细胞分离与培养技术共50页
玻璃器皿的清洗包扎,培养基的配制及灭菌(共13张PPT)
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Hale Waihona Puke 分离纯化常用的方法有：（1）简易单细胞挑取法
（2）平板分离法
选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、 温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制
马丁、高氏培养基板于28 ℃倒置培养5d，肉汤 培养基于37 ℃倒置培养28h后观察
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作业：
1.在三种不同的平板上你分离得到哪些类群的微生物？
简述它们的菌落特征。
2 .如何确定平板上某个菌落是否为纯培养？请写出试验 的主要步骤。 3如果一项科学研究内容许从自然界中筛选到能产生 高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？请写出简明的实 验方案。
培养后可观察有无孤立菌落生长，每一孤立菌落即为一纯种细菌。 一般病原菌的菌落数少于杂菌，故在分离培养时，应力求出现较多的 孤立菌落，以提高病原菌检出率。
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5.稀释混合倒平板
肉汤培养基融化备用；1ml无菌吸管加菌悬液于 空皿中；无菌操作将冷却至50℃左右的培养基倒入 上述平板内，旋转混合均匀。 6.恒温培养箱培养
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四.实验内容及方法
1.采集土样，制备土壤悬液：1g土稀释 到10-7；
倒平板→划线→培养→挑单菌落→接种移植→保存
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2.倒平板 : 右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻
轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在 火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿， 使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平 板。 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。
淋巴细胞分层液有两种
淋巴细胞分层液有两种（1）聚蔗糖—泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrose solution）,商品名Ficoll，分子量400 000，多配制成40±1％（W/V）水溶液，也有干粉出售。
应用时，用蒸馏水配制9％溶液。
泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici)，商品名Vrografin，结构式为3，5—二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。
含量为60％或75％，每安瓶为20ml装，常用于人的脏器造影。
应用时，取60％泛影葡胺原液20ml，加双蒸馏水15.38ml，即为33.9％泛影葡胺。
1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制：9％聚蔗糖液24份33.9％泛影葡胺液10份混合即可。
必要时，可测比重。
需要备用，可用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min，4℃保存。
一般可保存3个月。
（2）泛影葡胺—右旋糖酐（dextran）液34％泛影葡胺液10份60％右旋糖酐液12.5份混合，即为比重1.07～1.09的分层液。
分装于棕色瓶中，4℃冰箱保存备用。
一、淋巴细胞分离人淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，根据不同试验有相对纯度，尽最大可能保持细胞应有活性。
分离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。
本文介绍常用的密度梯度离心法的原理及方法。
人外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为 1.074±0.001。
密度梯度离心法的原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。
常用的分层液有Ficoll，Ficoll是一种合成性蔗糖聚合物的商品名，无毒，但高浓度溶液往往不等渗，且粘性高，易使细胞聚集，常使用60g/L低浓度溶液（密度1.020）加入泛影葡胺（Hypague），应用浓度为340g/L（密度1.200），以泛影葡胺适当比例与Ficoll混合，可配制成比重合适的细胞分层液（密度1.077±0.001）。
选择性必修三《生物技术与工程》(含答案解析)
选择性必修三《生物技术与工程》学校:___________姓名：___________班级：___________考号：___________一、判断题1．乳酸菌是厌氧细菌，在无氧的条件下能将葡萄糖分解成乳酸（反应式C6H12O6−−→酶2C3H6O3＋能量），可用于乳制品的发酵、泡菜的腌制等。
（选择性必修3 P5）()2．酵母菌是一类单细胞细菌，是兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵（反应式C6H12O6−−→酶2C2H5OH＋CO2＋能量），可用于酿酒、制作馒头、面包等。
