骨髓间充质干细胞培养讲稿
大鼠骨髓间充质干细胞的分离方法和培养
大鼠骨髓间充质干细胞的分离方法和培养摘要】目的：探索在体外培养和纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。
方法：采用改良全骨髓贴壁方法，分离和纯化3～4周的大鼠BMSCs，镜下连续观察细胞的形态变化。
流式细胞仪鉴定其表面抗原CD11b、CD45和CD90的表达情况。
结果：原代培养的细胞呈圆形和梭形等，24小时后大部分细胞均贴壁。
8～10天可达80%～90%融合，纯化后传代周期为6～8天。
流式细胞术鉴定表明CD11b和CD45阴性，CD90阳性。
结论：改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞，是一种比较理想的分离培养方法。
【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养大鼠【中图分类号】R730.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）13-0026-02Rat bone marrow mesenchymal stem cells‘s separation methods and tocultivate Zou Jin. Hun an Vocational College of Science and Technology, Hu’nan Province, Changsha 410014, China; Li Ya. Hu’nan University of Chinese Medicine, Hunan Province, Changsha 410004, China; Yin Jin. The Centers for Disease Control and Prevention of Hu’nan, Hu’nan Provin ce, Changsha 410007, China【Abstract】Objective To explore the in vitro culture and purification of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) method. Methods Using improved the whole bone marrow adherent method, separation and purification of rat (for 3 ～ 4 weeks )of BMSCs, microscopically continuous observation of cell morphology change. To identification cells surface antigen CD11b, CD45 and CD90 expression using flow cytometry. Results The original generation of cultured cells is circular and spindle,after 24 hours, most of the cells are attached. 8 ～ 10 days later, the fusion of up to 80% ～ 90%. After purification，extend the period is 6 ～ 8 days. Using flow cytometry assay, CD11b and CD45 were negative, CD90 is positive. Conclusions Improved the whole bone marrow adherent method, which can effectively the isolation and cultureof rat bone marrow mesenchymal stem cells, is an ideal method of cultivation.【Key words】Bone marrow mesenchymal stem cells; Cell culture; The rat骨髓间充质干细胞是中胚层来源的干细胞，是具有多向分化潜能的成体干细胞之一[1]。
骨髓间充质干细胞的分离培养1
兔的骨髓间充质干细胞提取1.1兔骨髓MSC的分离用3%戊巴比妥钠按1 mg/kg的剂量施以全身麻醉，另用1%利多卡因于手术部位施以局麻；无菌操作下于右胫骨上端内侧部用锐性穿刺锥于骨皮质上开出一直径约2～3 mm的孔，使通达髓腔；用18号硬膜外穿刺针接5 ml 注射器，内含3000 U/ml的肝素0.1 ml，沿骨皮质上的孔穿入髓腔，抽出骨髓血约2 ml；抽出的骨髓血用平衡液洗涤两次后，离心1800R 5 min；弃去上清液，沉淀用Ham f12-10%FBS培养液重新打匀；用灭菌的0.17 mol/L饱和NH4Cl溶液按1∶5的体积比加入已重新打匀的悬液中，4℃下保留10 min，取出再离心180×g，5 min；弃去上清后，以几滴平衡液再悬浮后，用细胞计数板作细胞计数，确认有核骨髓细胞量达106～107后，即可进行原代培养接种用。
