临床级干细胞分离培养
小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。
MSC 具有自我更新、多向分化、免疫调控和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果。
虽然MSC临床应用广泛，但许多关键问题如免疫调控的具体机制等并未解决。
小鼠是重要的实验动物之一，广泛用于基础实验研究。
在体外成功分离培养MSC，并得到大量纯化的MSC是研究其分化及功能调控机制的前提。
目前分离小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓贴壁法、骨片消化法、流式或磁珠分选法等。
然而全骨髓贴壁法获得的细胞往往含有不少造血细胞；骨片消化法需要进行胶原酶消化，步骤多且消化时问不好控制；流式或磁珠法虽然获得细胞较纯，但程序复杂，花费高且获得的细胞相对少。
骨髓MSC的分离目前常用的方法有全骨髓贴壁法、骨片消化法和流式细胞术或磁珠分选法。
全骨髓贴壁法即根据MSC的贴壁性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
然而该方法获得的MSC往往含有较多基质细胞和造血细胞污染。
我们的结果也显示，全骨髓贴壁法原代培养的细胞有75％为CD45阳性的细胞，传至第3代，MSC中仍有5％的CD45阳性细胞，即造血细胞。
骨片消化法，是先将骨髓冲干净，将股骨和胫骨剪碎，然后进行胶原酶消化。
虽然该方法获的MSC纯度较高，但是程序复杂，且不同鼠龄骨片胶原酶消化时间不同，不容易掌握。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有研究者利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法对其进行分离纯化旧191；虽然这些方法可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性；而且实验条件要求高，需要骨髓量大，加之耗费较大和技术难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
本研究采用骨髓加骨片法分离小鼠MSC，即将股骨和胫骨肌肉去干净后，不需冲骨髓，不需消。
干细胞提取和培养的实用技巧和建议
干细胞提取和培养的实用技巧和建议干细胞是一类具有自我更新和多分化潜能的特殊细胞，对于生命科学研究和医学应用具有重大意义。
干细胞的提取和培养是干细胞研究的基础工作，在实验室中有着重要的地位。
本文将给出一些关于干细胞提取和培养的实用技巧和建议，希望能对正在进行相关研究的科研工作者有所帮助。
一、干细胞提取的技巧和建议1.选择合适的样本：干细胞的来源多种多样，可以从胚胎、成体组织以及体液等多个渠道获取。
在选择样本时，需要根据自己的研究方向和实验要求来确定合适的来源。
同时，注意样本的获取方式需要符合伦理规范，尽量避免伤害动物或人体。
2.有效的细胞分离方法：干细胞通常以混合细胞群的形式存在于样本中，为了提取纯度较高的干细胞，需要采用有效的细胞分离方法。
常见的方法包括流式细胞术、磁珠分离和显微操纵等，选择合适的方法可以提高细胞分离的效率和纯度。
3.培养条件的优化：提取到的干细胞需要在体外培养中继续生长和扩增，为此，需要针对不同类型的干细胞优化培养条件。
确保培养基的成分和浓度适宜，相应的生长因子和细胞因子能够为干细胞提供必要的生长和分化信号。
4.维持干细胞的干性特性：干细胞的一个特点是具有自我更新和多向分化的能力。
在培养过程中，需要采取一系列措施来维持干细胞的干性特性。
例如，添加适量的抑制剂，调整培养基中的成分，以及维持细胞接触的方式等。
二、干细胞培养的技巧和建议1.培养器具和环境的准备：在进行干细胞培养前，需要对培养器具和环境进行彻底的清洁和消毒。
确保培养皿、培养箱和其他实验室设备无菌，避免细菌和霉菌等污染对干细胞生长的影响。
2.细胞传代的控制：在干细胞的长期培养中，细胞传代是不可避免的。
然而，过多的细胞传代会导致细胞老化和凋亡，影响干细胞的生理状态和功能。
因此，需要控制细胞传代的次数，同时选择合适的传代方法，以保持干细胞的长期稳定生长。
3.培养基的配制和补充：培养基的成分和浓度对干细胞的生长和分化起着重要的作用。
间充质干细胞的无血清培养基及间充质干细胞的临床级规模化培养方
