脂肪干细胞分离培养.pptx
干细胞ppt课件
形态特征
1)胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。
2)与胚胎外胚层和原始生殖细胞类似，而与ICM细胞不同。 3)细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖 体和线粒体，核型正常，保留整倍体性质。 (正常ES染色体正常，如异常则很难发育分化成动物个体)
干细胞教学
干 细 胞（stem cell）
在个体发育过程 中,具有自我复制能
力,并在一定条件下
分化形成多种类型 细胞的原始细胞称 为干细胞。
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。
干细胞的研究进展
1878：出现第一篇哺乳类的体外受精卵报导。 1959：完成第一例兔子的体外受精卵。 1960：展B.D.Bavister进行人体外受精研究。 1970：用畸胚瘤细胞注入鼠胚胎，制造镶嵌鼠进行发育研究。 1978：世界第一个试管宝宝 Louise Brown 在英国诞生。 1980：Candace Reed 成为澳洲的第一个试管宝宝。 1981：M.J.Evans 等体外培养老鼠的胚胎干细胞； Elizabeth Carr成为美国的第一个试管宝宝。
胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell,ESC） 指存在于早期 胚胎中，具有多 分化潜能和较长 期进行自我更新 的细胞。
1.胚胎干细胞系的建立
1998年美国科学家从人胚胎组织中培养出了干细胞株。 ◆James A. Thomson(Wisconsin) 人体外受精卵 囊胚 inner cell mass 细胞株 检测(marker 和酶活性) John D. Gearhart(Johns Hopkins) 5～9周人工流产胚胎 primordial germ cell 细胞株 检测
一、干细胞的基本特性
多呈圆形且具有不同生化标志; 能无限分裂(连续分裂几代或长时间静止) ；
脂肪干细胞实验报告
一、实验背景随着生物科技的发展，干细胞研究已成为医学领域的前沿课题。
脂肪干细胞（Adipose-derived Stem Cells，ASCs）作为一种易于获取、增殖能力强、多能性的干细胞，在组织工程、再生医学等领域具有广阔的应用前景。
本研究旨在探讨脂肪干细胞的分离、培养、鉴定及其在组织工程中的应用。
二、实验目的1. 探讨脂肪干细胞的分离、培养及鉴定方法。
2. 研究脂肪干细胞在组织工程中的应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：脂肪组织、DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、青霉素、链霉素、抗生素、鼠抗人CD105抗体、鼠抗人CD34抗体、鼠抗人CD29抗体、鼠抗人CD44抗体、鼠抗人CD45抗体等。
2. 实验仪器：超净工作台、倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、酶标仪、流式细胞仪等。
四、实验方法1. 脂肪干细胞的分离与培养（1）将脂肪组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，用DMEM/F12培养基清洗3次，去除多余脂肪。
（2）加入0.25%胰蛋白酶消化脂肪组织，37℃水浴消化30分钟，1000r/min离心5分钟，弃上清。
（3）加入DMEM/F12培养基重悬细胞，吹打均匀，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 脂肪干细胞的鉴定（1）采用免疫荧光染色法检测脂肪干细胞表面标志物CD105、CD34、CD29、CD44、CD45的表达。
（2）采用流式细胞术检测脂肪干细胞表面标志物CD105、CD34、CD29、CD44、CD45的表达。
3. 脂肪干细胞在组织工程中的应用（1）将脂肪干细胞接种于生物降解支架材料上，构建组织工程化脂肪组织。
（2）将组织工程化脂肪组织植入小鼠皮下，观察其成活情况。
五、实验结果1. 脂肪干细胞的分离与培养成功分离出脂肪干细胞，细胞呈梭形，生长旺盛。
2. 脂肪干细胞的鉴定免疫荧光染色和流式细胞术结果显示，脂肪干细胞表达CD105、CD34、CD29、CD44，不表达CD45。
脂肪间充质干细胞提取方法
脂肪间充质干细胞提取方法脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）是一种广泛存在于人体脂肪组织中的多潜能干细胞。
由于其易于获取、丰富来源以及多向分化潜能等优势，ADMSCs在再生医学和组织工程领域备受关注。
提取脂肪间充质干细胞的方法有多种，常用的包括机械消化法、酶消化法以及分离培养法。
本文将对这些方法进行介绍和比较。
1. 机械消化法机械消化法是一种较为简单直接的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用机械切割或研磨的方法将脂肪组织分解成小块。
接下来，使用胶原酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
