自噬双标腺病毒(mrfpgfplc3)使用指南1404知识讲解
【商品说明书】lc3荧光质粒说明书
lc3荧光质粒说明书1️⃣ LC3荧光质粒概述LC3（Microtubuleassociated protein 1 light chain 3）作为自噬体标记蛋白，在细胞自噬过程中发挥着关键作用。
LC3荧光质粒是一种将LC3基因与荧光蛋白（如GFP、RFP等）融合的重组质粒，通过转染细胞，可实时观察自噬体的形成、动态变化及数量，是研究细胞自噬机制的重要工具。
结构特点：LC3荧光质粒通常由启动子、LC3基因、荧光蛋白基因、终止子等元件构成，确保在目标细胞中高效、稳定地表达融合蛋白。
荧光标记：常用的荧光蛋白有绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）等，不同荧光标记便于多色成像及与其他标记物的共定位分析。
2️⃣ 构建与应用构建步骤：1. 设计并合成包含LC3基因与荧光蛋白基因的DNA片段。
2. 将该片段克隆至适当的载体中，如pcDNA3.1、pEGFPN1等，构建成重组质粒。
3. 通过酶切、测序等方法验证重组质粒的正确性。
4. 使用脂质体转染、病毒介导等方法将重组质粒导入目标细胞。
应用领域：1. 细胞自噬研究：通过监测LC3荧光信号的变化，评估自噬活性、自噬体形成速率及自噬溶酶体融合过程。
2. 药物筛选：利用LC3荧光质粒评估药物对细胞自噬的影响，筛选具有调节自噬功能的候选药物。
3. 疾病模型：在神经退行性疾病、肿瘤等自噬相关疾病模型中，研究自噬的病理作用及潜在治疗靶点。
3️⃣ 实验指南与注意事项实验准备：1. 确保细胞状态良好，避免转染前细胞密度过高或过低。
2. 选择合适的转染试剂，根据细胞类型调整转染条件。
实验操作：1. 转染后，根据荧光蛋白的表达时间，选择合适的时间点进行成像。
2. 使用共聚焦显微镜或流式细胞仪检测LC3荧光信号，注意调整成像参数以获得最佳图像质量。
3. 结合其他细胞生物学技术（如Western Blotting、透射电镜等）进行综合分析。
注意事项：1. 避免长时间暴露于强光下，以免荧光淬灭。
mcherry-gfp-lc3原理
mcherry-gfp-lc3原理
Mcherry-GFP-LC3是一种荧光标记蛋白，用于研究细胞自噬。
原理如下：
1. Mcherry是一种红色荧光蛋白，GFP是一种绿色荧光蛋白，它们都可以通过荧光显微镜观察。
2. LC3是一种微管相关蛋白3（Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3），参与调控和介导细胞自噬过程。
LC3有LC3-I和LC3-II两种形式，LC3-I是胞浆中的非结合形式，LC3-II是结合在自噬小体（autophagosome）膜上的形式。
3. Mcherry-GFP-LC3是将Mcherry和GFP两种荧光蛋白与
LC3一起融合而成。
在正常条件下，细胞中的自噬活性较低，Mcherry-GFP-LC3主要存在于胞浆中。
4. 当细胞启动自噬过程时，LC3-I会转化为LC3-II，并结合在自噬小体膜上。
由于GFP对酸性条件敏感，在自噬小体酸性环境中会逐渐失去荧光，而Mcherry对酸性环境不敏感，能够保持红色荧光。
5. 通过观察Mcherry-GFP-LC3的荧光表达，可以判断细胞是否在进行自噬。
当细胞开始自噬时，会出现红色和黄色（红色与绿色复合）荧光，而在胞浆中继续存在的Mcherry-GFP-LC3会呈现黄色荧光，表明自噬的早期过程。
当自噬小体与溶酶体融合后，酸性环境导致GFP的荧光丧失，只保留红色荧光，表明自噬已经发生。
综上所述，通过观察Mcherry-GFP-LC3的荧光表达变化，可以定量分析细胞中自噬的活性和过程。
mrfp-gfp-lc3自噬评判标准
mrfp-gfp-lc3自噬评判标准摘要：1.自噬概述2.mrfp-gfp-lc3 自噬评判标准的含义3.自噬在生物体中的功能4.mrfp-gfp-lc3 自噬评判标准的应用领域5.我国在mrfp-gfp-lc3 自噬评判标准研究方面的进展6.未来发展趋势与挑战正文：1.自噬概述自噬是细胞内一种重要的降解机制，通过吞噬并降解细胞内有害蛋白质、细胞器以及其他有害物质，维持细胞内稳态。
自噬过程分为四个阶段：招募、吞噬、融合和降解。
近年来，自噬在生物学和医学研究中受到广泛关注，与许多疾病的发生和发展密切相关。
2.mrfp-gfp-lc3 自噬评判标准的含义mrfp-gfp-lc3 是一种用于检测自噬过程的荧光报告系统，由mRFP-GFP 融合蛋白和LC3 蛋白组成。
mRFP-GFP 融合蛋白能够反映自噬泡的融合过程，LC3 蛋白则可以作为自噬体的标志物。