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010110451.6(22)申请日 2020.02.21(71)申请人 广东国科细胞科技有限公司地址 510000 广东省广州市黄埔区（广州国际生物岛）螺旋四路一号生产区第二层201单元(72)发明人 陈海佳 陈东煌 戚康艺 姜交华 岳坤 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限公司 11227代理人 温可睿(51)Int.Cl.C12N 5/0775(2010.01)(54)发明名称间充质干细胞的无血清培养基及间充质干细胞的临床级规模化培养方法(57)摘要本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及间充质干细胞的无血清培养基及间充质干细胞的临床级规模化培养方法。
本发明提供的间充质干细胞无血清培养基包括氨基酸类、维生素类、无机盐类、pH缓冲剂、脂类、核酸类和其他物质，该培养基能够为细胞的生长、增殖提供充分的养分，更加适合MSCs无血清条件及高密度培养，从而获得良好的培养效果。
本发明还提供了一种补充因子，其包括激素及生长因子、贴壁因子、抗氧化成分、脂类、大豆胰酶抑制剂和大豆水解物。
该补充因子配合本发明所述的无血清培养基使用，能够保证在无动物源组分添加的情况下，干细胞能够快速增殖，且保持良好的干性。
权利要求书7页 说明书24页 附图3页CN 111440764 A 2020.07.24C N 111440764A1.间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，包括：氢基酸类、维生素类、无机盐类、pH缓冲剂、脂类、核酸类和其他物质；所述的氨基酸类包括：甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；所述的维生素类包括：维生素C、生物素、氯化胆碱、泛钙素、叶酸、维生素B2、维生素B12、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、肌醇和烟酰胺；所述无机盐类包括：氯化钙、五水合硫酸铜、七水合硫酸铁、硫酸镁、硫酸锰、七水合硫酸锌、柠檬酸铁、氯化钠、氯化钾、氯化锂、丁酸钠、钼酸铵、六水合氯化镍、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠；所述pH缓冲剂类包括：碳酸氢钠和Hepes；所述脂类包括：亚油酸所述核酸类包括：腺嘌呤和胸苷；其他物质类包括：葡萄糖、腐胺、硫辛酸和丙酮酸钠。
临床级人体组织来源间充质干细胞质量控制管理规范
DB32/T3544-2019临床级人体组织来源间充质干细胞质量控制管理规范1范围本标准规定了临床级人体组织来源间充质干细胞制备的基本要求、操作规范和质量控制。
本标准适用于临床级人体组织来源间充质干细胞的样本采集、制备、冻存、复苏与质量控制。
2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB3095环境空气质量标准GB19489-2008实验室生物安全通用要求GB50073-2001洁净厂房设计规范GB50346实验室建筑技术规范GB50591洁净室施工及验收规范WHO实验室生物安全手册（第三版）药品生产质量管理规范（卫生部令第79号）中华人民共和国药典（2015年版）干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)（国卫办科教发﹝2015〕46号）T11/CSSCR001-2017干细胞通用要求（中国细胞生物学学会-干细胞生物学分会团体标准）3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。
3.1临床级人间充质干细胞clinical grade human mesenchymal stem cells符合质量要求，可用于临床研究和应用的人多种组织来源（脐带血、脐带、胎盘、子宫内膜、脂肪、牙齿、骨髓等组织）间充质干细胞。
3.2伦理审查委员会ethical review committee负责对科学研究中涉及的伦理道德问题进行评估和审查的专门组织。
3.3科学审查委员会scientific review committeeDB32/T3544-2019负责对生物样本采集和使用的方案进行科学性审查的专门组织。
3.4生物安全委员会institutional biosafety committee负责制定生物安全政策和安全操作规范的专门组织。