2. 酶消化法酶消化法是一种常用的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用胰蛋白酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
消化过程中，酶能溶解脂肪细胞膜，并释放出脂肪间充质干细胞。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
3. 分离培养法分离培养法是一种较为复杂但效果较好的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，将脂肪组织切成小块，并加入胶原酶等酶类物质进行消化。
消化后，将细胞悬液进行离心分离，得到含有脂肪间充质干细胞的细胞沉淀。
接下来，将细胞沉淀进行过滤和洗涤，去除其他细胞和残留酶类物质。
最后，将脂肪间充质干细胞进行培养，促进其增殖和分化。
以上提取方法各有优劣。
机械消化法操作简单，但提取效率较低，且存在细胞破损的风险；酶消化法提取效率较高，但对酶的质量和浓度要求较高，且酶消化过程可能影响细胞活力；分离培养法提取效率较高，且可以得到纯度较高的脂肪间充质干细胞，但操作复杂且耗时较长。
为了获得高质量的脂肪间充质干细胞，提取过程中的无菌操作非常重要。
干细胞概述ppt课件
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干细胞是目前人类组织器官功能再生的唯一希望
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Part 1 干细胞
干 细 胞 （ Stem-cell ） 即 为 起
源细胞，是指尚未发育成熟的细胞， 它具有多分化潜能和自我复制的功能 ，在特定条件下，可以分化成不同的 功能细胞，形成多种组织和器官。
干细胞形态
干细胞分类
✓ 按分化能力可分为全能干细胞 (totipotent stem cells)、多能干细 胞 (pluripotent stem cells)以及单能干细胞 (unipotent stem cells) ；
以往认为，中枢神经系统的神经元在出生前或出生后不久，就失去再生能力。但近年的一些研究表明，成年哺乳动 物的脑组织仍可不断产生新的神经元，成人脑组织中同样存在NSC,主要是在侧脑室下层(SVZ)和海马齿状回两处。
目前多使用基因转移的方法，建立神经干细胞系，即诱导NSC的细胞周期不断循环往复，从而阻止其分化过程。永 生化的NSC具有较好的生物学特性，它们能自我复制并在体外大量增殖，在移植人体内后仍具有多向分化潜能，同 时可被转染并稳定地表达外源基因。
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神经干细胞
根据部位分类神经嵴干细胞(neural crest stemcell，NCSC)和中枢神经干细胞(CNS-SC)。
外周神经干细胞(PNS-SC)，既可发育为外周神经细胞、神经内分泌细胞和Schwann氏细胞，也能分化为色素细胞 (pigmented cell)和平滑肌细胞等。NSC一般是指存在于脑部的中枢神经干细胞(CNS-SC)，其子代细胞能分化成为 神经系统的大部分细胞。
两位科学家山中伸弥和汤姆斯共同获得诺贝尔医学奖
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不能神话也不能妖魔化干细胞
心脑血管疾病、恶性肿瘤、病毒性疾病、遗传病仍是医学领域4大生 命科学难题，目前全球治疗效果有限，干细胞也不例外。
脂肪干细胞的提取及鉴定(1)
红色的是参考同类实验所用的方法，比例，不知道在我们实验室可行不，黄色是疑问的地方，希望老师解答下谢谢一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM 重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
（前两周重点学习）3.2细胞原代培养：3.2.1操作步骤a．培养用品消毒后，安防在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
脂肪干细胞的分离培养、分化及其应用
脂肪干细胞的分离培养、分化及其应用摘要：脂肪干细胞（ADSCs）属于间充质干细胞，可以从脂肪组织中分离获得，具有多向分化能力，在不同诱导液诱导下，能够分化为多种细胞，应用于临床治疗中。
本文结合以往学者研究，针对ADSCs分离、分化以及应用展开研究。
关键词：脂肪干细胞；分离培养；细胞分化；易学应用前言：ADSCs是通过脂肪组织提取的MSCs，如今技术研究逐渐深入，分离提取ADSCs的方法逐渐完善。
目前常见酶消化法、胶原酶、机械分离以及悬浮培养法等多种方法，提取ADSCs需要关注试剂、冻存试剂、离心转速以及传代代数等多个方面。
凭借其分化优势，在临床研究中受到了极大关注。
1 ADSCs的分离培养提取ADSCs的方法有多种，但目前广泛使用吸脂术提取脂肪，在无菌环境中制作脂肪粒，将血管以及结缔组织剔除后，进行包膜。
使用Ⅰ型胶原酶在恒温环境中消化处理1h。
停止消化后，设定1800r/min离心速度，获取基质血管成分，使用过筛网过滤至培养皿中进行培养。
经过换液传代后，可以获得ADSCs样本。
冻存液配比1:4:5的DMSO：含胎牛血清培养液：胎牛血清，使用程序降温法冻存，保存温度为-80℃最好[1]。
2 ADSCs的分化ADSCs分化能力强大，在不同环境中，能够分化为不同胚层源细胞，分别为内胚层、中胚层以及外胚层。