mrfp-gfp-lc3 自噬评判标准是基于这一荧光报告系统，通过对细胞内mRFP 和GFP 信号的动态变化以及LC3 puncta 的形成来评估自噬的活性和效率。
3.自噬在生物体中的功能自噬在生物体中具有多种功能，包括维持细胞内稳态、降解有害蛋白质、细胞器的更新与维护、抵抗外部压力以及调控细胞生长和死亡等。
自噬异常与许多疾病的发生和发展密切相关，如神经退行性疾病、肿瘤、免疫疾病等。
4.mrfp-gfp-lc3 自噬评判标准的应用领域mrfp-gfp-lc3 自噬评判标准广泛应用于生物学和医学研究中，包括自噬调控机制的研究、药物筛选、疾病模型的建立以及治疗策略的开发等。
通过这一评判标准，研究人员可以快速、准确地评估自噬活性和效率，为进一步研究自噬在生物体中的作用提供便利。
5.我国在mrfp-gfp-lc3 自噬评判标准研究方面的进展近年来，我国在mrfp-gfp-lc3 自噬评判标准研究方面取得了显著进展，不仅在实验技术上不断优化，而且在自噬调控机制、疾病模型以及治疗策略等方面取得了突破。
lc3双荧光自噬流原理
lc3双荧光自噬流原理LC3双荧光自噬流原理是指通过标记LC3蛋白的N端和C端分别与绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）结合，来研究细胞中的自噬过程。
自噬是一种细胞内垃圾清除机制，可以通过分解细胞内受损或老化的蛋白质、细胞器和长链脂肪酸等细胞成分，提供新的营养物质和能量。
理解自噬的调控机制和功能对于许多疾病的研究具有重要意义。
LC3（Microtubule-associated protein light chain 3）蛋白是自噬过程中的一个关键分子，它可以作为自噬小体的特异性标记物。
在自噬过程中，LC3蛋白从非修饰形式（LC3-I）转化为修饰形式（LC3-II），并参与自噬小体的形成和界定。
LC3双荧光自噬流技术就是通过标记LC3蛋白的N端和C端分别与GFP和RFP结合来追踪自噬小体的形成和变化。
LC3蛋白有两个酶解位点，分别是Glycine120和Glycine121。
在绝大多数正常生理条件下，LC3蛋白主要以非修饰形式存在于细胞质中，称为LC3-I。
LC3-I分子上的Glycine120位点和Glycine121位点上含有一个负电荷的C-末端甘氨酸。
当自噬通路被激活时，LC3-I分子的C-末端甘氨酸被肌酸激酶ATG4剪切，形成一个临时的中间体LC3-I-PE （LC3-半胱氨酸乙酰乙酸胺酰酶）。
LC3-I-PE分子会进一步和自噬小体膜结合，形成LC3-II分子。
LC3-II通过与自噬小体膜相互作用，将自噬小体界定在特定的细胞区域，并参与自噬小体的形成和降解进程。
LC3-II分子富集在自噬小体内，是自噬小体的特异性标记。
因此，观察LC3-II的表达水平和荧光变化，可以反映自噬小体的形成和变化。
LC3双荧光自噬流技术就是通过将LC3-GFP和LC3-RFP融合蛋白导入细胞中，使它们定位在细胞质，并随后转变为LC3-II形式进入自噬小体。
在正常情况下，LC3-GFP和LC3-RFP会同时发放绿色和红色荧光。
自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)使用指南
自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。
目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP（-RFP）-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。
近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流)的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。
这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。
mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作收到病毒后的处理（一）、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。
（1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进行分装；（2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存（尽量一周内用完）。
2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）。
建议不要在-20℃下长期保存。
