共表达猪瘟病毒E0、E2基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性.
表达猪瘟病毒E0E2基因重组腺病毒疫苗在小鼠体内的存留时间分析
动物医学进展，２０１９，４０（３）：４９－５３Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ表达猪瘟病毒Ｅ０－Ｅ２基因重组腺病毒疫苗在小鼠体内的存留时间分析 收稿日期：２０１８－０３－２０ 基金项目：国家自然科学基金项目（３１５６０７０４）；动物基因工程疫苗国家重点实验室经费资助 作者简介：熊贝嘉（１９９３－），女，四川成都人，硕士研究生，主要从事分子生物学研究。
＊通讯作者熊贝嘉１，２，张 会３，孙永科１，范根成２，张 恒２＊，杨玉艾１＊（１．云南农业大学动物医学院，云南昆明６５０２０１；２．青岛易邦生物工程有限公司／动物基因工程疫苗国家重点实验室，山东青岛２６６１１４；３．山东莱钢绿建国际建筑工程有限公司，山东青岛２６６５５５） 摘 要：研究Ｅ０－Ｅ２基因和表达蛋白及抗体水平在小鼠体内的最长存留时间，以确定表达猪瘟病毒Ｅ０－Ｅ２基因重组腺病毒疫苗（ｒＡｄ－Ｅ０－Ｅ２）在小鼠体内的存留规律。
本试验选用３０只ＳＰＦ级别的健康小鼠，随机分为Ａ、Ｂ组，各免疫组以１×１０６ ＩＦＵ／只剂量接种ｒＡｄ－Ｅ０－Ｅ２，对照组注射生理盐水。
Ａ组２０只于接种后不同特定时间（２只／次）采集血液和组织进行ＰＣＲ和ＩＦＡ检测Ｅ０－Ｅ２基因及表达蛋白残留情况；Ｂ组１０只于接种后１、３、５、７、１０、１４、２１、２８ｄ采集血清检测猪瘟抗体水平。
ＰＣＲ和ＩＦＡ检测显示，在接种１２、２４、３６ｈ后肝、脾、肾组织和血清中Ｅ０－Ｅ２基因和蛋白检出率为１００％，接种４８ｈ后小鼠肝、脾组织检出率为５０％，肾组织和血清检出率为１００％。
接种７２ｈ以后，小鼠血液和组织检测均为阴性。
接种后７ｄ试验组体内抗体阳性率为４０％，接种后１０ｄ小鼠体内抗体阳性率为１００％，抗体阻断率在４３％～５１．２％，接种后２８ｄ，猪瘟抗体阳性率为１００％，抗体阻断率在７５．６％～８７．５％。
表明ｒＡｄ－Ｅ０－Ｅ２在小鼠体内的存留时间最长７２ｈ，接种时间与Ｅ２抗体水平呈正相关。
猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒遗传稳定性和免疫剂量研究的开题报告
猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒遗传稳定性和免疫剂量研究的开题报告题目：猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒遗传稳定性和免疫剂量研究研究背景和意义：猪瘟是一种由猪瘟病毒引起的高度传染性和致死性疾病，在养猪业中造成了严重的经济损失。
目前，猪瘟的防控主要是通过疫苗来实现。
然而，传统的猪瘟疫苗存在许多不足，比如制备周期长、免疫效果不稳定等问题。
因此，寻找一种新型的猪瘟疫苗具有重要意义。
鸡痘病毒是一种非致病的鸡致病毒，经过基因重组可以用于制备免疫性良好、安全性高的疫苗。
研究表明，将猪瘟病毒E0-E2基因重组到鸡痘病毒中，可以获得一种具有很好免疫效果的疫苗。
目前还缺乏对于猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性和免疫剂量的研究，对于该疫苗的进一步应用和推广都具有重要意义。
因此，本文旨在通过实验探究猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒在不同免疫剂量下的免疫效果和其遗传稳定性，为该疫苗的研发和应用提供有力的实验依据。
研究内容和方法：1.构建猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒采用分子克隆技术构建猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒，并通过PCR、Western blot等技术验证其准确性和表达情况。
