骨髓间充质干细胞的分离与培养
兔骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、成骨诱导与鉴定
摘要 ： 目的 建 立 一 种 兔 骨 髓 间 充 质干 细 （ Ｍｅ ｓ ｅ ｎ ｃ ｈ ｙ ｍａ ｌ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ １ ． ＭＳ Ｃ ） 体 外 分 离培 养 、 扩增 及 鉴 定 的 方 法 。方 法 采 用全 骨 髓 贴 壁 培 养 法分 离
原代和传代培 养的 ｒ Ｂ ＭＳ Ｃ ｓ 具 有 活跃 的增 殖 能 力 ， 成骨成脂诱导后， 碱 性磷 酸 酶 染 色 、 茜素 红 染 色 、 ｖ ｏ ｎ Ｋｏ ｓ ｓ ａ法 染 色 、Ｉ型胶 原 免 疫 细 胞 化 学
检 测 和 油 红 。 染 色均 呈 阳性 。成 骨诱 导 电镜 检 测 呈 阳 性 。结 论 全 骨 髓 贴 壁培 养 法操 作 相 对 简单 ， 可大量分离、 纯化 、 扩 增 骨 髓 间 充 质 干 细胞 ，
Ｍｅ ｔ ｈｏ ｄ ｓ ＢＭＳ Ｃｓ ｆ ｒ ｏ ｍ ｒ ａ ｂ ｂ ｉ ｔ ｗｅ ｒ ｅ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ，ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｄ ａ ｎ ｄ ｐ ｕ ｒ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ ｂ ｙ ｔ ｈ ｅ ｗ ｈｏ ｌ ｅ ｂ ｏ ｎ ｅ ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗ ａ ｄ ｈ ｅ ｒ ｅ ｎ ｃ ｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ，Ｔ ｈ ｅ ｃ ｅ ｌ ｌ ｇ ｒ ｏ ｗｔ ｈ ｗａ ｓ ｏ ｂ ｓ ｅ ｒ ｖ ｅ ｄ ｕ ｎ ｄ ｅ ｒ Ｐ ｈ ｓｅ ａ — ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ａ ｓ ｔ ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｓ ｃ ｏ ｐ ｅ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｇ ｒ ｏ ｗ ｔ ｈ ｃ ｕ ｖｅ ｒ ｏ ｆ ｃ ｅ ｌ ｌ ｐ ｒ ｏ ｌ ｉ ｆ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗａ ｓ ｄ ｒ ａ ｗｎ ａ ｃ ｃ ｏ ｒ ｄ ｉ ｎ ｇ ｌ ｙ．Ｂ ＭＳ Ｃ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ ｔ ｏ ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｉ ａ ｔ ｅ ｉ ｎ ｔ ｏ ｏ ｓ ｔ ｅ ｏ ｂ ｌ ｓｔ ａ ｓ ａ ｎ ｄ ａ ｄ ｉ ｐ ｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ｓ ａ ｎ ｄ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ Ａｌ ｋ ａ ｌ ｉ ｎ ｅ ｐ ｈ ｏ ｓ ｐ ｈ ａ ｔ ｓｅ ａ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｉ ｅ ｓ ｏ ｆ ｄ ｉ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｔ ｉ ｍｅ ｐ ｏ ｉ ｎ ｔ ｓ ．Ｒｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ＢＭＳ Ｃｓ ｆ ｒ ｏ ｍ ｒ ａ ｂ ｂ ｉ ｔ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｓ ｐ ｉ ｎ ｄ ｌ ｅ ｃ ｅ ｌ ｌ — ｂ ａ ｓ ｅ ｄ ， ｓ ｈ ｏ ｗｉ ｎ ｇ ｒ ａ ｄ ｉ ａ ｌ ｃ ｏ ｌ Байду номын сангаас ｎ ｙ ａ ｒ ｒ ａ ｎ ｇ ｅ ｍｅ ｎ ｔ ．Ｔ ｈ ｅ ｒｏ ｇ ｔｈ ｗ ｃ ｕ ｒ ｖ ｅ ｗ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｎ ｓ ｉ ｓ ｔ ｅ ｎ ｔ ￣ ； ｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ｒｏ ｇ ｗｔ ｈ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｉｓ ｒ ｔ ｉ ｃ ｓ ａ ｎ ｄ ｇ ｏ ｏ ｄ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｎ ｏ ｒ ｍａ ｌ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ．Ｆ ｏ ｌ ｌ ｏ ｗｉ ｎ ｇ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ，ｏ ｉ ｌ ｒ ｅ ｄ Ｏ
