骨髓间充质干细胞培养汇总.
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全骨髓贴壁接触培养SD大鼠骨 髓间充质干细胞
省科学技术计划项目
主要内容
1.前言 2. 实验方法 3. 结果 4. 结论
前言
近来研究表明，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)不但具有来源广泛、易于获取、增殖迅速、可自体 移植、体外基因转染率高等特点，而且在不同诱导剂培养下可分别诱导分 化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞，神经细胞及肝细胞等已成为适合 组织和细胞移植的种子细胞，以及基因治疗的理想靶细胞。但在骨髓中骨 髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓有核细胞总数的0.001%-0.1%，如 何为组织和细胞移植及基因治疗提供数量充足、活性良好的骨髓间充质干 细胞成为国内外学者研究的重点。 依据骨髓间充质干细胞对塑料培养瓶具有黏附贴壁特性，实验采用贴 壁法，建立一套简单、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养 、增殖和纯化方法，观察其生长形态和生物学特性，验证其向成骨、成软 骨、成脂分化能力，为进一步研究骨髓间充质干细胞移植、基因治疗及组 织工程奠定实验基础。
流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞表dm 标记物的表达，结果显示：细胞均一 表达CD44、CD29、CD90，阳性率分别为99.69%、83.99%、95.05%，而 CD45、CD34、CD11b/c则呈阴性表达，分别为0.28%，0.62%，4.25%(图 2)。
经成骨诱导剂培养11 d后，细胞胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长， 细胞间可见钙质沉积，细胞结节中心的细胞融合失去细胞结构，钙结节形成 明显，经茜素红染色呈红色结节(图3B)；经碱性磷酸酶染色可见细胞外基 质有大量紫褐色沉淀，呈强阳性表达(图3C)；经vonkossa矿化染色可见 细胞聚集处有黑色固块，岛状分布，呈强阳性表达(图3D)。骨髓间充质干 细胞经成软骨细胞诱导剂培养21 d后，诱导而成的软骨细胞变大、变圆，表 面变的光滑，经甲苯胺蓝染色，可见胞质呈蓝色(图3E)。骨髓间充质干细胞 经成脂诱导剂培养19 d后，诱导而成的脂肪细胞脂质累积，脂滴数量增加并 相互融合，细胞由长梭形变为圆形、多边形，经油红O染色显示许多细胞的 胞浆内有大量脂质沉淀(图3F)。
骨髓间充质干细胞的形态学观察
取原代和第8代细胞，每日用倒置相差显微镜 观察其生长形态及特征并照相记录。取生长良好 的细胞于含10%二甲基亚砜的血清中冻存，2周 后复苏，锥虫蓝拒染实验检测死亡及存活细胞， 继续于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中培 养。
骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制
取第1，3代细胞，胰酶消化后计数，以 5×104个/孔接种于96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃，饱和湿度，体积分数为 5%CO2培养箱孵育2 h后，用酶联免疫检测仪 于450 nm波长下检测吸光度值。然后在检测第 1，2，3，4，5，6，7天同一时间作相同检测。 根据吸光度值绘制细胞增殖曲线。
骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定
取融合至90%左右生长状态良好第3代骨髓 间充质干细胞，胰蛋白酶消化、室温离心、细胞 计数，调整待测样本细胞数为1×109 L-1，分 装至各PE管中，依次加入单克隆抗体CD44、 CD29、CD90、CD45、CD34、CD11b，每 管设立同型阴性对照组(对照组中不加任何抗体)。 常温避光孵育40 min，PBS冲洗细胞，细胞重 悬，经流式细胞仪检测分析。
结论
上述实验结果证实，体外分离培养的SD大鼠 骨髓细胞为纯度较高的骨髓间充质干细胞而非其 他造血谱系干细胞，并建立了一套简单、有效、 获得纯度较高的骨髓间充质干细胞分离培养、增 殖、鉴定的方法。传代至第3代时，可获得纯度 高、数量足、生物活性高的骨髓间充质干细胞， 为本研究课题进一步实验研究奠定了实践基础以 及提供了数量充足的种子细胞。
ຫໍສະໝຸດ Baidu 结果
