高效表达可溶性重组蛋白表达载体_pHisSUMO

3
　讨论
构建真核表达载体首先要根据其用途和基本策略进行严
密的实验设计,如果将目的片段和载体质粒分别双酶切后进
行连接,会因酶切效果不理想导致缺失。因此本研究采取
T

载体克隆的方法将目的片段连入PMD-19T载体中,然后从
PMD-19T
重组载体上酶切下目的片段再与同样经酶切处理
的PcDNA3载体进行连接,这样就保证了重组质粒
PcDNA3-

hLYZ构建的成功和准确,为研究hLYZ
基因的真核表达奠定了
基础[6]。
对上述阳性克隆进行DNA测序,结果表明扩增的5’和3’
调控区与已发表的序列的同源性较高。该调控序列在牛、人
和鼠的相应区域进行比较同源性均为97%～100%,说明该调
控序列在人、牛和小白鼠上具有较高的保守性[7]。
对于构建特异表达载体来说,5’和3’UTR的特异启动子
和调控系列尤为重要。许多研究证实其酪蛋白基因5’端和3’
端UTR及启动子是乳腺特异表达的关键调控原件。另外,乳
蛋白基因UTR是构建乳腺生物反应器表达载体的核心生物元
件[8]。目前已经用于转基因动物乳腺生物反应器的调控元件
主要有
:

β-乳球蛋白基因、aS1和β

-
酪蛋白调控序列、乳清酸

蛋白基因调控序列和乳清白蛋白基因调控序列[9]。近二十年
的研究证明,以β-乳球蛋白和β-酪蛋白基因调控序列构建
的乳腺生物反应器表达载体在绵羊、山羊和奶牛上获得高水
平表达,而乳清酸蛋白基因调控序列指导的蛋白则在兔和猪
等动物上有较高水平的表达,但各有优缺点[3]。国外研究报
道表明酪蛋白是在乳腺的特异表达的蛋白质,是乳腺的主要

蛋白[10]。pC-hLYZ载体的成功建立为研究酪蛋白基因5’端
和3’端的调控序列的调控机理和调控特性提供了一个平台
;

并用上述牛乳腺特异表达载体表达药用蛋白,建立具有产业
开发价值的牛乳腺高效表达技术体系和进一步制作转基因动
物奠定了基础。
参考文献
:

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2
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高效表达可溶性重组蛋白表达载体———
pHisSUMO

李璐
1,尹成凯2,李德山2
3
(1.东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,黑龙江哈尔滨150030;2.东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030)
摘要:目的:构建含有IL-1基因的原核表达质粒,并对其原核表达情况进行检测,验证pHisSUMO表达载体的高效可溶性表
达。方法:以质粒pMD18-T-IL-1为模板,利用PCR获得IL-1基因克隆并将其与表达载体pET、pTYB、pHisSUMO连接,重组质
粒经鉴定后转化到大肠杆菌DH5α中,并检测其蛋白表达情况。结果:仅在pHisSUMO表达系统获得了IL-1融合蛋白的高效可
溶性表达。利用Ni-NTA纯化后的融合蛋白经SUMO蛋白酶Ⅰ切割,获得了纯度较高的成熟蛋白且不残留任何氨基酸残基。结
论:实验证明pHisSUMO表达系统有助于增加外源蛋白可溶性和表达量。
关键词:pHisSUMO;高效表达载体;SUMO蛋白酶
中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号
:1004-311X(2009)03-0011-04

AnExpressionVectorforEfficientExpressionofSolubleRecombinant

Proteins———pHisSUMO
LILu1,YINCheng-kai2,LIDe-shan
2
3
(
1.LifeScienceandBiotechniqueResearchCenter,NortheastAgricuturalUniversity,Harbin150030,China;

2.CollegeofLifeScience,NortheastAgricuturalUniversity,Harbin150030,China
)
Abstract:Objective:ToconstructtheprokaryoticexpressionplasmidincludedIL-1geneanddetecttheresultofexpression,toverifypHisSUMO
forefficientexpressionofsolublerecombinantproteins.Method:PlasmidpMD18-T-IL-1wastakenasthetemplatefirstly,IL-1genewas
clonedbyPCRandconnectedtotheexpressionvectorpET,pTYBandpHisSUMO,thentherecombinantplasmidwasidentifiedandtransformed
intoE.coliDH5αcompetencecell,andtheexpressedproteinwouldbedetected.Result:Highyieldofthefusionproteinwasonlyacquiredin
pHisSUMOexpressionsysteminsolubleform.ThehumanIL-1withhighpuritywasharvestedwithoutanyadditionalaminoacidresidue,afterNi
-affinitychromatographypurificationandcleavagebySUMOproteaseⅠ.Conclusion:ThedatashowthatpHisSUMOexpressionsystemishelp
2
fultoenhancethesolubilityandyieldofinterestedproteins.
Keywords:pHisSUMO;highefficientexpressivevector;SUMOprotease