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
骨髓间充质细胞的提纯和分离、增殖
骨髓间充质干细胞分离及条件培养基在其培养扩增中的作用摘要：【目的】建立一种简便、快速、实用的大鼠骨髓间充质干细胞(mesenehymal stem cells，MSCs)体外分离、纯化和扩增的方法。
【方法】采用贴壁法分离纯化大鼠骨髓MSCs(rMSCs)，并对其形态学特征进行观察，培养时观察条件培养基对rMSCs生长的影响。
【结果】贴壁法能有效地分离rMSCs，采用条件培养液培养，细胞活力好，增殖能力强，对维持细胞正常形态有着重要作用。
【结论】贴壁分离法能成功地进行rMSCs的体外分离，采用爷件培养液建立的rMSCs培养方法有效可行。
关键词：骨髓问充质干细胞／分离和提纯；细胞培养骨髓间充质干细胞(MSCs)是一种成体干细胞，具有较强的可塑性，能被诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、成肌细胞等⋯1，同时发现MSCs还具有独特的免疫调节作用[2-4J。
细胞学、组织学及器官学的研究者均把目光投向MSCs，同时MSCs也受到药理研究者的关注。
MSCs除了可作为组织工程较理想的种子细胞外，也可作为药物作用的靶标或药理研究的工具，利用MSCs体内外生物学性质进行中药作用机理的研究已有众多报道I 。
但由于骨髓中的MSCs含量很低，1 个骨髓单核细胞中仅含有1～2个MSCs~11 J，加之MSCs主要存在于骨内膜_】，要获得满足药物研究所需的数量比较困难。
因此，采用合适的MSCs分离、纯化和扩增的方法是许多研究的重要前提。
1 材料与方法1．1 动物Sprague Dawley(SD)大鼠，性别不限，体质量100～120 g，本校实验动物中心提供，合格证号为SCXK (粤)2003．0001。
1，2 主要试剂低糖Dulbeceo改进的Eagle培养基(1ow glucose Dulbecco’s Modified Ea e Medium，LDMEM)由GIBCO 公司提供；胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)由杭州四季青生物工程材料有限公司提供；2．5 g／L胰酶(含0．2 g／L EDTA)由吉诺生物医药技术有限公司提供；HEPES为Sigma产品，广州威佳公司分装；青霉素、链霉素由华北制药有限公司提供；兔抗大鼠CD44、CD54、I 型胶原抗体，生物素化抗生蛋白链菌素复合(Streptavidin．Biotin．Complex，SABC)试剂盒，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒均由武汉博士德公司提供。
临床研究用人间充质干细胞质量评价
临床研究用人间充质干细胞质量评价一、引言人间充质干细胞（MSCs）由于其多向分化潜能、免疫调节特性以及易于体外培养等特点，被广泛用于临床研究。
在众多疾病的治疗中，MSCs 都展现出了巨大的潜力。
然而，要确保其在临床研究中的有效性，首先需要对MSCs的质量进行严格控制和评价。
本文将探讨如何评价临床研究用MSCs的质量。
二、MSCs的质量评价标准1、细胞的纯度和活性：这是MSCs质量评价的核心指标。
纯度是指MSCs中目标细胞的比例，而活性则是指MSCs的增殖能力和分化能力。
2、细胞的遗传稳定性：通过基因测序等方法，可以检测MSCs是否存在基因突变，以及是否存在潜在的致癌风险。
3、细胞的免疫调节特性：MSCs具有免疫调节特性，可以通过抑制免疫反应来降低排斥反应的风险。
因此，评价MSCs的免疫调节特性也是非常重要的。
4、细胞的来源和生产过程：MSCs的来源和生产过程也会对其质量产生影响。
例如，来自患者的自身MSCs可能比来自捐献者的MSCs更适合用于治疗。
同时，生产过程中的质量控制，如无菌操作、细胞培养基的质量等，也会影响MSCs的质量。
三、MSCs质量评价的方法1、细胞形态观察：通过观察MSCs的形态，可以初步判断其是否具有正常的形态学特征。
2、生长曲线测定：通过绘制MSCs的生长曲线，可以评估其增殖能力。
3、细胞表面标志物检测：通过检测细胞表面标志物，可以确定MSCs 的纯度和活性。
4、染色体核型分析：通过染色体核型分析，可以评估MSCs的遗传稳定性。
5、免疫调节特性检测：通过检测MSCs对免疫反应的调节作用，可以评估其免疫调节特性。
6、生产过程质量控制：通过监控生产过程中的关键控制点，可以确保MSCs的生产过程符合质量标准。
四、结论人间充质干细胞（MSCs）在临床研究中的应用前景广阔，但其质量评价是关键环节。
通过对MSCs的纯度、活性、遗传稳定性、免疫调节特性以及生产过程的质量控制等多方面的评价，可以确保其满足临床研究的需求。
骨髓间充质干细胞的分离与培养：本刊中文部
７ 建 立 大 鼠骨 髓 间 充质 千 细胞 稳 定 分 离培 养
体 系 与鉴 定
２ 密度 梯 度 离 心与 贴 壁 筛选 法 体 外 分离 培 养 胎 儿骨 髓 间充质 干细 胞