刚接种于培养瓶的骨髓细胞大多数悬浮于培养液中，细胞呈圆形，大小不一。接种 24 h后开始贴壁，通过更换培养液，去除悬浮未贴壁细胞，48 h后贴壁细胞逐渐伸展为 梭形、多角形、不规则圆形，排列不规则(图1A)。7 d后，贴壁细胞显著增多，以小圆形 和梭形细胞为多，部分细胞排列趋于平行，部分成旋涡状生长(图1B)。第3代骨髓间充质 干细胞生长较原代细胞快，以梭形细胞为主(图1C)。细胞传代至第8代，细胞增殖活力未 见明显变化，主要以大而铺展的多形细胞为主(图1D)。
骨髓间充质干细胞多向诱导分化
取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，以 5×107 L-1接种于24孔板，待细胞贴壁生长融 合至70%-80%时，向各诱导孔中分别加入成 骨细胞诱导剂(含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维 生素C-2磷酸钠)，成软骨细胞诱导剂(含地塞米 松、转化生长因子β、维生素C)，成脂细胞诱导 剂(含地塞米松、胰岛素、吲哚美辛)。各诱导孔 定期换液，以未经处理的骨髓间充质干细胞培养 孔作为对照。
实验方法
1、骨髓间充质干细胞的原代分离及传代培养 2、骨髓间充质干细胞的形态学观察 3、骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制 4、骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定 5、骨髓间充质干细胞多向诱导分化
骨髓间充质干细胞的原代分离及传代培养
10%水合氯醛麻醉大鼠，经颈椎脱臼处死，大鼠全身浸 泡于体积分数为75%乙醇消毒30 min，于超净台无菌 操作下取其双侧股骨与胫骨，PBS冲洗，剪去骨两端干 骺端，用10 mL注射器吸取LG-DMEM培养液反复冲洗 骨髓腔，收集经细胞筛过滤后的细胞悬液，以1 000 r/min离心5 min。弃上清，以 1×109 L-1的细胞浓 度接种于25 cm2塑料培养瓶，置于37℃、体积分数为 5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。24 h后全量换液， 2，5 d分别半量换液，7 d全量换液。待培养瓶中细胞 分裂增殖80%-90%汇合单层时用1.5 mL TrypsinEDTA解离细胞，当细胞充分离散时，加入5 mL的含血 清培养基终止消化，离心细胞悬液，1 000 r/min离心 5 min。弃上清，加入含体积分数为10%胎牛血清的 LG-DMEM培养基，将重悬的细胞悬液以1∶2比例进行 传代。
省科学技术计划项目
主要内容
1.前言 2. 实验方法 3. 结果 4. 结论
前言
近来研究表明，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)不但具有来源广泛、易于获取、增殖迅速、可自体 移植、体外基因转染率高等特点，而且在不同诱导剂培养下可分别诱导分 化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞，神经细胞及肝细胞等已成为适合 组织和细胞移植的种子细胞，以及基因治疗的理想靶细胞。但在骨髓中骨 髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓有核细胞总数的0.001%-0.1%，如 何为组织和细胞移植及基因治疗提供数量充足、活性良好的骨髓间充质干 细胞成为国内外学者研究的重点。 依据骨髓间充质干细胞对塑料培养瓶具有黏附贴壁特性，实验采用贴 壁法，建立一套简单、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养 、增殖和纯化方法，观察其生长形态和生物学特性，验证其向成骨、成软 骨、成脂分化能力，为进一步研究骨髓间充质干细胞移植、基因治疗及组 织工程奠定实验基础。
流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞表dm 标记物的表达，结果显示：细胞均一 表达CD44、CD29、CD90，阳性率分别为99.69%、83.99%、95.05%，而 CD45、CD34、CD11b/c则呈阴性表达，分别为0.28%，0.62%，4.25%(图 2)。
经成骨诱导剂培养11 d后，细胞胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长， 细胞间可见钙质沉积，细胞结节中心的细胞融合失去细胞结构，钙结节形成 明显，经茜素红染色呈红色结节(图3B)；经碱性磷酸酶染色可见细胞外基 质有大量紫褐色沉淀，呈强阳性表达(图3C)；经vonkossa矿化染色可见 细胞聚集处有黑色固块，岛状分布，呈强阳性表达(图3D)。骨髓间充质干 细胞经成软骨细胞诱导剂培养21 d后，诱导而成的软骨细胞变大、变圆，表 面变的光滑，经甲苯胺蓝染色，可见胞质呈蓝色(图3E)。骨髓间充质干细胞 经成脂诱导剂培养19 d后，诱导而成的脂肪细胞脂质累积，脂滴数量增加并 相互融合，细胞由长梭形变为圆形、多边形，经油红O染色显示许多细胞的 胞浆内有大量脂质沉淀(图3F)。
