脱毒苗培育
植物脱毒技术
第一节 脱毒方法
一、茎尖培养脱毒 （一）茎尖培养脱毒原理 1、病毒在植物体内的分布
越靠近茎顶端区域的病毒，其感染深度越 低，生长点(约0.1～1.0mm区域)则几乎不含 或含病毒很少。离尖端越远病毒浓度越高。
无病毒苗的保存 隔离保存：种植于防虫网室 长期保存：
低温保存：茎尖或小植株培养基。19℃低温低光照，6-12月更换培养基。
冷冻保存：用液氮（-196℃）。
无病毒苗的繁殖 嫁接繁殖 扦插繁殖 压条繁殖 匍匐茎繁殖
本章小结
去除植物病毒的方法:热处理法、微茎尖培 养法、愈伤组织培养法和茎尖微体嫁接法。
2
花药脱毒
1974年日本大泽胜次首次发现，草莓 花药培养可产生无病毒植株。
草莓花药培养脱毒率高于茎尖脱毒 率，一般可达80%以上。
三、理化方法脱毒
1、物理方法： 高温处理，又称温热疗法。35-40℃一些病
毒钝化失活。 低温处理，又称冷疗法。5℃处理4-7个月
2、化学处理 病毒抗血清预处理 RNA合成抑制剂处理 病毒唑处理
2、取茎尖与接种
取芽放在无菌的垫有滤纸的培养皿中，在 解剖镜下，用刀剥去幼叶，露出生长点。 带1-3个叶原基的茎尖作外植体（约0.30.5mm。使用培养容器以保湿性好的为宜。
1
3、培养 25℃左右；10-16h/d， 1500—50001x，2-3个月长绿点
4、生根诱导 2-3cm高的无根苗——生根培养基， 1-2个月生根
法之一。
四、分子生物学鉴定法
双链RNA法（dsRNA） 互补DNA（cDNA）检测法
植物组培脱毒技术及在花卉上的应用
组织培养技术在名贵花卉上的应用前景摘要：综述了组织培养技术的形成、研究进展、意义及其应用植物组培脱毒技术的培养条件，并重点阐述了组织培养方法及其在名贵花卉上的应用以及病毒检测的重要性，最后浅析了组织培养技术存在的问题及展望。
关键词：组织培养；名贵花卉；应用；病毒检测；前景1组织培养技术概述1．1组织培养技术的形成危害植物的病毒、植物菌原体、类细菌有几百种，果树、花卉、蔬菜等植物病毒也不下500多种，绝大多数植物种类是靠无性繁殖的，由于病毒通过无性繁殖传递，在母体内逐代积累，种性退化严重，表现为植物生长受到抑制，形态畸变，产量下降，品质变劣，严重时只好拔除病株，因而造成很大经济损失，而目前生产上对病毒病的防治尚无特效药物。
自从2O世纪5O年代发现通过植物组织培养的方法，可以脱除严重患病毒病植物的病毒，恢复种性，提高产量、质量，组织培养脱毒技术便在生产实践中得到广泛应用，且有不少国家已将其纳入常规良种繁育体系，有的还专门建立了大规模的无病毒苗生产基地。
1．2组织培养技术研究进展white于1943年首先发现，在感染烟草花叶病毒的烟草植株生长点附近病毒的浓度很低，甚至没有病毒，并且病毒的含量随植株部位和年龄而异。
Morel等在这个启示下，于1952年利用感染花叶病毒的大丽菊茎尖分生组织培养，得到了无毒植株。
自1952年以来，通过茎尖分生组织培养或热处理与分生组织培养结合的方法获得成功的实例有100余种，其中最成功的实例之一是马铃薯的脱毒培养Ⅲ。
随着植物细胞培养技术的发展，2O世纪5O年代末通过愈伤组织培养脱毒获得成功。
7O年代初植物原生质体培养成完整的植株，为利用原生质体培育无毒植株提供了可能性。
1975年Shepard_5 通过对瘟染病毒的烟草原生质体的培养得到了无毒植株。
1972年Navarro等将果树嫁接方法与茎尖分生组织培养法两者有机结合，创立了一种新的植物组织培养脱毒技术，即茎尖显微嫁接法。
脚板薯(Dioscorea batatas Decne.)脱毒试管苗培育及其试管珠芽诱导
脚板薯（Dioscorea batatas Decne.）脱毒试管苗培育及其试管珠芽诱导本试验以江西上高产的脚板薯为材料，采用植物组织培养和石蜡切片等技术，分别对脚板薯脱毒苗培育、脱毒脚板薯基础苗扩繁、试管珠芽诱导及诱导过程中珠芽的发育解剖学和生理生化变化进行了研究。
为脱毒脚板薯试管珠芽的工厂化生产提供理论依据和关键技术。
以脚板薯无菌苗为材料，研究了高温及病毒化学抑制剂预处理结合茎尖培养技术对脚板薯脱毒效果的影响。
结果表明：脚板薯茎尖大小与存活率呈正相关，与脱毒率呈负相关；单一的脱毒处理技术难以完全去除病毒，2种或3种技术的组合使用可有效的去除马铃薯Y病毒(PVY)、烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)，与对照组相比，高温和病毒唑结合高温预处理，脱毒率分别提高20％和40％。
用脱毒苗茎段培养建立了脚板薯基础苗扩繁体系。
结果表明：茎节增殖培养的最佳培养基为MS+NAA 0.8 mg／L+6-BA 0.8 mg／L；诱导茎段形成丛生芽的最佳培养基为MS+NAA 0.5 mg／L+6-BA 4.0 mg／L+烯效唑3.0 mg／L+蔗糖4.0％。