（选择性必修3P6）()3．多种微生物参与了豆腐的发酵，如酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是曲霉。
（选择性必修3P5）()4．泡菜发酵期间，乳酸会不断积累，当它的质量分数为4%～8%时，泡菜的口味、品质最佳。
（选择性必修3P6）()5．醋酸菌在无氧条件下利用乙醇产生乙酸()6．膳食中的亚硝酸盐不会危害人体健康。
()7．葡萄酒酿造过程中需加入红色素，使葡萄酒呈深红色。
()8．只有在糖源充足的情况下才能进行醋酸发酵()9．当人体摄入的亚硝酸盐总量达到0．3～0．5g时，就可以转化为致癌物——亚硝胺()10．将培养基倒入培养皿后，应立即将培养皿倒过来放置。
（选择性必修3P12）() 11．在采用稀释涂布平板法进行微生物的选择培养时，将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽后就可以进行涂布了。
（选择性必修3P17）()12．灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，对操作的空间、操作者的衣着和手要进行灭菌。
（选择性必修3P10）()13．牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。
（选择性必修3P10）()14．刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
()15．尿素在脲酶的催化作用下分解成无机物。
()16．筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。
猪小肠微血管内皮细胞的分离培养与纯化
猪小肠微血管内皮细胞的分离培养与纯化施晓杰;马维超;邓昱晨;邓伟;张倩;冯波;穆祥【摘要】旨在建立简单高效的获取猪小肠微血管内皮细胞(PIMVECs)的方法.将SPF新生仔猪麻醉处死后取空肠,经酶消化后用免疫磁珠分选获得纯化的PIMVECs,并对纯化后的细胞进行免疫荧光鉴定,采用WST-1法分析传代PIMVECs的增殖情况.分离纯化的PIMVECs呈短梭形或多角形,单层贴壁生长,汇合后呈铺路石样,血管内皮细胞特异性标志物VIII因子相关抗原表达阳性,且复苏后传代细胞增殖情况良好.采用免疫磁珠分选法可以快速直接获得纯化的猪小肠微血管内皮细胞,且细胞活性良好.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2019(055)001【总页数】5页(P36-38,43,封4)【关键词】微血管内皮细胞;猪小肠;体外分离;免疫磁珠【作者】施晓杰;马维超;邓昱晨;邓伟;张倩;冯波;穆祥【作者单位】北京农学院动物科技学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206;北京农学院动物科技学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206;北京农学院动物科技学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206;北京农学院动物科技学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;北京农学院动物科技学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206;北京农学院动物科技学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206【正文语种】中文【中图分类】S858.28血管内皮细胞可调节机体内环境稳定,具有分泌、合成、代谢及免疫功能,可产生多种细胞因子和生物活性物质[1]。
不同于大血管内皮细胞,在不同组织器官之间,微血管内皮细胞在表型和功能上均表现出差异性[2]。
肠微血管内皮细胞衬附于肠绒毛血管内壁,呈网囊状,是血管内外物质交换的重要屏障和各种肠内毒素入血的必经通路。
植物细胞质壁分离实验及应用
答 案
看到细胞结构后为了更准确判断A处颜色，应细该准焦如螺何旋。
操作显微镜？
答案：（3）
调节光圈、
反光镜以改
变视野亮度
*
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Hale Waihona Puke 结束放映获取详细资料请浏览：/chuangxin/cx_index.html
二、质壁分离的应用
1. 判断成熟植物细胞是否有生物活 待测性成熟植物细胞＋一定浓度的蔗糖溶液 镜检 发生质壁
((液_12_根 要 答 m))的_该如o_据更案l等_洋果/L_题精：渗_、葱再_设确(浓_0表给1_.条的)5度_0皮你4_.件测5的_m4细～_可定组o方_胞0l_/知细实.L法_6的_、细胞验m。_细_0o胞液材_.l胞_5/_L液浓料_6_液之__m的度，__的间_o_等，请_l。/等_L渗可设_、渗(_2浓通计_0)浓_可.度过可5_度8_分在缩以_m为_别小0更o_._l_5配/浓_精_L～__的制度_确_0__.4浓梯6_地_组__m度度_测_蔗o。_为来l定_糖/L_0测出_之溶.5_定2细_间液_。胞。进
关键语句时时记
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1.动物细胞无细胞壁，不能发生质壁 分离现象。 2. KNO3溶液、尿素、甘油、乙二醇等 可使植物细胞先发生质壁分离后又自 动复原。 3.发生质壁分离时在细胞壁和细胞膜 之间充满的是外界溶液。 4.质壁分离与复原过程中水分移动是 双向的，总结果是单向的。
量浓度为0.3 g/L蔗糖溶液中的紫色洋葱
表皮制成装片，放在显微镜下观察，结 成熟植物细
果如图所示。请据图回答下列问题。
胞的细胞膜、 液泡膜及两
(1)洋葱表皮细胞通过渗透作用失水，
层膜之间的
解 析
细胞融合技术
动物细胞融合
动物细胞融合
有 何 同 ？ 不 同 ？
植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较