骨髓间充质干细胞的形态学观察
取原代和第8代细胞，每日用倒置相差显微镜 观察其生长形态及特征并照相记录。取生长良好 的细胞于含10%二甲基亚砜的血清中冻存，2周 后复苏，锥虫蓝拒染实验检测死亡及存活细胞， 继续于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中培 养。
骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制
取第1，3代细胞，胰酶消化后计数，以 5×104个/孔接种于96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃，饱和湿度，体积分数为 5%CO2培养箱孵育2 h后，用酶联免疫检测仪 于450 nm波长下检测吸光度值。然后在检测第 1，2，3，4，5，6，7天同一时间作相同检测。 根据吸光度值绘制细胞增殖曲线。
骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定
取融合至90%左右生长状态良好第3代骨髓 间充质干细胞，胰蛋白酶消化、室温离心、细胞 计数，调整待测样本细胞数为1×109 L-1，分 装至各PE管中，依次加入单克隆抗体CD44、 CD29、CD90、CD45、CD34、CD11b，每 管设立同型阴性对照组(对照组中不加任何抗体)。 常温避光孵育40 min，PBS冲洗细胞，细胞重 悬，经流式细胞仪检测分析。
结论
上述实验结果证实，体外分离培养的SD大鼠 骨髓细胞为纯度较高的骨髓间充质干细胞而非其 他造血谱系干细胞，并建立了一套简单、有效、 获得纯度较高的骨髓间充质干细胞分离培养、增 殖、鉴定的方法。传代至第3代时，可获得纯度 高、数量足、生物活性高的骨髓间充质干细胞， 为本研究课题进一步实验研究奠定了实践基础以 及提供了数量充足的种子细胞。
ຫໍສະໝຸດ Baidu 结果
刚接种于培养瓶的骨髓细胞大多数悬浮于培养液中，细胞呈圆形，大小不一。接种 24 h后开始贴壁，通过更换培养液，去除悬浮未贴壁细胞，48 h后贴壁细胞逐渐伸展为 梭形、多角形、不规则圆形，排列不规则(图1A)。7 d后，贴壁细胞显著增多，以小圆形 和梭形细胞为多，部分细胞排列趋于平行，部分成旋涡状生长(图1B)。第3代骨髓间充质 干细胞生长较原代细胞快，以梭形细胞为主(图1C)。细胞传代至第8代，细胞增殖活力未 见明显变化，主要以大而铺展的多形细胞为主(图1D)。
骨髓间充质干细胞多向诱导分化
取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，以 5×107 L-1接种于24孔板，待细胞贴壁生长融 合至70%-80%时，向各诱导孔中分别加入成 骨细胞诱导剂(含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维 生素C-2磷酸钠)，成软骨细胞诱导剂(含地塞米 松、转化生长因子β、维生素C)，成脂细胞诱导 剂(含地塞米松、胰岛素、吲哚美辛)。各诱导孔 定期换液，以未经处理的骨髓间充质干细胞培养 孔作为对照。
实验方法
1、骨髓间充质干细胞的原代分离及传代培养 2、骨髓间充质干细胞的形态学观察 3、骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制 4、骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定 5、骨髓间充质干细胞多向诱导分化
骨髓间充质干细胞的原代分离及传代培养
10%水合氯醛麻醉大鼠，经颈椎脱臼处死，大鼠全身浸 泡于体积分数为75%乙醇消毒30 min，于超净台无菌 操作下取其双侧股骨与胫骨，PBS冲洗，剪去骨两端干 骺端，用10 mL注射器吸取LG-DMEM培养液反复冲洗 骨髓腔，收集经细胞筛过滤后的细胞悬液，以1 000 r/min离心5 min。弃上清，以 1×109 L-1的细胞浓 度接种于25 cm2塑料培养瓶，置于37℃、体积分数为 5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。24 h后全量换液， 2，5 d分别半量换液，7 d全量换液。待培养瓶中细胞 分裂增殖80%-90%汇合单层时用1.5 mL TrypsinEDTA解离细胞，当细胞充分离散时，加入5 mL的含血 清培养基终止消化，离心细胞悬液，1 000 r/min离心 5 min。弃上清，加入含体积分数为10%胎牛血清的 LG-DMEM培养基，将重悬的细胞悬液以1∶2比例进行 传代。