3.5知情同意informed consent具有完全民事行为能力的自然人在重复获取信息并准确理解其内容后，作出接受或不接受样本采集的决定，此决定不受恐吓、利诱或其他不当行为的影响。
干细胞培养全攻略
干细胞培养全攻略第一步：准备工作在开始干细胞培养之前，您需要准备一些实验室必需品，如无菌培养器皿、培养基、培养药品和设备。
确保所有的培养物品都是无菌的，以防止任何细菌或真菌的污染。
第二步：细胞分离从组织或器官中获得干细胞是干细胞培养的第一步。
这通常需要对组织进行消化和分离，以获得细胞悬浮液。
消化的方法因组织类型而异，可以使用酶来消化组织，如胰蛋白酶、胶原酶等。
第三步：培养细胞将分离得到的细胞悬浮液培养在无菌培养器皿中。
干细胞可以在不同类型的培养基中生长，包括含有营养物质的基础培养基和添加了细胞生长因子和分化因子的特定培养基。
根据需要，可以选择不同的培养基来促进干细胞的增殖或分化。
第四步：细胞分化干细胞具有自我更新和分化为任何类型细胞的潜能。
要促使干细胞向特定细胞类型分化，可以通过添加特定的分化因子或调节细胞培养条件来实现。
例如，如果要将干细胞分化为神经细胞，可以添加神经生长因子到培养基中。
第五步：细胞鉴定和纯化在干细胞培养过程中，很重要的一步是对细胞进行鉴定和纯化。
这可以通过使用特定的标记物或抗体来检测细胞表面的分子标记完成。
例如，可以使用流式细胞术来分析细胞表面的特定蛋白，从而鉴定和纯化干细胞。
第六步：细胞传代干细胞通常需要定期传代以维持其生长和增殖。
细胞传代是将细胞从旧的培养皿中收集，并将其移植到新的培养皿中的过程。
在传代过程中，确保培养基和设备的无菌性以防止细菌和真菌的污染。
总结干细胞培养是一项复杂的技术，需要严格的实验操作和无菌技术。
在进行干细胞培养时，务必注意细胞的无菌性和培养条件的控制。
同时，在进行细胞分化和纯化时，要使用适当的试剂和方法来鉴定和纯化特定类型的细胞。
干细胞培养需要耐心和经验，但也为细胞生物学研究和医学应用提供了巨大的潜力。
干细胞提取方法与技巧
干细胞提取方法与技巧干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，具有广泛的应用前景，被广泛研究和应用于生物医学领域。
为了有效地提取干细胞，研究人员发展了多种提取方法和技巧。
本文将介绍几种常用的干细胞提取方法及其相关技巧。
一、初级培养法初级培养法是一种常见的干细胞提取方法，适用于无需大量提取的情况。
该方法的步骤如下：1. 细胞准备：收集组织样品，将其分解为细胞悬液。
2. 培养基配制：根据所需提取的干细胞类型，选择适当的培养基并加入适量的细胞因子。
3. 细胞培养：将细胞悬液加入培养基中并进行培养，在适当的培养条件下促进干细胞分化与增殖。
4. 细胞分离：通过倒置显微镜观察，使用悬液中的细胞管控探测器将干细胞从其他细胞中分离出来。
5. 干细胞纯化：将分离出的干细胞用干细胞培养基培养并纯化，去除其他非干细胞杂质。
二、流式细胞术流式细胞术是一种常用的干细胞提取方法，利用细胞的免疫表型可以从复杂的细胞混合物中识别并分离干细胞。
其步骤如下：1. 细胞样品准备：提取组织样品并制备单细胞悬液。
2. 细胞标记：将单细胞悬液与特定的细胞表面标记物结合，可通过免疫磁珠或荧光标记等方法实现。
3. 流式细胞术分选：使用流式细胞术仪器进行细胞分选，根据标记物的不同发射光强度，将目标干细胞从混合物中分选出来。
4. 干细胞的检验与分离纯化：将目标干细胞从其他细胞中纯化出来，根据需要采取不同的分离纯化方法。
三、单细胞测序法单细胞测序法是一种快速有效的干细胞提取方法，可在单个细胞层面进行分析，帮助揭示不同类型干细胞的功能和特性。
其具体步骤如下：1. 单细胞捕获：通过微流控装置将单个细胞捕获和固定在特定位置。
2. 细胞裂解：采用细胞裂解酶对细胞进行裂解，释放出细胞内的RNA和DNA。
3. RNA/DNA扩增：使用逆转录酶和DNA聚合酶对捕获的RNA和DNA进行逆转录和扩增。
4. 测序准备：将扩增的RNA/DNA片段进行文库建立准备，包括文库构建、PCR扩增等步骤。
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。
原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。
本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。
