转基因番茄口服疫苗的研究进展

中国医药生物技术 2010年2月第5卷第1期 Chin Med Biotechnol, February 2010, Vol. 5, No. 1 57 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.01.013 ·综述· 转基因番茄口服疫苗的研究进展

郑卿，郭书巧，葛才林，倪万潮 第 1 例转基因烟草表达链球菌变异株 SpaA（surface protein antigen A）蛋白疫苗的成功研制[1]，开启了利用植物表达动物病原抗原蛋白的新纪元。1992 年，Mason 等[2]提出了“转基因植物疫苗”的概念，标志着植物口服疫苗成为新药研发新途径的全面展开。 口服转基因植物疫苗不仅能诱导机体产生全身性的体液免疫和细胞免疫应答，还能同时激活黏膜免疫。口服疫苗到达肠内黏膜诱导部位之前经过胃内的不利环境时必须受到保护，否则有可能被降解而失去免疫原性。而植物细胞壁作为天然的生物胶囊，可保护细胞内的疫苗免受消化道酸性环境和各种酶的降解，使表达的疫苗在小肠内缓慢释放，被小肠上皮的 M 细胞（membrane cell）识别并转运，APC（antigen presenting cell）细胞加工递呈，使机体产生黏膜和全身性的免疫反应，发挥对机体的全面保护作用[3]。因此，利用植物作为抗原表达和递送的载体已经成为当今生物 技术研究的热点，并取得了长足的发展。但是食物的加工 对目标蛋白有一定的破坏，并可能影响其免疫原性。番茄（Lycopersicon esculentum）作为具备良好加工特性的蔬菜，具有全世界的普及性，其口感好，营养丰富，是植物口服疫苗的理想载体。因此，番茄作为生物反应器来生产可食性疫苗具有较好应用前景。 1 番茄口服疫苗的优点 番茄作为外源蛋白的表达系统，除具有植物所共有的优点外还具有以下鲜明的特点： ⑴番茄是全球广泛栽培的一种植物，不易受地域条件的限制，因此有利于进行规模化生产，降低生产成本。 ⑵番茄作为一种茄科植物的模式植物，在遗传学和分子生物学方面有着较为深入的研究，许多成熟的技术可以直接应用于番茄的研究中，这为番茄作为生物反应器技术平台的建立创造了有利条件。 ⑶表达外源蛋白的转基因番茄果实可以直接食用，在预防或治疗疾病的同时也可以增加营养。还可以将果实制成粉末，进行有效以及长时间的储存，这样在植物疫苗和其他药用蛋白用于疾病的预防或治疗时，不需要经过繁杂的分离以及纯化步骤，不仅降低了成本和患者的负担，而且使患者能够从情感上易于接受。 2 番茄口服疫苗的研究进展 利用转基因技术，番茄可被用于生产在医学上有重要应用价值的酶或蛋白质。目前研究人员已经利用番茄作为生物反应器，在生产药用蛋白、抗体、口服疫苗以及其他工业用品方面做了广泛的尝试，多种外源基因已经成功转入番茄，并表达出有效的蛋白质，小鼠实验[4-8]证明，这些转基因番茄表达的蛋白可以引起有效的免疫反应，取得了可喜的成果，研究较多的番茄口服疫苗主要有以下几种：乙肝病毒疫苗、口蹄疫病毒疫苗、霍乱弧菌疫苗、狂犬病病毒疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗等。 2.1 乙肝病毒转基因番茄口服疫苗 乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）是引发严重慢性肝炎的病原，目前乙肝病毒疫苗的获得是利用酵母细胞通过发酵途径产生的，属于生物技术产物下的亚单位疫苗。HBV 在肝 DNA 病毒家族中属于双链 DNA 病毒。HBV 基因组包括四个基因：pol、env、precore 和 X，分别编码病毒的 DNA 聚合酶、外壳蛋白、前核心区蛋白和 X 蛋白。乙肝病毒表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）的主要成分蛋白即是由 env 基因编码的 S 蛋白。由于 HBsAg 颗粒可以使人体产生专一的抗体，能对病毒的感染起预防作用[9]，

因此科学家在进行疫苗研制时都将编码乙肝病毒表面抗原的基因作为研究的重点。 Shchelkunov 等[4]将表达人免疫缺陷病毒（human

immunodeficiency virus，HIV）的表位 ENV、GAG 和编码 HBsAg 的基因融合，以 CaMV35S 为启动子构建载体，获得转基因番茄。用表达融合蛋白的转基因番茄果实干粉每 2 周饲喂一次小鼠，每 7 d 取一次全血检测，结果表明，小鼠对两种病毒均产生免疫反应，说明融合基因可以足量地表达引起免疫反应的抗原。Lou 等[10]为了使乙肝病毒表面

抗原能在转基因番茄中更好地表达，将烟草致病相关蛋白（tobacco pathogenesis-related protein S）PR-S 信号肽融合到改良目的基因的 5’ 端，同时将表达氨基酸序列 SEKDEL 的基因融合到 3’ 端，利用果实特异性表达的启动子 2A11，使 HBsAg 大蛋白基因在转基因番茄的果实中特异表达。目的蛋白的最高表达水平占转基因番茄果实可溶蛋白总数 的 0.02%，并且在成熟果实中的表达量是其他组织的 65 ~ 171 倍。用免疫金标记方法检测到重组 HBsAg 大蛋白在内质网附近累积，并且证明所捕获的 HBsAg 大蛋白微粒仍旧可以保持与人血清中获得的 HBsAg 具有相同的物理性质，