收稿日期:2008-11-07;修回日期
:2009-03-20

基金项目:黑龙江省科技攻关重点项目资助
(GB06C315)
作者简介:李璐(1975-),女,硕士,实验师,研究方向:生物制药学;3
通讯作者:李德山(1950-),男,博士生导师,教授,从事生物制药学研
究,Email:deshanli@163.com。

目前,重组蛋白的表达主要是利用大肠杆菌,其具有使用安全、操作简便、周期短且不存在病毒致癌基因污染等优点,是重组蛋白药物研究和生产中使用最广泛的表达系统[1,2]。重组蛋白表达关键的问题是选用合适的表达载体,现已建立的大肠杆菌表达系统有融合表达、非融合表达、分泌表达、带
纯化标签的表达载体等,而融合表达载体又有pET系列、
pTYB、pGEM及pGEX等。表达载体的类型虽多,
但选择合适
的、满足人们需求的表达载体却很难,如pET系列载体虽然应
用较广泛,但对有些蛋白的表达却不是很理想。而其它一些
融合蛋白表达系统蛋白表达量虽然很高,但多数表达的目的
蛋白可溶性较差。这就要求我们去寻找更多的高效稳定、可
溶性较好的表达系统以满足不同类型基因的表达。
我们在表达IL-1的过程中,发现在大肠杆菌中难以获得
高效稳定的可溶性表达,其原因可能在于该蛋白在大肠杆菌

11
2009年19(3
)

生　物　技　术
中较易被蛋白酶降解。我们试验过很多表达载体表达效果均
不理想,如pET系列表达载体、pTYB-11等表达系统对以上蛋
白的表达量极低或者几乎不表达,pGEX6p-1虽然表达量较
高,但可溶性目的蛋白所占比例较小。
SUMO(smallubiquitin-likemodifier-1
)
是一种小分子泛素

样修饰蛋白
[3,4]
,广泛存在于各种真核细胞中,
参与调节细胞

凋亡、信号转导、RNA转录、蛋白的核质运输以及细胞周期等
多种生理进程[5]。近年来,SUMO被发现可以作为重组蛋白表
达的融合标签和分子伴侣,具有抗蛋白酶水解、显著增加重组
蛋白表达量以及促进靶蛋白正确折叠,提高可溶性等功
能[6-8]。小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)和泛素(Ub)在一级结
构上只有18%的同源性,然而,两者的三级结构及其生物学功
能却十分相似
[9]
,
研究表明其作为重组蛋白的融合标签可以

增加蛋白的稳定性。现本文以IL-1为例,试验pHisSUMO蛋
白融合表达系统的应用。
1
　材料和方法
1.1
　材料
1.1.1　实验材料:质粒和受体菌:质粒pMD18-T-His-IL-1
(pMD18-T为TaKaRa公司的T载体);pHisSUMO(
购于lifeSen2

sors公司)、pET-30a(+)、PTYB-11载体由本实验室提供;
受
体菌E.coliDH5α、Rosetta(含DE3)由本实验室提供。
克隆pET30a(+)-IL-1引物
:

P1上游:5’GGGGAATTCATGGCACCTGTACGA3’EcoRⅠ;
P2下游:5’CCCGTCGACTTAGGAAGACACAAA3
’SalⅠ。
克隆pTYB11-IL-1引物
:

P3上游:5’AACAGAAGAGCACCTGTACGATCACTGAAC3
’
Sap
Ⅰ
;

P4下游:5’ACGCGTCGACTTCCACATTCAGCACA3
’SalⅠ。
克隆pHisSUMO-IL-1引物
:

P5上游:5’GGTCTCAAGGTGCACCTGTACGATCACT3’BsaⅠ;
P6下游:5’CGGGATCCGTACAGCTCTCTTTA3’BamH
Ⅰ。
1.1.2
　试剂
BsaⅠ、BamHⅠ、SapⅠ、SalⅠ、Eco
RⅠ购自NewEngland
BioLabs公司;pMD18-T、dNTPs、其它限制性内切酶、T4DNA
连
接酶购自TaKaRa公司,SUMO蛋白酶Ⅰ购自LifeSensors公司。
IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷),溶菌酶,
卡那霉素购自
TaKaRa公司。DNA回收试剂盒,
购自上海华舜生物工程有限
公司。Ni-NTA琼脂糖颗粒购自QIAGEN公司。
1.1.3
　仪器
Milli-QⅡ型纯水仪(美国密理博公司)、-70
℃超低温冰
箱(日本三洋公司)、
Avanti

TM

30
型高速冷冻离心机(美国贝克

曼公司)、DU640紫外分光光度计(美国贝克曼公司)、
PTC-200

梯度PCR仪(美国伯乐公司)、
Champgel

TM

5000
凝胶成像系统

(美国阿尔法公司)、MA120型垂直板电泳系统(
美国伯乐公

司)、LaboAutoclave高压灭菌锅(日本三洋公司)、721分光光度
计(中国上海第三分析仪器厂)、-20℃冷冻冰柜和4℃冷藏冰
箱(中国海尔)。
1.2
　方法
1.2.1
　融合蛋白表达载体的构建
1.2.1.1　pET-30a(+
)
表达质粒的构建