杨丽（ 暨南 大学药 学院 中药 学教研 室 ，广 东省 广
州市 ５１ ６３ ） ０ ２
王 美华（ 解放 军军事 医学科学院附属 医院消化
ｄ ｉ ０３ ６ ／ｉ ｎ ６ ３８ ２ ．０ ０ ６ ３ ｏ ｌ ９ ９ ｓ ． ７ —２ ５ １ ． ． ９ ： ｊ ｓ １ ２ ０ ０
中图分类 号： ３ ４２ 文献标识码： Ｒ９ Ｂ 文章编 号： ６ ３８ ２ （０ ００ —１ ３ ・４ １ ７ —２ ５２ １ ）６０ ４ ０ １
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１３／ ２ １ ５９ Ｒ ０ ０年皈权归 《 国组织Ｉ程研究与临来索复 》杂志社昕有 中
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骨髓 间充质 干细 胞 的分 离与培 养 ：本刊 中文部
１ 改 良小 鼠 骨髓 问 充 质干 细 胞 培养 方 法 及 长 效 荧光标 记 的可行 性
异 性 磷 脂 酶 Ｄ 的活 性 与 ｍＲ Ａ 变 化 一 致 ， Ｎ
其表达水平与急性 白血病类型及急性髓系白
血 病 患 者 有 无 肝 脾 和， 淋 巴结 肿 大 有 关 。 或
摘要
背景 ：据作者查新检索 ，国内外有关 急性 白 血病骨髓单个核细胞糖基化磷脂酰肌醇特异 性磷脂酶 Ｄ活性及 ｍＲ Ａ 表达与 白血病类 Ｎ 型 、患 者 肝 脾 淋 巴结 肿 大 关 系 的 报 道 罕 见 。
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。
原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。
本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。
一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。
2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。
3.胎牛血清：用于细胞培养。
4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。
5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。
6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。
二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。
2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。
离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。
3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。
4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。
5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。
2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。
传代后的细胞继续培养至所需细胞量。
3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。
4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。
四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。
2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。
3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。
间充质干细胞分离及培养方案
取小鼠（C57）两只，脱颈（大镊子卡住颈部）窒息而死，75%酒精在平皿中完全浸泡10分钟
无菌条件下脱皮，取出双侧股骨，胫骨，弘骨，除去肌肉和骨膜
用含1%双抗（青霉素+链霉素）的Hanks’液冲洗三次（无菌操作）
用剪刀剪去股骨，胫骨，弘骨的骨骺端，露出骨髓腔（无菌操作）
0.5毫升的重悬细胞液+4.5毫升4%的冰乙酸（对细胞液10倍稀释，分解红细胞），进行细胞计数，根据细胞数再确定稀释倍数
以1x107的浓度进行接种与培养瓶（塑料，带透气），37℃，5%CO2培养，48小时后换液，之后每两天换液一次
用不含双抗的M199培养基5毫升冲出骨髓，再吸取培养液继续冲洗，直至骨髓腔发白为止（无菌操作）
用纱布（两层纱布）在漏斗中进行细胞液的过滤，过滤到100毫小瓶子中（无菌操作）
将细胞液分到10毫升的离心管，1000转离心10分钟（无菌操作）
10毫升的M199培养基（不含双抗）对离心后的细胞进行重悬，吹打细胞时要轻（无菌操作）
骨髓间充质干细胞培养方法大全