1.2兔骨髓MSC的原代培养将经上述培养分离所得的有核骨髓细胞按每孔3×104个细胞的密度接种于6孔培养板内，加入Ham f-12培养液，于37℃，10% CO2条件下培养；于接种5 d后进行第1次换液，以后隔日换液。
每天随机抽取3只实验动物的MSC作细胞生长动力学分析，各取此三者的1个培养孔用0.25%胰酶-1 mmol/L EDTA液将贴壁细胞消化分离（37℃、3～5 min），并作贴壁细胞计数，直至贴壁细胞铺满整个培养孔的底部。
将此3个实验动物MSC每天的细胞计数取平均值，作原代细胞培养的生长曲线分析。
1.3兔骨髓MSC的传代培养原代培养一旦铺满整个培养孔的表面，即可用0.25%胰酶-1 mmol/L EDTA液将贴壁细胞消化分离（37℃、3～5 min），然后按1∶3的比例进行传代接种培养，并记为P1；传代培养过程中隔日换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满整个培养孔的底面。
再重复以上操作，用0.25%胰酶-1 mmol/L EDTA 液将贴壁细胞消化分离（37℃、3～5 min），并按1∶3的比例进行下一代传代接种培养，并记为P2，余类推。
骨髓间充质细胞共培养
骨髓间充质细胞共培养简介骨髓间充质细胞（MSCs）是一种具有多潜能的细胞群体，可以分化为多种成纤维细胞样细胞，如成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。
共培养是指将MSCs与其他类型的细胞一起培养，以模拟体内细胞间的相互作用。
通过骨髓间充质细胞共培养，可以研究细胞间的相互作用和信号传导，并探索细胞共培养在再生医学和组织工程领域的应用潜力。
MSCs与其他细胞共培养的优势1.促进细胞增殖：MSCs可以分泌多种生长因子和细胞因子，与其他细胞共培养可以促进细胞增殖并加速组织修复过程。
2.促进细胞分化：MSCs具有多向分化潜能，与特定类型的细胞共培养可以诱导MSCs定向分化为目标细胞类型，如骨细胞、软骨细胞等。
3.促进细胞功能：MSCs与其他细胞共培养可以促进细胞间的相互作用和信号传导，提高细胞的功能表现。
4.提高组织工程材料的生物相容性：将MSCs与生物材料一起培养可以提高材料的生物相容性和降低排异反应的风险。
骨髓间充质细胞共培养的方法1. 直接接触共培养直接接触共培养是将MSCs与其他细胞直接共同培养在同一培养基中。
这种方法可以促进细胞间的相互作用和信号传导，但也可能导致细胞间的竞争和影响。
2. 间接接触共培养间接接触共培养是将MSCs和其他细胞分别培养在不同的培养基中，但通过孔隙大小适中的隔离膜或转移液体的方式，使两种细胞之间可以相互影响。
这种方法可以减少细胞间的竞争，但信号传导可能不如直接接触共培养明确。
3. 三维共培养三维共培养是将MSCs和其他细胞培养在三维支架或基质中。
这种方法模拟了体内组织的三维结构和细胞间的相互作用，能够更真实地模拟体内环境。
MSCs与不同类型细胞的共培养研究1. MSCs与成骨细胞共培养研究通过将MSCs与成骨细胞共培养，可以促进骨细胞的增殖和功能表现，加速骨组织修复。
此外，MSCs还可以促进骨基质的形成和骨再生过程。
2. MSCs与软骨细胞共培养研究MSCs与软骨细胞共培养可以诱导MSCs向软骨细胞方向分化，促进软骨组织的再生和修复。
间充质干细胞培训课件
运用MSCs 的特性，通過细胞载药的形式可以实 現紫杉醇等經典小分子抗肿瘤药物的积极靶向效 果以提高疗效。
如极具侵袭性的脑多形性胶质母细胞瘤，肿瘤易 扩散至周围脑实质细胞，既有的药物难以实現 有效靶向。运用MSC 的肿瘤靶向及寻找转移灶 的特性，可使用基因修饰的MSC 作為手术後的 佐剂，清除残存肿瘤细胞及迁移的瘤细胞。
体转化因
如通過過体現增長MSCs分泌IL-12、IL-2、TSP-1、 IFN-α、 IFN-β、 IFN-γ等抗瘤因子，能有效抑 制肿瘤增殖、增進肿瘤细胞凋亡，從而增長试验動 物的存活率。
运用体既有胞嘧啶脱氨酶的MSCs迁移汇集于肿瘤 部位後，通過此酶的转化作用使注入体内無毒的 前药5-FC(5氟胞嘧啶）转化形成5-FU，在肿瘤部 位发挥抗癌作用。
• 脂肪源性间充质干细胞
研究发現從人脐带中分离出的hUCMSC, 其细胞含量、增殖能力均优于BMSC，經多 次传代扩增仍能保持旺盛功能。它不体現或低 体現免疫排斥有关標识（MHC I类分子呈低
表 达，不体現MHC II类分子），免疫原性比
BMSC 低，且取材以便，無伦理學争议，是目前较為
理 想的再生醫學干细胞治疗的种子细胞之壹。
调 ➢M整STC细s胞可的产活生化對和应增的殖来生调長控因免子疫和应细答胞，可因防子止 增和治進疗组移织植损物伤抗的宿修主病复和自身免疫性疾病。
如产生骨形成蛋白1增進 骨、肌腱、软骨 的损伤修复；
➢ MSCs定向迁移至病变部位（趋向性、归巢
現象）
体内植入的MSCs在损伤组织局部微环境
的作用 下M，SC穿s 分越泌血多管种内细皮胞细因子胞，，包迁括移生定長位因于子、损趋伤部