基金项目：国家转基因专项（2008ZX08005-001） 作者单位：225009 扬州大学生物技术学院（郑卿、葛才林）；210014 南京，江苏省农业科学院生物技术所（郑卿、郭书巧、倪万潮） 通讯作者：倪万潮，Email：niwc@yahoo.cn；葛才林，Email：gecailin10@ 163.com 收稿日期：2009-09-14 58 中国医药生物技术 2010年2月第5卷第1期 Chin Med Biotechnol, February 2010, Vol. 5, No. 1 且具有很高的免疫原性，据称这是首次在植物中表达了 HBsAg 大蛋白。近来，He 等[11]在构建工程载体时采用 E8

启动子，在番茄中表达了乙肝病毒表面抗原（HBV S2 + S/HBsAgM），E8 启动子使得抗原仅在成熟的番茄果实中 表达。 何乃彦等[12]将 HBsAg/截短型丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）核心蛋白融合基因重组到植物表达载体 pBin438 的强组成型启动子 CaMV35S 及增强子下游，构建表达载体 pBin438BE，并转化番茄。从转基因番茄植株中提取总蛋白，经 Dot blot 实验证明 HBsAg/截短型 HCV 核心蛋白的融合蛋白在转基因番茄中得到了表达。王逸群和李田[13]将 HBsAg 基因导入番茄，成功获得了转基因阳性植株。果洪宇等[14]也成功将 HBV S/HEV ORF2 融合基因转入番茄，并获得转基因阳性植株。 2.2 口蹄疫病毒转基因番茄口服疫苗 口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）属于小 RNA 病毒科口蹄疫病毒属，FMDV 基因组的中部是一个大的开放阅读框，编码一多聚蛋白，开放阅读框由 L 基因、 P1 结构蛋白基因、P2 和 P3 非结构蛋白基因以及起始密码子和终止密码子组成。多聚蛋白经过初级裂解形成 L-P1-2A、2BC 和 P3 三种前体蛋白，16 个氨基酸的多肽 2A 催化 P1-2A 从 2BC 连接处顺式切割；次级裂解由 3C 蛋白酶完成[15-16]，P1-2A 被 3C 蛋白酶催化加工成 VP0、VP3 和 VP1，这 3 种蛋白相互联系并能够自我组装成二十面体的核衣壳，在病毒粒子最后形成阶段 VP0 经成熟裂解为 VP2 和 VP4，病毒 RNA 组装进入 75S 的空衣壳形成完整的病毒粒子[17-18]。 潘丽等[5]构建了 O 型口蹄疫病毒 China99 株结构蛋白 P1-2A、非结构蛋白 3C 以及部分 2B 基因（P1-2X3C）的植物双元表达载体 pBin438/P1-2X3C，通过农杆菌介导 法转化番茄，经过 ELISA 和 Western blot 检测表明转基 因植株中表达的目的蛋白具有抗原性。转化植株叶片蛋 白粗提液经肌肉注射免疫豚鼠，于第 3 次免疫后 28 d 用 100 ID50/0.2 ml 的同源强毒攻击，结果表明口蹄疫病毒 P1-2X3C 基因的转基因番茄表达产物具有良好的抗原性，豚鼠经 3 次免疫后血清效价可达 1:64 ~ 1:128，攻毒后两组免疫豚鼠保护率分别达 60% 和 100%。Chen 等[8]在番茄中成功表达了 VP1 蛋白，在给 VP1 加了内质网滞留信号序列后，使得蛋白在番茄鲜果实中的表达量增加到 27 μg/g，随后用表达 VP1 蛋白的番茄果实喂养小鼠，小鼠产生了 EV71 特异性的抗血清和免疫球蛋白，并且发现小鼠的抗血清明显抑制了 EV71 病毒对横纹肌肉瘤细胞的感染。 2.3 霍乱毒素 B 亚单位转基因番茄口服疫苗 霍乱弧菌（Vibrio cholerae）分泌的霍乱毒素（cholera toxin，CT）可引起动物和人类重度脱水性腹泻。CT 由 A 亚单位（CT-A）和 5 个 B 亚单位（CT-B）组成，其中 CT-B 可以与靶细胞表面的神经节苷脂（GM1）受体结合，CT-A 则决定毒素的性质。CT-B 的五聚物能在不同物种的植物中生 产。霍乱弧菌的毒素共调菌毛（toxin co-regulated pilus，Tcp）是其主要黏附素之一，也是一种保护性抗原。辅助定居因子（accessory colonization factor，acf）基因簇包括 B、C、A、D 四个基因，编码的四种蛋白与 Tcp 和 CT 的形成以及霍乱弧菌的黏附定植相关[19]。 彭志强等[20]以 Ca35S 为启动子，构建了表达 CT-B 基因的载体，转入番茄，获得了转基因番茄植株，且转基因植株能够有效表达 CT-B 多肽，多肽表达量占番茄叶片可溶性蛋白的 0.055%。之后，这一研究小组又利用番茄果实特异性启动子—— E8 启动子，将 CT-B 转入番茄植株，并使其在果实中特异表达，然后对试验小鼠进行口服免疫， 研究转基因番茄果实的免疫原性。结果表明，CT-B 基因在 14 株番茄植株基因组中被整合，并在其中 2 株的番茄果实中有特异性表达，最高表达量分别为 455 和 385 ng·g-1 FW

（鲜重），口服免疫后的小鼠血液和肠道黏膜中均检测到抗 CT-B 抗体。表明获得了在番茄果实中特异、高效表达霍乱肠毒素 B 亚单位基因（CT-B）的植物口服疫苗候选植株[21]。Jiang 等[6]也利用 E8 启动子驱动 CT-B 基因，转化番茄，