如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。
3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品（购买时请提出）。
EGFP-mRFP-LC3稳转细胞株构建服务
mRFP-EGFP-LC3稳转细胞株构建服务质粒来源：Addgene # 21074 ( 载体pEGFP-C1+mRFP；插入基因Rat LC3B，GenBank ID: U05784 )背景：自噬为机体在亚细胞水平的“自我吞噬”，可以帮助细胞维持自身稳态及适应应激环境。
近年来，自噬已成为生物学领域中的一个研究热点。
迄今研究发现，自噬可以参与多种疾病的发生发展，例如肿瘤，心血管疾病，神经退行性疾病等。
因而，自噬在各类相关疾病研究中作为药物筛选靶点越来越受关注和讨论。
自噬研究的基础是有效地观察，定量细胞中自噬的发生。
而目前应用较为广泛的自噬检测方法为观察GFP-LC3荧光斑，细胞正常生理环境LC3呈弥散状分布，自噬激活时LC3会转移至自噬囊泡上，因此，GFP荧光的弥散或斑点状聚集可以比较准确的反应细胞状态。
由于分子生物学的发展，现在已经诞生了mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系，用于标记及追踪LC3以及自噬流的变化。
其中GFP是酸敏感型GFP蛋白，而mRFP是稳定的荧光表达基团，不受外界影响。
由于自噬小体进入第二阶段后，与溶酶体进行融合，形成自噬溶酶体。
自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境，可以导致PH下降，GFP淬灭，因此，GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度，GFP越少，则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。
反之，自噬小体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻。
mRFP是一直稳定表达的，因而可以通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流进程。
优点：mRFP-EGFP-LC3稳转细胞株可以稳定持续的表达mRFP-EGFP-LC3，能够有效地解决瞬转实验的效率低、周期长、操作繁琐、不稳定等问题，有利于保证实验结果稳定性与可重复性。
mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系的出现，把自噬研究带入了一个新的阶段，自噬不再只是指标，而是一种机制，自噬流的顺畅与否，对于细胞生理功能的稳定非常关键。
mrfp-gfp-lc3自噬评判标准
mrfp-gfp-lc3自噬评判标准
MRFp-GFP-LC3是一种用于评判细胞自噬活性的标识物。
LC3（Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3）是自噬过程中的一个关键蛋白，其选择性地在自噬过程中结合于自噬囊泡膜上。
MRFp-GFP-LC3是一种融合蛋白，将MRFp和GFP 与LC3融合在一起，可以通过观察细胞内自噬囊泡膜上的MRFp-GFP-LC3信号来定量细胞的自噬活性。
评判标准：
1. 自噬囊泡膜的形成：正常情况下，细胞内的MRFp-GFP-LC3表达时呈现为一个均匀分布的绿色荧光信号。
当自噬过程发生时，MRFp-GFP-LC3会在囊泡膜上形成点状或环状的荧光信号。
观察细胞中是否出现这些点状或环状的信号，可以评判自噬囊泡膜的形成。
2. 自噬囊泡膜的积累：正常情况下，自噬囊泡会在细胞内迅速融合并降解其内的物质。
当自噬的降解过程受到抑制时，自噬囊泡膜会在细胞内积累。
通过观察细胞内的MRFp-GFP-LC3信号，如果发现大量的点状或环状信号积累在细胞内，可以判断自噬囊泡膜的积累。
3. 自噬囊泡膜的降解：除了观察自噬囊泡的形成和积累，还可以评判自噬囊泡膜的降解。
在自噬降解过程中，MRFp-GFP-LC3会被酸性的自噬溶酶体降解，荧光信号会减弱甚至消失。
通过观察细胞内的MRFp-GFP-LC3信号的强度变化，可以评判自噬囊泡膜的降解情况。
综合以上几个方面的观察和判断，可以评判细胞的自噬活性。
需要注意的是，不同细胞类型和研究对象的自噬特征可能有所差异，因此在进行自噬评判时，还需结合其他相关实验和标记物的结果进行综合分析。
双荧光mRFP-eGFP-LC3体系在细胞自噬中的作用
２结果
２．１
ＬＣ３蛋白及ＬＣ３．ＩＩ／ＬＣ３一Ｉ比值 雷帕霉素处理ＨＥＫ２９３细胞后，ＬＣ３一ＩＩ蛋白及
ＬＣ３一ＩＩ／ＬＣ３－Ｉ比值均增加，并呈浓度依赖性，见图１。