2.评价重组病毒在体内的免疫效果选用小鼠模型，分别给予不同剂量的猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒接种，观察其免疫效果，包括血清中特异性抗体水平和小鼠免疫保护率等指标。
3.检测重组病毒的稳定性收集体内或者体外繁殖的病毒，通过PCR和测序技术检测其遗传变异和稳定性。
预期成果和意义：本研究可以评估猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒在小鼠免疫中的免疫保护效果和免疫剂量，并对其在体内的遗传稳定性进行研究。
预期可以为该疫苗的研发提供有力的实验依据，为其在养猪业中的应用和推广提供技术基础。
同时，探讨基因重组技术在病毒病疫苗研发中的应用，对于推动病毒疫苗研究和应用具有重要意义。
表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性
表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性张体银;孙蕾;刘武杰;刘秀梵【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2006(28)4【摘要】本实验为了评价表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒(rFPV282E4-SF,rFPVLp-SF)的遗传稳定性,将其在鸡胚成纤维细胞连续培养20代.通过蓝斑来鉴定重组鸡痘病毒纯度,结果所有蚀斑100%变蓝.通过对第0、10和20代F基因扩增并进行序列测定,所有碱基和氨基酸序列均和原始转移载体序列完全一致,没有发生任何改变.随后又通过间接免疫荧光证实rFPV282E4-FS和rFPVLP-FS各个代次F基因的特异表达.所有结果均显示了上述重组鸡痘病毒具有良好的遗传稳定性,满足兽医生物制品的遗传稳定性要求.【总页数】3页(P405-407)【作者】张体银;孙蕾;刘武杰;刘秀梵【作者单位】扬州大学,农业部畜禽传染病学重点开放实验室,江苏,扬州,225009;扬州大学,农业部畜禽传染病学重点开放实验室,江苏,扬州,225009;扬州大学,农业部畜禽传染病学重点开放实验室,江苏,扬州,225009;扬州大学,农业部畜禽传染病学重点开放实验室,江苏,扬州,225009【正文语种】中文【中图分类】S858.31;Q784【相关文献】1.共表达新城疫病毒F基因和H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒 [J], 韦栋平;刘玉良;邵卫星;卢建红;刘秀梵2.表达新城疫病毒F HN基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性和免疫效力试验 [J], 丁炜东;曹丽萍;张体银;刘秀梵;张如宽;吴艳涛3.表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒疫苗免疫持续期试验 [J], 智海东;王云峰;孙永科;杨玉艾;王玫;童光志4.表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒rFPV-ILTVgB的理化特性及遗传稳定性研究 [J], 李诗;他蕾;许霄;秦涛;陈素娟;彭大新5.表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒的筛选 [J], 张体银;孙蕾;梁萍;刘秀梵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪瘟病毒E2基因部分片段的克隆和原核表达及其抗体制备的开题报告
猪瘟病毒E2基因部分片段的克隆和原核表达及其抗
体制备的开题报告
一、研究背景和意义
猪瘟是一种由猪瘟病毒引起的高度传染性疾病，引起了猪业的严重经济损失。
目前，猪瘟疫苗的生产和开发已成为研究的重点。
猪瘟病毒E2蛋白是猪瘟病毒表面的一种糖蛋白，是病毒定位、识别和抗原性的主要组成部分。
因此，研究病毒的E2蛋白有助于探索猪瘟病毒的抗原性能和抗体的制备，为疫苗的开发提供基础。
二、研究目的
本研究的主要目的是克隆猪瘟病毒E2基因部分片段、进行原核表达和制备抗体，并通过酶联免疫吸附实验评估其抗原性能。
三、研究方案和方法