一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。
2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。
3.胎牛血清：用于细胞培养。
4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。
5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。
6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。
二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。
2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。
离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。
3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。
4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。
5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。
2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。
传代后的细胞继续培养至所需细胞量。
3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。
4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。
四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。
2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。
3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。
干细胞提取和分离方法总结
干细胞提取和分离方法总结干细胞是一类具有自我更新和分化为多种细胞类型能力的细胞，因其在再生医学和疾病治疗方面的巨大潜力而备受关注。
干细胞的提取和分离是开展干细胞研究的关键步骤，本文将总结几种常用的干细胞提取和分离方法。
1. 胚胎干细胞提取和分离胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)具有广泛的分化潜能，可以分化为体内所有的细胞类型。
目前，主要有两种方法用于胚胎干细胞的提取和分离：体外受精和体细胞核移植。
- 体外受精方法：该方法从捐赠人体内获取受精卵，通过体外培养获得兔囊胚，并将兔囊胚的内质体提取出来，形成胚胎干细胞系。
这种方法可以大规模获取胚胎干细胞，但受到伦理等因素的限制。
- 体细胞核移植方法：该方法通过将一个成体细胞的细胞核移植到一个空卵子中，得到克隆胚胎。
然后从克隆胚胎中提取胚胎干细胞。
这种方法可以避免使用受精卵，但技术难度较大且效率较低。
2. 间充质干细胞提取和分离间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)存在于骨髓、脐带血、脂肪组织等多种组织中，具有自我更新和多向分化能力。
提取和分离间充质干细胞的方法主要有以下几种：- 骨髓采集法：该方法通过穿刺骨髓髓腔，用针收集骨髓组织，然后经过干细胞分离和纯化得到间充质干细胞。
这种方法具有高效、简便的优点，但操作有一定难度。
- 脐带血提取法：该方法通过脐带血采集脐带中的干细胞，经过干细胞分离和纯化得到间充质干细胞。
相较于骨髓采集法，脐带血提取法更为简单和无创，但提取的间充质干细胞数量和质量较低。
3. 诱导多能干细胞提取和分离诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)是通过使用转录因子或化学物质将成熟的体细胞重新编程为干细胞的一种方法。
主要有两种方法用于诱导多能干细胞的提取和分离：细胞外基质和转录因子。
- 细胞外基质法：该方法在细胞培养基内添加适当的细胞外基质，提供合适的生长环境，帮助细胞重新获得干细胞特性。
