄疫病毒等,凝集红 细胞的条件很严格,对红细胞的种类有很 严格的选择,同时还要掌握反应的pH和温 度等.
〔二血凝抑制试验〔HI
➢ 当病毒悬液中加入特异性抗体时,这种红 细胞凝集的现象就被抑制,称做红细胞凝 集抑制试验,也叫血凝抑制试验.
HI试验的原理图
血凝抑制试验结果判定
孔号
生理盐水 （ml） 尿囊液 （ml）
1
0.2 + 0.2
2
0.2 + 0.2
3
0.2 + 0.2
4
0.2
+ 0.2
5
0.2
+ 0.2
6
0.2
+ 0.2
7
0.2
+ 0.2
8
0.2
+ 0.2
9
0.2
+ 0.2
10
0.2
0.2弃掉
对照
病毒稀释 度 补充液 （ml） 鸡红血球 细胞悬液 （ml）
1∶10
1∶10
1∶20
1∶40
1∶80
1∶160
1∶320
1∶640
0.2弃掉
各0.2ml 各0.4ml
0.2ml
血凝试验原理
血凝素（hemagglutinin HA）：由病毒基因编码 的糖蛋白刺突。与病毒吸附和传入宿主细胞有关。 HA能与人或其它动物多种红细胞表面N－乙酰 神经氨酸酶受体结合引起红细胞凝集。
血凝试验结果判定
效价判定： 凝集特别显著：“＋＋＋＋” 凝集现象次之：“＋＋＋” 凝集清楚可见：“＋＋” 稍显凝集者：“＋” 血凝效价：呈“＋＋”凝集时的最高稀释度。此 时的稀释度即为1个血凝单位。
血凝Байду номын сангаас制试验原理
病毒引起的血凝现象能被相应的抗血凝素抗体所 抑制，称血凝抑制。利用血凝素特异性抗体与病 毒表面相应的HA相互作用，使病毒血凝现象抑 制的试验称血凝抑制试验。
血凝原理
血凝抑制原理
血凝抑制试验结果判定
血凝及血凝抑制实验
1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢，以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄色，之后直至清亮为清洗干净）。 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸取干净。
血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验
一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验材料 五、实验方法与结果判定 六、注意事项 七、红细胞制备
一、实验目的
1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操 作方法和结果判定方法 2、了解新城疫有关背景知识
二、实验内容
1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体（疫苗注射后的抗体检测）
三、实验原理
1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。
病毒颗粒
红细胞
2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋ ：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集； 4、 ＋ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集；
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血凝抑制实验_实验报告
一、实验目的1. 了解血凝抑制实验的基本原理和操作方法。
2. 掌握血凝抑制实验在禽流感病毒检测中的应用。
3. 学会通过血凝抑制实验结果判断禽流感病毒的感染情况。
二、实验原理血凝抑制实验（Hemagglutination Inhibition Test，HIT）是一种检测病毒感染的方法，通过检测血清中病毒特异性抗体的存在和效价，来判断动物是否感染过某种病毒。
在禽流感病毒检测中，该实验主要用于检测血清中的禽流感病毒抗体水平，从而判断禽流感病毒感染状态。
实验原理：当禽流感病毒与含有抗体的血清混合后，病毒表面的血凝素（HA）与抗体结合，导致病毒颗粒聚集，血凝素活性降低，从而使红细胞不发生凝集。
通过观察红细胞是否发生凝集，可以判断血清中是否含有禽流感病毒抗体。
三、实验材料1. 禽流感病毒抗原2. 1%鸡红细胞悬液3. 0.5%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）4. PBS缓冲液5. 96孔V型酶标板6. 微量移液器7. 振荡器8. 恒温培养箱9. 移液器吸头四、实验方法1. 准备工作（1）将禽流感病毒抗原用PBS缓冲液稀释至适当浓度。
（2）将鸡红细胞悬液用PBS缓冲液稀释至1%。
（3）将PVP用PBS缓冲液溶解，浓度为0.5%。
2. 血凝抑制实验（1）取96孔V型酶标板，每孔加入25μL PBS缓冲液。
（2）在第一排第1孔中加入25μL禽流感病毒抗原，混匀后，从第1孔吸取25μL加入第2孔，依次进行倍比稀释至第24孔，最后弃去25μL。
（3）向每孔加入25μL 1%鸡红细胞悬液，混匀后置于振荡器上振荡10秒。
（4）将酶标板置于室温（20-25℃）下静置30分钟。
（5）观察红细胞是否发生凝集，记录结果。
3. 结果判定（1）完全抑制：红细胞不发生凝集。
（2）部分抑制：红细胞发生凝集，但凝集程度较轻。
（3）未抑制：红细胞发生凝集，凝集程度明显。