1.病毒RNA提取和E2基因片段克隆：
从野猪肝脏中提取猪瘟病毒RNA，并用RT-PCR扩增出猪瘟病毒E2基因部分片段。
将PCR产物与载体进行连接、转化到大肠杆菌中获得重组质粒。
2.重组质粒筛选和E2蛋白的原核表达：
对重组质粒进行筛选、测序和酶切，确定其正确性。
将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，诱导表达，并通过SDS-PAGE进行鉴定。
3.病毒抗体的制备：
将表达的E2蛋白提取、纯化，并制备多肽抗体。
通过Western blot 和ELISA等方式，鉴定和评估其抗体效价和抗原性能。
四、研究预期结果
本研究预计获得猪瘟病毒E2基因片段的重组质粒并进行原核表达，得到表达的E2蛋白及其多肽抗体。
通过酶联免疫吸附实验等技术，评估抗体的特异性和亲和力，为研究猪瘟病毒抗原性和疫苗研发提供一定的基础。
共表达新城疫病毒融合蛋白基因和h9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力
扬州大学博士学位论文共表达新城疫病毒融合蛋白基因和H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力姓名：***申请学位级别：博士专业：预防兽医学指导教师：***20040501韦栋平：共表达ＮＤＶＦ基因和鹏亚型ＡＩＶＨＡ基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力共表达新城疫病毒融合蛋白基因和Ｈ９亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力博士研究生：韦栋平导师：刘秀梵教授摘要新城疫是由副粘病毒科的新城疫病毒（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａｅｖｉｒｕｓ．ＮＤＶ）引起的一种烈性家禽传染病，它对我国养禽业的危害最为严重。
低致病性Ｈ９亚型禽流感病毒（ＡｖｉａｎＩｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ，ＡＩＶ）是目前影响我国养禽业的主要ＡＩＶ亚型，它对我国养禽业也已造成了严重的经济损失。
当前我国对ＮＤ和Ｈ９皿型ＡＩ的控制主要应用常规疫苗的免疫接种。
但是作为我国目前控制ＮＤ和Ｈ９亚型ＡＩ流行的重要手段，常规疫苗的免疫接种会干扰现有技术条件下的免疫监测和流行病学调查。
而且油乳剂灭活疫苗使用后会引起严重应激，并且生产成本偏高等。
为了研制一种可以克服上述缺点的新型载体联合疫苗，本研究用鸡痘病毒（Ｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓ，ＦＰＶ）作为表达载体，构建了能够同时表达ＮＤＶ融合蛋白（Ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ，Ｆ）蒸因和Ｈ９亚型ＡＩＶ血凝素（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＨＡ）基因的重组鸡痘病毒，并对其免疫效力进行了评估。
１．共表达ＮＤＶＦ基因和Ｈ９亚型ＡｌＶＨＡ基因的重组鸡痘病毒的构建及其生物学特性鉴定以酚，氯仿提纯ＮＤＶＦ４８Ｅ８株的基因组ＲＮＡ作为反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）模板。
扩增出长度约为１．７Ｋｂ的ＮＤＶＦ基因片段，将其克隆入ｐＧＥＭ—Ｔｅａｓｙ载体，构建重组质粒ｐＧＥＭ．ＴＦ并进行测序确证：以质粒ｐＵＣＨＡ为模板，用ＰＣＲ扩增出约为１．ＴＫｂ的Ｈ９亚型ＡＩＶＨＡ基因片段，将其克隆入ｐＧＥＭ—Ｔｅａｓｙ载体，构建重组质粒ｐＧＥＭ．ＴＨＡ并进行测序确证。
北京部分地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析
（ 京 市兽 医 实验 诊 断 所 ， 京 １０ ０ ） 北 北 ０ １ １