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临床级干细胞分离培养等产业化关键技术研发
一、项目背景和意义：
作为生物技术最新的研究领域，干细胞的发现和干细胞技术的发展为人类疾病的治疗提供了独特的视角、方法和手段，为人类疾病治疗提供了新的希望和曙光，必将引起一场医学的革命。
干细胞的重要性奠定了其在医药卫生、科技产业和国防等领域内的重要地位，因此干细胞的研究开发和应用是人类的健康工程，预期在未来几年内会有更大的飞跃。
尤其是近年来，干细胞研究的进程和产业化速度大大加快。
干细胞的产业化是指依托于干细胞采集、储存、研发、移植、治疗等产品或服务以满足人类各种治疗和应用目的的行业种类的总称，干细胞产业已成为一个生机无限的经济增长点，蕴含着巨大的利润空间，是21世纪最有前景的朝阳产业。
临床级干细胞的分离与扩增是干细胞产业化过程中的重要环节。
什么样的干细胞能从体外培养进入临床疾病治疗？这就需要建立一个临床级干细胞的标准，它可以极大促进干细胞临床疾病治疗的研究和发展。
目前干细胞治疗研究中开展最广泛的两类细胞是造血干细胞和间充质干细胞。
对于造血干细胞，目前全世界已经建立了很多脐带血库来保存造血干细胞，并已得到广泛的应用。
而间充质干细胞的建库和临床应用才刚刚起步，目前已初步应用于治疗血液病（与造血干细胞共移植）、心脏病、脊髓损伤和多种自身免疫性疾病等，并取得了一定进展。
在间充质干细胞治疗同种异基因造血干细胞移植后发生
的GVHD方面，美国Osiris公司已完成了III期临床试验。
间充质干细胞具有广泛的应用前景，但是，迄今为止仍没有一个国际公认的能够用于分离和鉴定间充质干细胞的表面标志，这造成了制剂细胞成分不均匀、质量难以控制等困难。
因此，开发特异性分离间充质干细胞的新方法是进一步推动间充质干细胞临床应用的必然趋势。
按照临床应用的标准开发骨髓、脂肪、脐带等间充质干细胞的特异性分离纯化工艺，建立临床用间充质干细胞的制备工艺技术标准程序对于间充质干细胞的未来应用具有重大的推动作用。
二、项目目标
1. 总体目标：
建立临床级干细胞标准、开发临床级干细胞分离与培养工艺以及建立临床用间充质干细胞的制备工艺技术标准程序等。
2.具体技术指标：
建立1项成体干细胞的临床级分离纯化的关键技术、标准化操作程序和质控标准，实现间充质干细胞治疗产品生产的标准化、规模化运行，质量达到临床应用标准。
三、主要研究内容：
针对干细胞临床应用中所面临的分离、培养、扩增等关键问题，重点确定与国际接轨的临床级干细胞的标准，建立多种临床级干细胞
的分离纯化和培养新技术，为实现干细胞产业化奠定基础。
1.临床级干细胞的标准研究
参照ISSCR《干细胞临床转化指南》等国际文件，主要从以下要点进行临床级干细胞标准的研究：
1）符合卫生部门对治疗技术的标准和管理；
2）符合ISSCR《干细胞临床转化指南》中干细胞应用于临床的国际性考量；
3）符合国际细胞生物学界对干细胞科学标准的共识；
4）干细胞制备符合药品生产制备标准包括质量控制平台和cGMP平台等；
5）依照ISO9001:2008标准，制定干细胞标准化质量管理体系，涵盖干细胞的保存/运输等环节，标准化流程、文档及相应标准电子化管理与实时监控系统。
2.研发不同来源间充质干细胞的特异性分离纯化技术
1）建立临床级间充质干细胞的制备技术标准程序；
2）评价临床级间充质干细胞遗传稳定性和安全性；
3）评价临床级间充质干细胞的生物学效力。
四、建设地点
五、经费概算
六、承担单位
和泽生物科技有限公司为中国最大的干细胞投资控股企业，公司注册资本3.25亿元。
公司与中国医学科学院血液学研究所等单位共同投资组建的协和干细胞基因工程有限公司和协和华东干细胞基因工程有限公司是生物医药类的国家重点扶持高新技术企业，同时也是国家干细胞工程产品产业化基地。
公司以干细胞工程技术为重点研究方向，主要开展人干细胞的分离、纯化、体外扩增和无血清化技术的研究；建立集约化、系统化干细胞工程产品研发与生产技术；开展细胞制剂的研究开发和细胞株系筛选以及开发人干细胞无血清培养基和配套诊断试剂的技术；开展临床适用型干细胞扩增技术研究、干细胞大规模储存技术研究、优化和完善干细胞分离纯化、生物学和微生物检测、HLA配型、深低温冻存与复苏及移植应用技术；研究制定干细胞培养、产品储存、运输、移植等操作规程和标准。
其中脐带MSC是中源协和干细胞生物工程股份公司主力开发的细胞产品，已进行了大量前期研究工作。
公司实验室设备先进齐全，并拥有上市公司提供充沛的资金支持和优秀的风险管理团队，完全具有承担该研究的能力。