五、实验结果与分析1. 结果记录根据实验结果，记录每孔红细胞凝集情况，并计算抑制率。
血凝抑制试验结果判断 [血凝血凝抑制试验说明书]
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血凝抑制试验结果判断 [血凝血凝抑制试验说明书]鸡新城疫血凝与血凝抑制实验鸡新城疫血凝(ha)及血凝抑制(h1)试验基本原理:许多病毒表面具血凝素,具有凝集某些动物或人红细胞的特性,称为血凝现象,可用于鉴定病毒。
血凝现象可以被特异性抗体所抑制,称为血凝抑制现象,利用这种特性可进行血清学试验,称为血凝抑制试验。
器材及试剂:待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液;待检血清:抗鸡新城疫病病毒阳性血清;生理盐水/pbs、1%鸡红细胞、96孔v形微量血凝板、加样器等。
实验步骤pbs的配制:1%鸡红细胞的配制:(一)血凝试验(ha)取96孔板,按以下步骤操作:1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul,第二排1-12孔加生理盐水50ul为红细胞对照;2、吸50ul病毒液于第一排第1孔,混匀后取50ul至第2孔,依次稀释至第12孔,弃去50ul,各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12。
3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul,微型震荡器震荡2min混匀。
4、室温静置10-30分,观察结果(见下表)。
5、结果判定:红细胞对照组红细胞完全沉降,以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数,作为病毒的血凝价,即hi效价,用2n表示。
(二)四单位检测:(三)血凝抑制试验(hi)取一96孔板,按以下步骤操作:1、4个单位抗原的制备:按ha试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。
2、待检血清的稀释:第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul,于第一排第1孔中加入50ul待检血清,反复吹吸3-5次混匀后,取50ul至第2孔混匀,吸取50ul至第3孔,依次稀释至第12孔,弃去50ul,经倍比稀释,血清的稀释倍数为21~212。
3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul,微量震荡器震荡2min混匀;4、室温静置20min;5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul,微量震荡器震荡2min混匀混匀。
血凝、血凝抑制试验
⾎凝、⾎凝抑制试验红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）⼀、实验⽤设备：1、离⼼机 1台*（3000转离⼼红细胞）2、冰箱 1台*（存放抗原）3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规⼚家进。
5、96孔V型板稀释⾎清清洗后可重复使⽤6、⼋道移液器 1把（5-50微升稀释⾎清）7、吸头和⼋道移液器配套使⽤，清洗后重复使⽤）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放⽣理盐⽔加样⽤9、⼀次性采⾎管采⾎⽤10、2毫升注射器采⾎⽤11、红细胞⾮免疫鸡⼼脏采⾎或免疫鸡也可，但需离⼼5次后使⽤。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂⽤13、重铬酸钾配制清洁液⽤14、硫酸配制清洁液⽤15、吸管 1毫升、10毫升16、吸⽿球和吸管配套使⽤17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采⼤鸡）18、蒸馏⽔当地买。
清洗96孔V型板、吸头⽤19、10毫升离⼼管离⼼红细胞⽤（塑料制）20、⽣理盐⽔做⾎清稀释液⽤、配制4单位抗原⼆、实验前的准备：1.抗原：从指定⼚家购买稳定浓缩抗原。
2.抗凝剂的配制：⽤天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶⼊100ml⽣理盐⽔中，待溶解完全后即可使⽤。
3.1％红细胞悬液：由鸡⼼脏或翅静脉采⾎，放⼊加有抗凝剂的离⼼管内（按抗凝剂：全⾎＝1：2的⽐例），迅速混匀。
在离⼼机中以3000转/分离⼼5分钟，⽤吸管吸去上清液和红细胞上层的⽩细胞薄膜，将沉淀的红细胞加⽣理盐⽔，慢慢混合均匀，再在离⼼机中3000转/分离⼼5分钟，弃去上清液，再加⽣理盐⽔混匀，如此反复离⼼4～5次，最后⼀次离⼼后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。
放⼊4℃冰箱中可保存2—3天。
使⽤时⽤1ml 吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加⼊9.9ml的⽣理盐⽔，此即1%红细胞悬液。
现⽤现配。
4.被检⾎清：每只鸡⼼脏或翼下采⾎0.5-1ml,静置或离⼼，待⾎清析出后备⽤。
5.吸管清洁液的配制：使⽤1%的稀硫酸溶液。