② 不体現造血细胞表面標志：如CD45、 CD34、
分离培养及鉴定骨髓间充质干细胞的方法探析论文
分离培养及鉴定骨髓间充质干细胞的方法探析论文分离培养及鉴定骨髓间充质干细胞的方法探析论文骨髓间充质干细胞（BMSCs）也被称为间质祖细胞，由于其巨大的增殖和多向分化潜能，被认为是再生医学、基因治疗和细胞治疗的理想种子来源，已被广泛进行研究[1-3].目前，BMSCs在动物实验和临床应用上取得了巨大的成果，在骨、软骨、肌腱、神经胶质修复、心脏疾病、心肌梗塞、肝脏损伤等方面取得了重大突破[4-6],并且可避免胚胎干细胞和异基因干细胞治疗所涉及的伦理道德和免疫排斥问题，有利于细胞移植。
但是骨髓中的BMSCs含量极少，约占骨髓全细胞的0.001%~0.010%[7];因此，需要在体外分离纯化、培养扩增来满足临床应用和实验研究。
研究表明，不同分离方法和首次换液方式对BMSCs的增殖培养有很大的影响[8].本试验通过观察2种不同分离方法和不同首次换液时间对兔BMSCs生物活性的影响，旨在建立一种有效的分离培养及鉴定BMSCs的方法，以便获得大量、高纯度、高活性、培养周期短的BMSCs,为下一步研究和临床实验提供基础。
1 材料与方法1.1实验动物1月龄雄性新西兰大耳白兔1只，由河南省实验动物中心提供。
1.2主要试剂和仪器胎牛血清（北京四季青）；DMEM-F12（Gibco）；胰蛋白酶（北京拜尔迪生物公司）；DMSO（Gibco）；红细胞裂解液（北京赛驰生物技术有限公司）；生物素标记山羊抗兔IgG、HRP标记链霉亲和素、DAB显色试剂盒、改良型苏木素（北京华肽先锋）；兔抗兔CD34、CD44、CD99抗体（北京博奥森）；封闭山羊血清（北京博奥森）。
HF151UV型CO2培养箱（Heal Force）；倒置显微镜（Leica）;800型离心机、85-2恒温磁力搅拌器：金坛市大地自动化仪器厂；数码相机：日本佳能IXUS 980IS;电子天平：METTLER TOLEDO AL104;超净工作台：AIR TECH;FX101-2型电热鼓风干燥箱：上海树立仪器仪表有限公司；pH计：上海雷磁仪器厂。
骨髓间充质细胞共培养
骨髓间充质细胞共培养
骨髓间充质细胞（BMSCs）是一种多能干细胞，具有广泛的分化潜能和免疫调节作用。
BMSCs可以通过共培养的方式与其他细胞相互作用，从而影响它们的生长、分化和功能。
共培养是指将两种或更多种不同类型的细胞放在同一培养皿中，让它们相互作用。
BMSCs与其他细胞的共培养可以通过直接接触或间接接触的方式进行。
直接接触是指BMSCs与其他细胞直接接触，而间接接触是指BMSCs释放的细胞因子通过介质传递到其他细胞中。
BMSCs与其他细胞的共培养可以产生多种效应。
首先，BMSCs可以促进其他细胞的增殖和分化。
例如，BMSCs与神经元的共培养可以促进神经元的生长和分化，从而有助于神经再生和修复。
其次，BMSCs可以调节其他细胞的免疫反应。
BMSCs可以通过释放细胞因子来抑制其他细胞的免疫反应，从而减轻炎症和自身免疫性疾病等疾病的症状。
此外，BMSCs还可以促进其他细胞的代谢和功能。
例如，BMSCs与心肌细胞的共培养可以促进心肌细胞的代谢和收缩功能，从而有助于心脏功能的恢复。
BMSCs与其他细胞的共培养是一种重要的细胞学研究方法，可以用于研究细胞间相互作用的机制，以及开发新的细胞治疗方法。
未来，我们可以进一步探索BMSCs与其他细胞的共培养的机制和效应，以期为临床治疗提供更有效的细胞治疗策略。
大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定
中国组织工程研究与临床康复 第15卷 第10期 2011–03–05出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research March 5, 2011 Vol.15, No.10ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH1721Department of TraumaticOrthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, ChinaLi Xiao-feng ★, Master, Attending physician, Department of TraumaticOrthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China xiaofengli74@ Correspondence to: Zhao Jin-m in, Doctor, Professor, Department of TraumaticOrthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Chinazhaojinmin@Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30860078*; Key Science andTechnology Program by HealthDepartment