2.1 内胚层第一，分化为肝细胞样细胞，通过无血清培养ADSCs后，使用HGF、烟酰胺以及bFGF 继续培养2周，可以促进ADSCs诱导为肝细胞样细胞。
使用HGF、FBS、FGF配置诱导液，经过3周诱导后，能够检测出肝细胞标志物，证明能够诱导为肝细胞样细胞。
第二，分化为胰岛细胞。
有学者使用烟酰胺、激活素、HGF等配置诱导液，进行ADSCs培养，经过15d诱导，可检测到胰岛素基因蛋白以及促进因子，证明成功诱导分化为胰岛样细胞[2]。
2.2 中胚层首先分化为心肌细胞，有研究指出，在氮杂胞苷的诱导下，可推动ADSCs分化为心肌细胞，由于氮杂胞苷也存在一定毒性，需要寻找有效试剂取代氮杂胞苷。
基础医学细胞生物学课件-干细胞
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MEDICAL CELL BIOLOGY
成体中枢神经系统的下脑室区、嗅 球、海马中存在NSC。
NSC的发现，为帕金森病等神经退 形性疾病、脊髓损伤的治疗及组织工程 中的细胞来源带来新的契机。
刘涌涛 生命科学技术系生物技术教研室
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MEDICAL CELL BIOLOGY
第三节 干细胞的医学应用及研究状况
一、干细胞的医学应用
（一）干细胞治疗的途径
刘涌涛 生命科学技术系生物技术教研室
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MEDICAL CELL BIOLOGY
（二）干细胞治疗的特点 1.一次性介入，永久性治疗； 2.不需要完全了解疾病发生的确切机
理； 3.可应用于自身干细胞移植，避免产
生免疫排斥反应。
胚胎干细胞系的建立过程
分离囊胚的内细胞群 分离胚胎生殖腺脊细胞
成体干细胞
与成纤维细胞共培养 ES细胞非分化增殖
胚胎干细胞的鉴定
功能细胞
定向诱导分化
刘涌涛 生命科学技术系生物技术教研室
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MEDICAL CELL BIOLOGY
2.鉴定
a. 具有正常稳定的二倍体核型和带型。 b. 具有较高的端粒酶及碱性磷酸酶活性。
积较小，核质比较大， 核中多为常染色质。 生化特点： a.具有较高端粒酶活性; b. 具 有 不 同 的 生 化 标 志 ： 角 蛋 白 15 、 nestin （ 巢 素蛋白）。
刘涌涛 生命科学技术系生物技术教研室
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MEDICAL CELL BIOLOGY
（二）干细胞的增殖特点
1.缓慢性
干细胞
刘涌涛 生命科学技术系生物技术教研室
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大鼠腹腔脂肪干细胞的分离培养及诱导成骨
酶 染色 为 阳性 ；成骨 诱导 ２ ８ ｄ后 ，茜素 红染 色 阳性 。提示 采用 多次 酶消 化法 得到 的大 鼠腹 腔源 性脂 肪 干 细胞 在体 外 易于 分离培 养 ，可 以稳 定传 代 。在一 定条件 诱 导下 ，可 以向成骨 细 胞分化 。采 用 以上方法 进 行脂 肪干 细胞 的 分离 培养可 以为组织 工程 提 供大量 、优 质 的种子 细胞 。
Ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ， ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ａ ｎ ｄ ｏ ｓ ｔ ｅ ｏ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ｄｉ ｆｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ａ ｄ ｉ ｐ ｏ ｓ ｅ － ｄ ｅ ｒ ｉ ｖ ｅ ｄ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ
２ ０１ ２ ０３
ｚ ｈ ａ ｎ ｈ ｏ ｎ ｇ ｓ ｈ ｅ ｎ ｇ ２ Ｏ １ Ｏ ＠
１ ６ ３． ｃ ｏ ｍ
干 细胞 ；脂 肪干 细胞 ；种 子细胞 ；分 离培 养 ；成骨 分化 ；诱 导 ；腹 腔 ；矿 化 结节 ；碱性 磷酸 酶 ；矫 形外 科 ；组 织工 程 ；国 家 自然 科 学基金 ；干 细 胞图 片文章
３ 以上 结 果为优 化 脂肪干 细胞 的培 养 方案 提供 了重要 的实 验依 据 ， 为 日后研 究药 物对 脂肪 干细 胞 的作用 机 制提 供 了 良好 的技术 方 法 。
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主任 医师 ，博 士生 导 师 ， 上 海市 中 医 药研 究 院骨伤 科研 究所 ，上 海市
中国组织工程研 究
第 ７ ７誊 第 ２ ３
２ ０ １ ３—０ ６—０ ４出版
．
Ｃｈｉ ｎ ｅｓ ｅ Ｊ ｏ ｕ ｎａ ｒ ｌ ｏ ｆ Ｔ ｉ ｓ ｓ ｕ ｅ Ｅｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅｒ ｉ ｎ ｇ Ｒｅｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｊ ｕ ｎ ｅ ４ ，２ ０１ ３ Ｖ ｏＩ ７ ７ ， Ｎｏ ． ２ ３