摘 要 ： 了解 北 京地 区猪 瘟病 毒 （ Ｓ Ｖ） 为 Ｃ Ｆ 流行 毒 株 的遗传 变异 情 况 ， 用套 式 Ｒ — Ｃ 采 Ｔ Ｐ Ｒ方 法 ， 对从 北 京部 分地 区近期 分 离的 ７ Ｃ Ｆ 流行毒 株 的 Ｅ 株 ＳＶ ２基 因主要 抗 原编码 区进 行 了扩 增 、 隆与 序 列测 定 ， 克 并应 用 ＤＮＡ Ｓ ａ 分析 软件 对所 测定 的 ７株 毒株 与 国 内外参 考毒 株 的相应 序列 进行 了同源性 分析 及氨 基 酸序 列 ｔｒ 比对 。结果 表 明 ， ７株 Ｃ Ｆ 流行毒 株 之 间核 苷 酸 与氨 基 酸 的 同源 性 分 别 为 ９ ． ～９ ． 和 ９ ． ５ ＳＶ ６３ ９３ ５ ６／ ９ ～
ｉ ０ ， Ｃ Ｆ 石 门毒 株 （ ｈｍｅ ０ 与 Ｓ Ｖ Ｓ ｉ ｎ株 ） 核 苷 酸 与 氨 基 酸 的 同 源性 分 别 为 ８ ． ％ ～ ８ ． 和 ８ ． ～ 的 １７ ３５ ２ ４／ ９ ６ ８ ． ， Ｃ Ｆ 兔化 弱毒株 （ Ｌ ４６ 与 Ｓ Ｖ ＨＣ Ｖ株 ） 的核 苷 酸 与氨 基 酸 的 同源 性 分别 为 ８ ． ～８ ． 和 ７ ． ～ Ｏ６ １７ ８０ ８ ． ， Ｏ ２ ７株 Ｃ Ｆ 流行毒 株 均属 于基 因 ２群 ， ７ ５ ７ ３ ７ ９和 ７ ４位 氨基 酸发 生 置换 。本研 究初 步揭 示 ＳＶ 且 ０ 、１ 、 ２ ３ 了北京 部分 地 区 目前 流行 的 Ｃ Ｆ 毒株 与 Ｓ ｉ ｎ株 和 ＨＣ Ｖ株 在 Ｅ ＳＶ ｈｍｅ Ｌ ２基 因主要 抗原 区上存在 较 大差异 。
动物医学进展2007年1～12期总目次
鲁西黄牛 ａ 干扰素成熟蛋 白基因的克隆及 序列 分析 …………………………………… ………… … 张永红 ， 王长法， 杨少华 ， ２ １ ） 等 （２
３ 株 临 床 分离 菌 的 药敏 试 验 分 析 … … … … … … … … … …… …… … … … … … … …… …… …… … 程 福 亮 ， 文 瑜 ， ３ 韩 雷连 成 ， ２ １ ） 等 （５ 传染性法氏囊病病毒 Ｖ ２基 因在转基因烟草中的初步表达 …………………………………… … 杨龙峰 ， Ｐ 于静娟 ， 陈明勇 ， ２ １ ） 等 （９ 猪瘟病毒 Ｅ 基 因 的克 隆 及 原 核 表 达 … … … … … … … …… … …… … … … … … … …… …… … … … 高华 峰 ， 富 祥 ， 李 张念 祖 ， ２ ２ ） 等 （２
猪 流 感病 毒 Ｒ —Ｃ 快 速检 测 方 法 的建 立 ＴＰ Ｒ … … … …… … … … … … … … … …… … … … … … … … 杨 焕 良 ， 乔传 玲 。 陈 艳 ， １４ ） 等 （２ 鸡 贫 血病 毒 衣 壳 蛋 白 Ｖ １ 因 的克 隆 、 Ｐ 基 原核 表达 和纯 化 … … … … … … … … … …… … … …… … … 吴 艳 红 ， 建龙 ， 丛 丛 。 １ ４ ） 陈 李 等 （６ 新 疆 某 地 牛病 毒 性腹 泻 病 毒 生 物 型 的 鉴 定 … … … … …… … … … … … … … … …… …… …… … … … 郭 燕 ， 新华 ， 王 邓 字 ． １５） 等 （Ｏ 豆 粕 饲料 中转 基 因成 分 的多 重 Ｐ Ｒ 快 速 检测 … … … … …… … … … … … … …… … … … … … … … 于忠 娜 ， 向 阳 ， Ｃ 苗 单 虎 ， １５） 等 （３ 亚 洲 １ 口蹄 疫病 毒 Ｒ 型 Ｓ株非 结 构 蛋 白 Ｐ ３区 基 因特 征 分析 … … …… …… … … … … … … … … … … 信 爱 国 ， 华 春 ， 李 李 乐 ， ２１ 等 （） 猪 瘟 特 异性 转 移 因 子 的制 备 及 免 疫 活 性 鉴 定 … …… … … …… … … … … …… … … … … … … … … … … … 元 永 平 ， 张佩 君 ， 德 坤 ２ ５ 陈 （） Ａ 型 肉 毒毒 素 Ｈｃ 因的 原 核 表 达 、 化 及 单 抗 的 制 备 … … … … …… … … … … … … … … … … … … 李 秀 山 ， 选 明 ， 基 纯 刘 赵李 剑 ， ２８ 等 （）
猪瘟疫苗的“前世今生”
猪瘟疫苗的“前世今生”作者：朱萌来源：《中国动物保健》2019年第01期猪瘟病毒猪瘟病毒（ CSFV）属于黄病毒科，是世界范围内最重要的猪病病毒。