of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 200636*Received: 2010-12-27 Accepted: 2011-01-26大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定**★李晓峰，赵劲民，苏 伟，崔向荣，罗世兴，马爱国Culture and identification of rat bone marrow mesenchymal stem cellsLi Xiao-feng, Zhao Jin-min, Su Wei, Cui Xiang-rong, Luo Shi-xing, Ma Ai-guo Abstract Li XF, Zhao JM, Su Wei, Cui XR, Luo SX, Ma AG. Culture and identification of rat bone marrow mesenchymal stem cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(10): 1721-1725. [ ]摘要 李晓峰，赵劲民，苏伟，崔向荣，罗世兴，马爱国. 大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(10):1721-1725. [ ]0 引言骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells ，BMSCs)具有多向分化潜能，能促进间充质组织的再生，如：骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质等组织[1]。
小鼠骨髓间充质干细胞原代培养
1、材料
成年小白鼠4只 胎牛血清（杭州四季清公司） L-DMEM (Hyclone赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司 ） 胰蛋白酶（Sigma公司） PBS（NaCl 8g,KCl 0.2g,NaHPO4·12H2O 2.88g,KH2PO4 0.2g,三蒸水1000ml) Percoll细胞分离液（Percoll原液：三蒸水:NaCl 2.6:1.9:0.5) 青霉素、链霉素（100U/ml青霉素，100µg/ml链霉素） 8%NaHCO3溶液（8gNaHCO3,100ml超纯水）
小鼠骨髓间充质干细胞的原代培 养
一、立题依据1、小鼠骨髓间质干细胞原代培养的意义 有利于迚行骨髓间充质干细胞的生物学特性的研究
为下一步的传代培养创造条件
可以直接应用于临床实践，是研究骨髓间充质干细胞作用 的前提
2、骨髓间充质干细胞原代培养的方法
贴壁培养筛选法 密度梯度离心法
结果一
第1次换液后5～7 d可见由几十个到数百个细胞组成的集落，细胞形 梭态呈形、三角形或星形 （图1C、D）
结果一
原代细胞培养10 d左右，细 胞快速增殖，每个集落中的 细胞不断增殖呈长梭形放射 状排列（图1E）
培养2周左右，每个小集落形 成约数百致上千个细胞的大 集落，集落交界处出现重叠 、融合 （图1F)
讨论
• 有时在相同的培养条件下，有极少数标本较难扩增骨髓MSCs，可能不冲洗骨 髓腔的操作有关。骨髓MSCs具有黏附贴塑料瓶壁的特性，在实验中用玻璃瓶 也能培养扩增。在原代培养物中，除了呈成纤维细胞样的MSCs外，还混杂着
一些其他细胞，可以根据这些污染细胞生物学特性将其除去。血清的浓度并
非越高越好，相反，高浓度血清由于含有大量促迚细胞分化的因子，已引起 细胞分化，从而使细胞过早出现老化，反而丌利于干细胞生长，一般以5%～
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骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定
• 上述实验结果证实，体外分离培养的SD
大鼠骨髓细胞为纯度较高的骨髓间充质干 细胞而非其他造血谱系干细胞，并建立了 一套简单、有效、获得纯度较高的骨髓间 充质干细胞分离培养、增殖、鉴定的方法。 传代至第3代时，可获得纯度高、数量足、 生物活性高的骨髓间充质干细胞，为本研 究课题进一步实验研究奠定了实践基础以 及提供了数量充足的种子细胞。
壁法，建立一套简单、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养、
增殖和纯化方法，观察其生长形态和生物学特性，验证其向成骨、成软骨、
成脂分化能力，为进一步研究骨髓间充质干细胞移植、基因治疗及组织工
程奠定实验基础。
实验方法
• 1、骨髓间充质干细胞的原代分离及传代培
养
• 2、骨髓间充质干细胞的形态学观察 • 3、骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制 • 4、骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定 • 5、骨髓间充质干细胞多向诱导分化
骨髓间充质干细胞的原代分离及传代培养