３１１０系列ＩＩ Ｃ０２培养箱、ＡＭＧ
ＥＶＯＳ
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微镜、Ｓｏｎｉｃｓ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓ超声波破碎仪、Ｔｈｅ珊ｏ
ｅｎｔｉｆｉｃ
ＢＣＡ蛋白测定试剂盒、Ｂｉｏｔｅｋ Ｅｐｏｃｈ酶标仪 ＨＥＫ２９３细胞培养
以及ＢＩＯ—ＲＡＤ电泳仪和转膜仪。
１．２
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ｆｅｅｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｄｓ．ｇｒｅｅｎ ｓｐｏｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｒａｐａｍｙｃｉｎ ｔｒｅａｔｅｄ ＨＥＫ２９３ ｃｅｌｌｓ；ｗｈｉｌｅ ｆｏｒ ｍＲＦＰ－ｅＧＦＰ— ＬＣ３ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．ｇｒｅｅｎ ａｎｄ ｒｅｄ ｓｐｏｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｒａｐａｍｙｃｉｎ ｔｒｅａｔｅｄ ＨＥＫ２９３ ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕ． ｓｉｏｎ：Ｄｕａｌ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍＲＦＰ—ｅＧＦＰ—ＬＣ３ ｉＳ ｓｕｐｅｒｉｏｒ
ｈ，
再以雷帕霉素（２００ ｎｍｏｌ／Ｌ）处理３ ｈ，４００倍荧光 显微镜观察细胞内红色和绿色ＬＣ３亮点变化，随 机选取３００个细胞拍照，包括红色荧光图、绿色荧 光图，重复３次，取平均值。 １．６统计学分析 采用ＳＰＳＳ １３．０软件进行分析，两组数据之间 的比较采用ｔ检验，Ｐ＜０．０５表示差异有统计学差
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自噬双标腺病毒( mRFP-GFP-LC3 )使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食(Self-eating )”的现象，凋亡是“自杀( Self-killing )”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜(目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层)包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。
目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3勺剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP(-RFP) -LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。
近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技(上海)有限公司自主研发了用于实时监测自噬( 流)的mRFP-GFP-LC腺病毒，mRFP用于标记及追踪LC3, GF啲减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GF荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭, 此时只能检测到红色荧光。
这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。
mRFP-GFP-LC3 腺病毒的操作收到病毒后的处理（一）、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。
（1）、收到病毒液后如未融化请置于-80 C冰箱，下次使用时再进行分装；（2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80 C冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4C保存（尽量一周内用完）。
2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）。
建议不要在-20 C下长期保存。