血凝和血凝抑制试验
血清
生理盐水 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50
被检血清 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 弃 25μl / /
病毒悬液 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 /
1%RBC 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
实验八 血凝和血凝抑制试验
（Hemagglutination and Hemagglutination Inhibition, HA and HI）
2013.12.11
能凝集红细胞的病原
禽流感病毒 新城疫病毒 传传染性支气管炎病毒（胰酶，磷脂酶C） EDS76 副鸡嗜血杆菌 鸡毒支原体
＝1:23为可疑
六、思考题
血凝和血凝抑制试验在兽医学中的应用。
细胞对照
HA HI
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 RBC RBC
稀释倍数 1:21 1:22 1:23 1:24 1:25 1:26 1:27 1:28 1:29 1:210
生理盐水 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 病毒悬液 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 弃 5/0μl / 1%红细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
3. 0.85%生理盐水。 4. 被检血清，采自被检鸡的健康血清。
四、实验步骤
（一）血凝试验（HA）
1. 1~12孔加入50μl生理盐水; 2. 第1孔加50μl病毒悬液，倍比稀释到第10孔； 3. 1~12孔中加入1%的红细胞50μl； 4. 震荡后置37℃25~30min观察结果。 5. 病毒液的血凝价是1:2？。
HI-HA试验原理
反应温度不能太高，若在37℃ （如温箱） 下进行，会影响检测结果。 标准抗原稀释液浓度必须为4个HA单位 /25μl，必须每天制备并在试验前滴定。 孵育时间要严格控制。红细胞对照完全 沉淀时要迅速判读。在一些病毒株中可 见红细胞从病毒中解脱，如果有这种情 况的发生，要提前判定或4℃下孵育。
HI试验注意事项
NDHI 的判读
注意事项 不同实验室结果可以不同 要有阳阴性对照 了解现场生产背景 临床解剖资料 免疫情况、采血周龄
应用
检测血清中的抗体水平。 鉴定病毒。 辅助诊断病毒性疾病。 作为适时免疫的辅助手段，能避免免疫失 败、免疫空挡及重复免疫造成的损失。
禽流感免疫效果监测
发 病
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
前 发 17d 病 前 1d 5d 8d 9d 11 d 15 d 15 d 15 d 19 d 21 d 24 d 26 d 26 d
发病前后ND抗体的变化
NDHI与临床症状的关系
NDHI NDHI NDHI NDHI <4 4-7 6-8 8-10 感染100％死亡 感染发病90％不死 感染发病100%不死 感染产蛋下降、 NDHI上升 感染只见NDHI上升 病毒无法侵入
微量血凝板的清洗，对试验结果有很大的 影响。 使用过的凝集板，要按程序清洗干净。 清洗程序：试验完毕即将凝集板用自来水 反复冲洗，再用洗涤剂的温水溶液浸泡30 分钟，并在洗涤剂溶液中以棉拭子刷洗凹 孔及板面，待反应板干燥后，放到2—3% 浓度的盐酸中浸泡24小时以上，捞出用自 来水冲洗多次，最后以蒸馏水冲洗2—3次， 在37度温箱中烘干备用。
血凝试验（血凝效价的滴定)
血凝试验结果判定
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血凝抑制试验结果判定：鸡群HI滴度离散度较小时，而HI滴度较高，其保护水平也高【1】。
①HI滴度在4log2的鸡群，保护率约为50%。
②HI滴度在4log2以下的非免疫鸡群，保护率约为10%；免疫鸡群约为40%。
③HI滴度在6log2～10log2的鸡群，保护率达90%～100%。
④若鸡群有10%左右鸡出现11log2或以上的HI滴度，说明鸡群已经发生新城疫强毒的感染。
母源抗体对ND免疫应答的影响：【2】
①雏鸡在3日龄时抗体滴度最高，以后逐渐下降，每天大约下降13%。
因此，多数人主张在母源抗体消失之前的7日龄时做第一次免疫，在30～35日龄时做第二次接种。
但是，在ND流行的地区这样做是不安全的，因为母源抗体不足以抵抗强毒饲喂感染，所以有人主张对带有母源抗体的1日龄雏鸡采灭活苗免疫（据称灭活苗受循环抗体的影响较小），或者灭活苗和活苗同时接种（据称活苗能促进对灭活疫苗的免疫反应）。
不过，这是一种完全依赖疫苗的做法，在=大规模饲养的条件下不可取。
②有条件的鸡场根据对HI抗体免疫监测结果来确定初次免疫和再次免疫的时间，这是最科学的方法。
对鸡群抽样采血作HI试验，如果HI效价高于25时，进行首次免疫，几乎不产生免疫应答，可以选在23时接种。
【1】郑明球.家畜传染病学实验指导【M】.3版.北京：中国农业出版社，2009：111.
【2】陈溥言.兽医传染病学【M】.5版.北京：中国农业出版社，2007：351.。