一、四种方法简介及优缺点：骨髓间充质干细胞主要有4种体外分离方法：贴壁筛选法，密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。
贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的培养MSCS的方法。
贴壁分离培养法分离的MSCS能在体外培养条件下生长良好、可连续传代，体外培养扩增能力较强，其缺点是细胞纯度较低。
此方法简便，冲出骨髓直接培养，然后利用骨髓MSCS 贴壁生长特性，更换培养液逐步去处漂浮生长的造血系细胞即可获得较纯化的MSCS；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质，可促进MSCS 贴壁生长，因此全骨髓贴壁法更为可取。
密度梯度离心法梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。
梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同，使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，再进行贴壁培养，从而达到分离、纯化MSCS的目的。
Pittenger等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到95%。
常用的分离方法免疫磁珠法，是利用免疫学的技术分离MSCS，分离细胞的纯度高。
Phinney 用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来，提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法，但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记;而且，这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响，造成MSCS损伤，出现增殖缓慢等问题，这些技术问题很大程度上限制了这两种方法的应用。
因此，如何能简便高效地获得均质性的间充质干细胞和细胞群仍需要继续探索。
分离细疫磁珠分离和流式细胞仪筛选的方法，不仅对细胞活性影响较大，而且操作复杂，价格昂贵。
然而，这些纯化间充质干细胞的方法比较复杂，一般仅限于在各自的实验室应用。
二、具体实验流程1. 免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞：1 实验动物Sd大鼠2 试剂和仪器BSA、荧光标记小鼠抗体x、PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱。
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骨髓间充质干细胞的分离与培养艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038)提要:目的摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。
方法采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。
结果以选用4～24ｈ贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ｍｌ的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4ｄ进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。
结论建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。
关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＭＳＣ),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。
随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道ＭＳＣ在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。
本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。
1材料与方法1.1骨髓ＭＳＣ的分离从胸骨无菌抽取约1～2ｍｌ的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ｍｌ,混匀,1200ｒ/ｍｉｎ,离心10ｍｉｎ;弃上清,用0.01ｍｏｌ/Ｌ的ＰＢＳ(ｐＨ7.2)洗2～3次,1200ｒ/ｍｉｎ,各离心10ｍｉｎ;计数,以2×109/ｍｌ种入10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基,青霉素100Ｕ/ｍｌ、链霉素100μｇ/ｍｌ,37℃,5%ＣＯ2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01ｍｏｌ/ＬＰＢＳ(ｐＨ7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基。