以质粒pMD18-T-IL-1为模板,以P1、P2为引物,用
rTaq酶进行PCR扩增。扩增产物分别用SalⅠ和EcoR
Ⅰ双酶
切,回收酶切片段;将pET-30a(+)表达载体用SalⅠ和
EcoR

Ⅰ双酶切,回收酶切载体片段,将酶切回收后的IL-1PCR产物与pET-30a(+)表达载体的回收产物利用T4连接酶进行连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,提取重组质粒,SalⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定阳性克隆。1.2.1.2　pTYB-11表达质粒的构建以质粒pMD18-T-IL-1为模板,以P3、P4为引物,用rTaq酶进行PCR扩增。扩增产物分别用SapⅠ和SalⅠ双酶切,回收酶切片段;将pTYB-11表达载体用SapI和SalⅠ双酶切,回收酶切载体片段,将酶切回收后的IL-1PCR产物与pTYB-11表达载体的回收产物利用T4连接酶进行连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,提取重组质粒,SapⅠ和SalⅠ双酶切鉴定阳性克隆。1.2.1.3　pHisSUMO表达质粒的构建以质粒pMD18-T-IL-1为模板,以P5、P6为引物,用rTaq酶进行PCR扩增。扩增产物分别用BsaⅠ和BamHⅠ双酶切,回收酶切片段;将pHisSUMO表达载体用BsaⅠ和BamHⅠ双酶切,回收酶切载体片段,将酶切回收后的IL-1PCR产物与pHisSUMO表达载体的回收产物利用T4连接酶进行连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,提取重组质粒,XbaⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定阳性克隆。阳性克隆测序,具体测序方法见CEQ8000操作流程。1.2.2　目的基因在大肠杆菌中的表达及融合蛋白的纯化将含有正确序列的重组质粒pET-30a(+)-IL-1、pTYB-11-IL-1、pHisSUMO-IL-1转化至表达菌株Rosetta。转化后的单菌落分别接种至5mLLB培养基中,37℃培养10h,以1:100接种于500mL含卡那霉素(50mgΠmL)的LB培养基中,37℃培养2h,A600=0.3～0.6时,加入IPTG至终浓度为0.5mmolΠL进行诱导,诱导3h后分别取少量菌体及未诱导的对照样品进行12%SDS-PAGE[11]电泳。收获pHisSUMO-IL-1转化至表达的菌体进行超声破碎后离心[11],分别取上清和沉淀进行12%SDS-PAGE电泳分析。加入IPTG至终浓度为0.5mmolΠL进行诱导1h、2h、3h、4h、5h,摸索最佳诱导时间,分别加入IPTG至终浓度为0.1mmolΠL、0.2mmolΠL、013mmolΠL、0.4mmolΠL、0.5mmolΠL诱导3h进行浓度梯度诱导,摸索最佳诱导浓度。菌体经超声破碎后离心,上清经Ni-NTA柱亲和层析,用杂蛋白洗脱液(30mmolΠL咪唑,300mmolΠLNaCl,50mmolΠLNaH2PO4,pH8.0)洗去杂蛋白后,用洗脱液(250mmolΠL咪唑,300mmolΠLNaCl,50mmolΠLNaH2PO4,pH8.0)洗脱融合蛋白,收集洗脱的第一、二峰。取融合蛋白5μl进行SDS-PAGE电泳分析。1.2.3　融合蛋白的切割将方法1.2.2收集的pHisSUMO-IL-1融合蛋白(浓度为1mgΠml)经PBS透析24h后,以每10μg融合蛋白:1USUMO蛋白酶Ⅰ的比例加入SUMO蛋白酶Ⅰ,DTT终浓度为2mmolΠL,4℃切割过夜,并取样进行15%SDS-PAGE检测。1.2.4　成熟蛋白的纯化切割后产物经PBS缓冲液透析以除去切割液,再经Ni-NTA颗粒亲和层析,收集惟一的洗脱峰,即为IL-1成熟目的蛋白,用洗脱液(250mmolΠL咪唑,300mmolΠLNaCl,50mmolΠLNaH2PO4,pH8.0)洗脱Ni-NTA颗粒结合的小泛素相关修饰物蛋白,15%SDS-PAGE电泳检测。2　结果与分析2.1　pMD18-T-IL-1插入片段克隆以质粒pMD18-T-IL-1为模板,以P1、P2为引物进行PCR扩增后,产物大小为450bp左右与预期产物大小相符(如图1)。测序结果(略)与Genebank发表序列一致459bp。2.2　融合蛋白表达载体的构建将胶回收的IL-1基因序列与线性化的pET-30a(+)表
达载体、pTYB-11表达载体、pHisSUMO表达载体连接。重组
表达载体pHisSUMO-IL-1经XbaⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定
后,获得产物为450bp左右的条带,重组表达载体
pTYB-11-

IL-1经SapⅠ和SalⅠ双酶切鉴定得到450bp左右的条带,
重
组表达载体pET30a(+)-IL-1经SalⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴

21
生　物　技　术 2009年
19(3

)