如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。
3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品（购买时请提出）。
（二）、腺病毒的稀释需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，使用培养目的细胞用PBS 或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后 4 C保存，并尽快用于实验（尽量一周内用完），动物实验建议使用注射用平衡液来稀释，并尽快用完。
感染目的细胞由于腺病毒是自主复制性基因载体，不能插入基因组稳定遗传，因此实验中细胞感染腺病毒的实验需要具体情况具体对待。
一般根据外界刺激处理的时间来选择感染腺病毒的时间，短时程处理（一周之内）建议先感染腺病毒之后再进行处理，长时程刺激的建议在刺激结束前2~3天进行腺病毒感染。
另外不同细胞的MOI不同，所以在将病毒感染正式感染目的细胞前，需要做一个预实验以确定目的细胞中加入的病毒数。
（一）细胞准备将状态良好的目的细胞接种到24孔板,使细胞浓度为1 x 105/ml 细胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%直接。
（二）病毒感染I、贴壁细胞由于该病毒感染后续拍照需要进行自噬小点的计算，因此需要在高倍镜下拍照，条件允许最好使用共聚焦显微镜拍照，此时需要把细胞铺被在玻片上面（部分细胞铁壁能力不是很强，此时需要预先在玻片上包被galetin甚至laminin ）。
感染实验在1/2体积培养液感染（详见下表格）。
加入的病毒量范围在MOI=20-50内（具体感染的操作量参见附录表格），每个MOI值加两个孔2小时后换液。
II、悬浮细胞上面介绍的是针对贴壁细胞的感染方法，若是悬浮或半悬浮细胞，则需要通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培养皿后，封好口，放入平角离心机后，低速离心1h,然后放入培养箱中正常培养即可。
若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入适量的病毒液，室温放置10min （不能超过半小时），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染至2小时后换液即可。
（三）观察感染情况感染24小时后，可以开始观察到GFP以及RFP表达，36-48小时可以进行细胞固定、圭寸片（需要使用防淬灭的固定剂）、拍照分析。
（四）结果分析mRFP-GFP-LC串联荧光蛋白腺病毒中表达的GFF和mRF用于标记及追踪LC3 GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体（由GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭，此时只能检测到红色荧光，原理如下图所/示）。
LysosomeSuppression at early统计方法我们在显微镜成像后红绿荧光merge后通过merge后出现的黄色斑点即只是自噬体.红色的斑点指示自噬溶酶体，通过不同颜色斑点的计数可以清晰的看出自噬流的强弱：一般统计采用人为计数的方法，也就是统计叠加（overlay ）之后黄色斑点和红色斑点的数目，然后做出bar图。
如下图：细胞转染mRFP-GFP-LC病毒后给予氨基酸剥夺处理2小时后出现明显增强的自噬以及自噬流（通过merge后的红色小点明显增多可以判定自噬流水平升高）。
Antioxid Redox Signal 14(11): 2179-2190.实验操作注意事项1、 操作病毒时请尽量使用生物安全柜；2、 操作时需戴上帽子，佩戴双层手套，双层口罩；3、 病毒操作中绝对禁止在安全柜内有任何皮肤直接暴露的情况；4、 剩余的病毒和接种用的注射器等耗材需高压灭菌后才能扔弃；5、 操作完毕要及时用肥皂和水洗手消毒；6、 未尽事宜请咨询汉恒生物技术人员了解详情，汉恒生物全国免费 热线 400-092-0065 ；50-1GFP dots mRFP dots Overlay1■ mRFPControl AADJI 41:■_ o ControlAADC_J Autophagosomes {Yellow dotsHcell ■ Autolysosomes (Free red dots)/cel1昕屮Luo呂B E7、您可登录汉恒生物官网观看腺病毒实验操作视频，并与我们的客服人员互动交流。
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