• 10%水合氯醛麻醉大鼠，经颈椎脱臼处死，大鼠全身浸泡
于体积分数为75%乙醇消毒30 min，于超净台无菌操作下 取其双侧股骨与胫骨，PBS冲洗，剪去骨两端干骺端，用 10 mL注射器吸取LG-DMEM培养液反复冲洗骨髓腔，收集 经细胞筛过滤后的细胞悬液，以1 000 r/min离心5 min。 弃上清，以 1×109 L-1的细胞浓度接种于25 cm2塑料培养 瓶，置于37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度培养箱中 培养。24 h后全量换液，2，5 d分别半量换液，7 d全量 换液。待培养瓶中细胞分裂增殖80%-90%汇合单层时用 1.5 mL Trypsin-EDTA解离细胞，当细胞充分离散时，加入 5 mL的含血清培养基终止消化，离心细胞悬液，1 000 r/min离心5 min。弃上清，加入含体积分数为10%胎牛血 清的LG-DMEM培养基，将重悬的细胞悬液以1∶2比例进行 传代。
•
经成骨诱导剂培养11 d后，细胞胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长，细
胞间可见钙质沉积，细胞结节中心的细胞融合失去细胞结构，钙结节形成明
显，经茜素红染色呈红色结节(图3B)；经碱性磷酸酶染色可见细胞外基质有
大量紫褐色沉淀，呈强阳性表达(图3C)；经vonkossa矿化染色可见细胞聚集
处有黑色固块，岛状分布，呈强阳性表达(图3D)。骨髓间充质干细胞经成软
骨髓间充质干细胞培养课件
主要内容
1.前言 2. 实验方法 3. 结果 4. 结论
前言
•
近来研究表明，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem
cells，BMSCs)不但具有来源广泛、易于获取、增殖迅速、可自体移植、体
外基因转染率高等特点，而且在不同诱导剂培养下可分别诱导分化为成骨
• 取融合至90%左右生长状态良好第3代
骨髓间充质干细胞，胰蛋白酶消化、室温 离心、细胞计数，调整待测样本细胞数为 1×109 L-1，分装至各PE管中，依次加入单 克隆抗体CD44、CD29、CD90、CD45、 CD34、CD11b，每管设立同型阴性对照组 (对照组中不加任何抗体)。常温避光孵育40 min，PBS冲洗细胞，细胞重悬，经流式细 胞仪检测分析。
细胞、成软骨细胞、脂肪细胞，神经细胞及肝细胞等已成为适合组织和细
胞移植的种子细胞，以及基因治疗的理想靶细胞。但在骨髓中骨.001%-0.1%，如何为组织和
细胞移植及基因治疗提供数量充足、活性良好的骨髓间充质干细胞成为国
内外学者研究的重点。
•
依据骨髓间充质干细胞对塑料培养瓶具有黏附贴壁特性，实验采用贴
骨细胞诱导剂培养21 d后，诱导而成的软骨细胞变大、变圆，表面变的光滑，
经甲苯胺蓝染色，可见胞质呈蓝色(图3E)。骨髓间充质干细胞经成脂诱导剂
培养19 d后，诱导而成的脂肪细胞脂质累积，脂滴数量增加并相互融合，细
胞由长梭形变为圆形、多边形，经油红O染色显示许多细胞的胞浆内有大量
脂质沉淀(图3F)。
结论
结果
刚接种于培养瓶的骨髓细胞大多数悬浮于培养液中，细胞呈圆形，大小不一。接 种24 h后开始贴壁，通过更换培养液，去除悬浮未贴壁细胞，48 h后贴壁细胞逐渐伸展 为梭形、多角形、不规则圆形，排列不规则(图1A)。7 d后，贴壁细胞显著增多，以小圆 形和梭形细胞为多，部分细胞排列趋于平行，部分成旋涡状生长(图1B)。第3代骨髓间充 质干细胞生长较原代细胞快，以梭形细胞为主(图1C)。细胞传代至第8代，细胞增殖活力
。 未见明显变化，主要以大而铺展的多形细胞为主(图1D)
• 流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞表dm 标记物的表达，结果显示：细胞均一表
达CD44、CD29、CD90，阳性率分别为99.69%、83.99%、95.05%，而CD45、CD34、 CD11b/c则呈阴性表达，分别为0.28%，0.62%，4.25%(图2)。
骨髓间充质干细胞多向诱导分化
• 取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，
以5×107 L-1接种于24孔板，待细胞贴壁生 长融合至70%-80%时，向各诱导孔中分别 加入成骨细胞诱导剂(含地塞米松、β-甘油 磷酸钠、维生素C-2磷酸钠)，成软骨细胞诱 导剂(含地塞米松、转化生长因子β、维生素 C)，成脂细胞诱导剂(含地塞米松、胰岛素、 吲哚美辛)。各诱导孔定期换液，以未经处 理的骨髓间充质干细胞培养孔作为对照。
骨髓间充质干细胞的形态学观察
• 取原代和第8代细胞，每日用倒置相差显
微镜观察其生长形态及特征并照相记录。 取生长良好的细胞于含10%二甲基亚砜的 血清中冻存，2周后复苏，锥虫蓝拒染实验 检测死亡及存活细胞，继续于37 ℃，体积 分数为5%CO2培养箱中培养。
骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制
• 取第1，3代细胞，胰酶消化后计数，以