细胞工程 实质内容 植物体细胞杂交 动物细胞融合
改变遗传物质、产生新的性状，获得细胞产品 使后代具有双亲 改变遗传物质、产生新的性状，获得细胞产品(使后代具有双亲 的特性) 的特性 细胞膜的流动性;细胞增殖 细胞膜的流动性 细胞增殖 物理法：离心、振动、 物理法：离心、振动、电激 化学法： 化学法：聚乙二醇 生物法： 生物法：灭活的病毒 获得分离的单个动物细胞 (胰蛋白酶处理 胰蛋白酶处理) 胰蛋白酶处理 ↓ 诱导融合 ↓ 动物细胞培养 (细胞产品 细胞产品) 细胞产品 主要用于单克隆抗体的制备 (杂交瘤细胞 杂交瘤细胞) 杂交瘤细胞
细胞膜的流动性;植物细胞全能性 理论基础 细胞膜的流动性 植物细胞全能性 诱导手段 物理法：离心、振动、 物理法：离心、振动、电激 化学法： 化学法：聚乙二醇 去细胞壁 (纤维素酶、果胶酶 纤维素酶、 纤维素酶 果胶酶) ↓ 原生质体融合 (获得杂种原生质体 获得杂种原生质体) 获得杂种原生质体 ↓ 植物细胞培养 (获得植株 获得植株) 获得植株 获得白菜-甘蓝等杂种植物 获得白菜 甘蓝等杂种植物
单克隆抗体
（三）单克隆抗体的应用
①诊断疾病（识别作用， 诊断疾病（识别作用， 如同位素标记单克隆抗 可诊断肿瘤、 体，可诊断肿瘤、心血 诊断乳腺癌单克隆抗体 管畸形等）优点：准确、高效、简易、 管畸形等）优点：准确、高效、简易、快速 ②用于治疗疾病和运载药物 主要用于癌症治疗， （主要用于癌症治疗，也可运 载药物， 生物导弹” 载药物，如 “生物导弹”）
选择培养基上培养
专一抗体 检验阳性
多种杂交细胞
杂交瘤细胞有何特点？ 杂交瘤细胞有何特点？
动物细胞培养生物反应器的操作模式
动物细胞培养生物反应器的操作模式(总7页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--动物细胞培养生物反应器的操作模式米力第四军医大学细胞工程中心，国家863西安细胞工程基地陕西西安，710032动物细胞培养工艺的选择首先考虑的重要一点是该产品所涉及的生物反应器系统。
选择反应器系统也就是选择产品的操作模式，操作模式选择将决定该产品工艺的产物浓度、杂质量和形式、底物转换度、添加形式、产量和成本，工艺可靠性等。
与许多传统的化学工艺不同，动物细胞反应器设备占整个工艺资金总投入的主要部分（＞50%），也就是说动物细胞培养工艺的选择主要部分是生物反应器系统的选择。
选择反应器系统及培养工艺时，必须对工艺的整体性进行全面考虑，主要包括以下几个方面：细胞株及生长形式、产物表达量和稳定性，培养基质及代谢物，产物分离和纯化难度等。
动物细胞大规模培养的生物反应器操作模式，一般分为分批式操作（batch）、流加式操作（Fed-batch）、半连续式操作（semi-continuous）、连续式操作（continuous）和灌流式操作（perfusion）五种操作模式。
1. 批式操作（batch culture）批式操作是动物细胞规模培养发展进程中较早期采用的方式，也是其它操作方式的基础。
该方式采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。
该方式的特点:(1) 操作简单。
培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。
反应器系统属于封闭式，培养过程中与外部环境没有物料交换，除了控制温度、pH值和通气外，不进行其他任何控制，因此操作简单，容易掌握；(2)直观的反应细胞生长代谢的过程。
由于培养期间细胞的生长代谢是在一个相对固定的营养环境，不添加任何营养成分,因此可直观的反应细胞生长代谢的过程,是动物细胞工艺基础条件或"小试"研究常用的手段；(3)可直接放大。
小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及生物学特性分析
小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及生物学特性分析刘寿生;雷俊霞;黎阳;项鹏;周敦华【摘要】[Objective] To establish an effective way for isolation and expansion of mouse adipose-derived stromal cells (ADSC), and to observe the biological characteristics of mouse ADSC. [Methods] ADSC were obtained from adipose of BALB/C mouse, isolated and purified in vitro to determine cell morphology, immunophenotype, differentiation potentiality, clone formation ability, growth kinetics and immunoloregulation characteristics in the lymphocyte proliferation inhibition test; T lymphocytes (1 ?105) were cultured in the presence of ConA (ConA was 20 μg/mL), and ADSC of different number interacted with activated T lymphocytes respectively. Experiment was divided into 8 groups by the different number of ADSC: A group as positive control (ConA+T lymphocytes), B group (ADSC 1× 103+ConA+T lymphocytes), C group (ADSC× 1 04+ConA+T lymphocytes), D group (ADSC 2 × 104+ConA+T lymphocytes), E group