1.2不同贴壁时间对ＭＳＣ增殖的影响选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72ｈ的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。
1.3不同浓度胎牛血清(ＦＢＳ)对ＭＳＣ生长的影响细胞按4×104/ｍｌ种入96孔培养板中,分别加入以下ＦＢＳ浓度的α ＭＥＭ培养基:0%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48ｈ后,加入20μｌＭＴＴ(5ｍｇ/ｍｌ二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4ｈ;尽量吸掉上清液,加入150μｌ二甲基亚砜,室温振荡10ｍｉｎ,ＨＴ7000ｐｌｕｓ多孔读数仪490ｎｍ处读取Ｄ490值,以培养液作空白对照。
1.4比较不同种植密度对ＭＳＣ生长的影响用含10%ＦＢＳ的α ＭＥＭ培养基;细胞按以下密度(×104/ｍｌ):0.3、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48ｈ后,按上述方法测其Ｄ490值。
1.5培养细胞生长曲线细胞按0.5×104/ｍｌ种入24孔培养板,每孔培养液为1ｍｌ,每天取3孔测其Ｄ490值,连续测8ｄ,绘出培养细胞生长曲线。
1.6培养细胞分裂指数曲线按检测细胞生长曲线的细胞密度接种于放有小盖玻片的24孔培养板中,每24ｈ取出3块小玻片,连续8ｄ;用95%酒精固定,ＨＥ染色、封片。
对每一时间组细胞进行计数,算出1000个细胞中分裂相细胞的百分比。
1.7ＭＳＣ的形态学观察在倒置显微镜下,直接观察第2、4、8代ＭＳＣ的活体形态;并分别用光镜及透射电镜观察其形态结构。
1.8统计学分析用哈佛统计软件,进行单因素方差分析及均数间的显著性差异检验,用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ作图。
讨论间充质干细胞来源于中胚层,具有很强的自我复制能力,能产生具有各种表型的子代细胞,在不同的诱导条件下可形成骨、软骨组织、脂肪、肌肉、肌腱以及骨髓基质结缔组织细胞等,分布在全身各结缔组织中,以骨髓和脐血中含量最为丰富。
随着组织细胞工程学和基因工程学的发展,利用ＭＳＣ的多向分化潜能,在组织工程、细胞因子替代治疗、基因治疗中以及器官移植等方面的应用研究已成为研究热点[5,6]。
由于间充质干细胞的数量少,成人骨髓平均10万个有核细胞中含有1个,并随着年龄的增加,细胞数量逐渐减少[7];生理状态下20%为静止期细胞[8]。
因此,如何摸索一个体外适宜ＭＳＣ生长扩增而又不分化的培养条件,对进一步研究ＭＳＣ生物学特性和诱导分化尤其重要。
我们利用人源性胸骨骨髓,通过离心去除抗凝骨髓血的血浆成份,经饱和ＮＨ4Ｃｌ溶液裂解红细胞,利用造血细胞悬浮生长特点,比较了不同时间贴壁细胞的生长增殖和形态的变化,认为以选用早期贴壁———4～24ｈ贴壁细胞进行培养最合适。
选用贴壁过早的细胞,因细胞数量太少,细胞生长困难;选用贴壁过长的细胞(超过48ｈ),在倒置显微镜下可见大量造血细胞粘附在贴壁细胞上面,并呈集落生长,随着培养时间的延长,贴壁细胞形态出现多样性,细胞增殖周期延长,这可能与造血细胞分泌的细胞因子促进细胞分化有关。
体外培养细胞还受培养血清的浓度、种植细胞的密度、培养的温度、培养基的ｐＨ值等等。
在选用早期贴壁细胞的基础上,比较了不同浓度的血清和不同细胞种植密度对细胞生长增殖的影响,结果显示并非血清浓度越高就能促进细胞生长,高浓度血清中由于含有大量促进细胞生长增殖分化的因子,易引起细胞增殖分化,使细胞过早出现老化,反而不利于干细胞的生长;细胞生长还受细胞与细胞之间相互作用的影响,细胞种植密度过密,会引起细胞之间的接触抑制,过稀会导致细胞之间分泌的细胞因子不足影响细胞的生长,骨髓间充质干细胞能分泌ＩＬ6、ＩＬ7、ＩＬ8、ＩＬ11、ＧＣＳＦ、ＤＳＦ、ＳＣＦ等[8]多种细胞因子,对支持造血和维持细胞生长分化十分重要。
利用本实验条件培养细胞已培养14代,原代细胞生长增殖较慢需8～10ｄ,3～10代的细胞生长周期为3～4ｄ,10代以后细胞生长速度开始减慢,细胞形态呈梭状,各代之间形态较均一;培养细胞传代后1～3ｄ进入生长滞留期,4ｄ达到对数生长期,以后进入平台期;经光镜观察细胞形态为类成纤维状,超微结构显示培养的第2、4、8代细胞,细胞核大、形状不规则呈多形性,染色质分布稀疏、电子密度较低,胞浆细胞器少,表现为早期幼稚细胞发育的特点。
我们利用此条件培养的ＭＳＣ细胞,与骨髓成纤维细胞、内皮细胞和造血干细胞比较在表型上有着明显的区别,ＭＳＣ不表达成纤维细胞、内皮细胞和造血干细胞特有的抗原如Ⅰ型胶原、Ⅷ因子和ＣＤ34+等,并在一定条件下成功地诱导ＭＳＣ向成骨细胞和成软骨细胞分化,表明ＭＳＣ仍然保持着干细胞多向分化的特点,见另文报道。
因此,作者认为利用此培养条件能达到ＭＳＣ体外扩增而又不分化的目的,为进一步研究骨髓间充质干细胞的特点和应用打下了基础。
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