分子特性：单正股RNA，结构蛋白有衣壳蛋白（G）和3种囊膜糖蛋白（EO、E1、E2）。
EO蛋白是唯一分泌到GSFV感染细胞血清中的糖蛋白，在机体内可诱导产生中和抗体;E2则是引起猪产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原，在猪瘟诊断和新型疫苗的研究上都起着重要的作用。
抗原特性：只有一个血清型，但存在血清学变种。
根据病毒膜粒糖蛋白E2基因的序列差异，可将我国猪瘟流行毒株分为2个基因群，目前基因2群在我国占主导地位，与欧洲流行的基因2群毒株遗传关系较近。
猪瘟疫苗我国何时有猪瘟尚不明确，根据1935年调查，我国大部分地区都有猪瘟流行。
最初进行防控所使用的是抗猪瘟血清，用于与猪瘟病毒的共同注射免疫，成都血清厂是当时生产抗猪瘟血清最多的工厂，“血清和血毒共同注射免疫法”在1951年左右被猪瘟结晶紫灭活疫苗替代。
成都血清厂于1986年停止生产。
猪瘟结晶紫疫苗1936年始见于美国，1943年开始全世界推广使用，1949年我国建国初期，按美国畜牧局制定的方法首先在成都血清厂开始生产，1951-1955年全国主要使用此苗进行春秋两季免疫。
灭活疫苗产生免疫力慢，免疫期短，生产成本高，还要繁殖强毒制苗，存在散布病原的危险，1982年中国彻底停止猪瘟结晶紫疫苗的生产。
1946年，国外开始用不同方法将不同的猪瘟毒株适应于家兔，育成对猪治病力减弱的变异毒株，安全性不够理想，未能广泛应用。
1950年，中国兽药监察所方时杰、周泰冲、李继庾和哈尔滨兽医研究所陈凌风等开始相继用四株猪瘟病毒，分别诱发家兔感染，选取免疫原性好的毒株，最终选出了一株适应于家兔的猪瘟变异毒株，对猪无致病力，且能产生坚强的免疫原性，又对孕猪和仔猪均安全的兔化弱毒株，并在1956年开始在全国推广使用。
1957年我国将350代猪瘟兔化弱毒相继赠送给苏联、朝鲜等国应用，自此中国产兔化弱毒苗走上世界舞台，并为他国防治猪瘟疫情，甚至净化猪瘟起到决定性作用。
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共表达猪瘟病毒E0、E2基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性
2010-10-03
[目的]研究共表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组鸡痘病毒rFPV-E0-E2的`遗传稳定性.[方法] 将重组鸡痘病毒rFPV-E0-E2在鸡胚成纤维细胞上连续传20代,取第5、10、15和20代重组病毒进行以下检测:用蓝斑试验鉴定各代重组病毒纯度;用PCR方法扩增猪瘟病毒E0、E2基因,进行基因序列分析;用间接免疫荧光实验检测各代重组病毒中猪瘟病毒E0、E2基因的表达.[结果] 各代次重组病毒产生的蚀斑均为蓝色,表明病毒纯度稳定.从各代重组病毒DNA中均扩增出了约700 bp和1 200 bp的条带,分别与E0和E2基因片段长度一致,基因序列分析发现,第5、10、15代重组鸡痘病毒中的E0、E2基因序列与原始转移载体序列完全一致,第20代重组病毒插入基因有2处发生了点突变 (即E0基因139位A→G,E2基因413位A→G),其编码的氨基酸也发生了相应变化(即E0蛋白47位Thr→Ala,E2蛋白138位Glu→Gly),但蛋白抗原表位未发生明显的变化.间接免疫荧光实验检测到各代重组病毒均能正常表达目的蛋白.[结论] 重组鸡痘病毒rFPV-E0-E2在鸡胚成纤维细胞上传20代以内,具有良好的遗传稳定性,插入的猪瘟病毒E0、E2基因能够正确稳定表达.
作者：张浩郭抗抗张彦明王养会尹宝英孙裴王文秀何雷作者单位：西北农林科技大学,动物医学院,陕西,杨凌,712100 刊名：西北农林科技大学学报(自然科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF NORTHWEST A&F UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2008 36(8) 分类号：S852.65+1 关键词：猪瘟病毒重组鸡痘病毒遗传稳定性。