as negative control (T lymphocytes), F group (ADSC1 ×103), G group (ADSC1 × 104), H group (ADSC 2 × 104), F, G, H were reference groups. The ability of T lymphocyte proliferation was measured by cck-8 method. [Results] ADSC showed plastic-adherent, fibroblastic-like morphologic characteristics, cell proliferation was inadequate and cell morphology changed to flat, enlarged shapes with the passage increasing. ADSC at passage 3 highly expressed CD29 and CD44, moderately expressed Sca-1, weakly expressed CD34, CD45, and CDllb.Three passaged ADSC could be induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes, and had strong ability to shape colony forming unit-fibroblasts (CFU-Fs). Doubling time of three,five, and eight passaged ADSC was (22 ?3)h, (24 ?3)h, and (30 ?3)h, respectively. The proliferation rate after passage 5 slowed down gradually. ADSC could suppress T lymphocyte proliferation, the inhibition ratios of B, C, and D group were 20. 78%, 47. 94%, and 60.70%, respectively, which was similar to bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC). [Conclusion] ADSC can be isolated and expanded effectively by using adherent culture, they possess general characteristics of mesenchymal stem cells, in addition, they are easier to be purified and their proliferation rate is faster compared with BMSC,so ADSC may be a good multipotential cell candidate for the future cell replacement therapy.%[目的]建立一种有效的分离、培养小鼠脂肪间充质干细胞(ADSC)的方法,从而为小鼠间充质干细胞(MSC)的来源提供更广阔的选择,以利于MSC在小鼠模型中的研究.[方法]体外分离、纯化BALB/C小鼠ADSC,进行细胞形态、表面标志、成脂及成骨分化潜能鉴定、克隆形成能力、生长动力学等方面的研究,并通过淋巴细胞增殖抑制试验研究其免疫调节特性:用终浓度为20μg/mL的ConA作用于T淋巴细胞(1×105个),以不同数量的ADSC分别与活化T淋巴细胞作用,根据ADSC数量不同实验分为A组(ConA+T细胞)、B组(ADSC 1×103/孔+ConA+T细胞)、C组(ADSC 1×104/孔+ConA+T细胞)、D组(ADSC 2×104/孔+ConA+T细胞),同时E组(单纯T细胞)作为阴性对照组,F组(ADSC 1×103孔)、G组(ADSC 1×104/孔 )、H组(ADSC 2×104/孔)作为参照组.用CCK-8法检测作用前后T细胞功能.[结果]ADSC镜下形态呈贴壁、梭型,且随着代数的增加,细胞逐渐增大；第3代ADSC高表达CD29和CD44,中表达Sca-1,低表达或不表达CD34、CD45、CD1 1b;第3代ADSC可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞;第3代ADSC有很强的集落形成能力；第3代ADSC倍增时间为(22±3)h,第5代ADSC 倍增时间为(24±3)h,第8代ADSC倍增时间为(30±3)h,第5代后的ADSC增殖速度随着代数的增加逐渐减慢;ADSC可以抑制T淋巴细胞的增殖,B、C、D组的抑制率分别为20.78％、47.94％、60.70％,抑制能力和骨髓间充质于细胞(BMSC)相似.[结论]通过贴壁培养可以从小鼠脂肪中分离培养出高纯度ADSC,该方法效率高,培养出的ADSC具有BMSC的一般特性,且与BMSC相比更易纯化,具有更快的增殖速度,有望作为小鼠MSC的有效来源.【期刊名称】《中山大学学报（医学科学版）》【年(卷),期】2012(033)003【总页数】6页(P299-304)【关键词】间充质干细胞;小鼠;骨髓;脂肪组织;免疫调节【作者】刘寿生;雷俊霞;黎阳;项鹏;周敦华【作者单位】中山大学附属第二医院儿科,广东广州510120;中山大学中山医学院,广东广州510080;中山大学附属第二医院儿科,广东广州510120;中山大学中山医学院,广东广州510080;中山大学附属第二医院儿科,广东广州510120【正文语种】中文【中图分类】R725.5;R329.4间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）最初是在骨髓中分离出来的，但后来在脂肪组织、肌肉组织、牙根、胎盘、羊水及脐带血中均分离出MSC［1］。