采用固液双层培养方式，研究了不同因子对脱毒脚板薯试管珠芽诱导的影响。
结果表明：蔗糖浓度8％、光照8h／d对试管珠芽形成及膨大较好：谷氨酰胺为氮源时，对试管珠芽膨大有显著促进作用；一定配比的6-BA和NAA有利于珠芽诱导，其中以6-BA 2.0 mg／L+NAA 0.5 mg／L为好。
脱毒脚板薯试管珠芽发生于叶腋处，由表皮下的第二、三层细胞脱分化，分裂形成珠芽原基，进一步发育成珠芽。
在珠芽顶端分生组织下方存在初生加厚分生组织，其细胞分裂及其衍生细胞体积增大是珠芽早期膨大的主要原因。
随着珠芽的生长发育，初生加厚分生组织可衍生为次生加厚分生组织。
成熟珠芽的膨大主要是次生加厚分生组织细胞分裂和细胞体积增大的结果。
成熟珠芽由叠生木栓、次生加厚分生组织、基本组织及散生于其中的有限外韧维管束组成，其淀粉和蛋白质主要积累在维管束四周的薄壁细胞中。
五种处理对奶油草莓组培苗脱毒效果的影响
李国树，徐成东，王振吉，等 五种处理对奶油草莓组培苗脱毒效果的影响
茎尖脱毒培养、指示植物等对草莓脱毒效果进行 研究，为奶油草莓脱毒苗生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料 取于楚雄市白沙冲草莓园连作线的 草莓植株，叶片带有斑驳皱缩、含有病毒奶油草莓 （Strawberry of cream.cv.）。 1.2 方法 取连作 3 年、叶片带有斑驳皱缩、含有 病毒的 2 y 生奶油草莓衰老叶片作为外植体。外 植体经消毒后接种于愈伤诱导、茎叶分化和生根 培养的培养基中，经 65 d 培养成带病毒的草莓试 管苗后，再进行以下研究。 1.2.1 微茎尖培养脱毒 借助体视显微镜，剥取 不同长度带 1~3 个叶原基的茎尖进行接种。每瓶 接种 3 个微茎尖、4 瓶重复，共 12 瓶进行培养。 1.2.2 昼夜变温处理脱毒 在参照超低温保存 和植物昼夜交替生物钟改变的基础上，建立昼夜 温差培养，筛选奶油草莓脱毒效果最佳的昼夜温 差组合，设立试验如下：A1，白天 4℃，晚上 25℃， 连续处理 2 周；A2，白天 25℃，晚上 4℃，连续处 理 2 周。 1.2.3 试管苗三氮唑核苷处理脱毒 已培养 65 d、体内带病毒的幼嫩试管苗为外植体，接种于含 有 三 氮 唑 核 苷（设 0 mg/L、5 mg/L、l5 mg/L、25 mg/L、35 mg/L，5 个浓度梯度）的基础培养基 1/2 MS + 6-BA 0.2 mg/L + IBA 2.0 mg/L 上生根诱导。 切取奶油草莓试管苗 0.3~1.0 cm 长的茎尖接种于 5 种培养基上，每种培养重复 3 瓶，观察记录生长 情况，统计成活率。30 d 后，将生根较明显，根系 发达的试管苗进行移栽 1~2 周左右，观察其外部 形态、长势并且采用指示植物涂抹法进行脱毒效 果检测。 1.2.4 高 温 处 理 脱 毒 分 别 设 置 恒 温 水 浴 锅 40℃、45℃、50℃梯度；早上处理 3 h，下午处理 3 h，晚上组培室正常培养，连续处理 3 d；处理完后 剥取茎尖接种到生根培养基：1/2 MS + 6-BA 0.2
第五节 植物脱毒技术
液摩擦
汁液和金刚砂
至于 温室中
2-6天 观察
出现枯斑 有病毒 没有出现 不含病毒
1.检测方法
嫁接法： 适用于木本多年生果树和草莓、甘薯等
无性繁殖的草本植物，采用汁液接种法比较 困难，通常采用嫁接接种的方法，以指示植 物作砧木，被检测植物作接穗，可采用劈接、 靠接、芽接等方法嫁接。
2.对指示植物的要求
3.指示植物检测法的优缺点
(1)优点：条件简单，操作方便，是一种经济 有效的检测方法，所以大多数植物检测用指 示植物检测法。
(2)缺点：不能测出病毒总的核蛋白浓度，而 只能测出病毒的相对感染力。
（三）抗血清检测法
抗体是动物在外来抗原的刺激下产生的 一种免疫球蛋白，抗体主要存在于血清中，含 有抗体的血清即称为抗血清。
2、用于自然繁殖极易感染病毒的植 物，如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、
石竹、百合等。
3、用于有性繁殖变异范围大而自 然条件下又不易无性繁殖的植物，
如非洲菊、紫罗兰等。
谢 谢 ！
用自来水冲洗干净，在75%酒精中浸泡30秒左右，用1% 次氯酸钠或5% ～ 7%的漂白粉溶液消毒10 ～ 20min，最 后用无菌水冲洗材料4 ～ 5次。
（3）、茎尖剥离和接种 将已消毒的芽放在带滤纸的培养皿上 解剖镜下剥去幼叶 切下带1～2个叶原基的生长点（0.2～0.5mm） 切下的茎尖转至培养基上（顶部向上）。
（2）培养条件：在茎尖培养中，光下培养的效果
通常比暗培养效果好。
（3）外植体的生理状态：茎尖最好从活跃生长
的芽上切取，一般地培养顶芽茎尖比培养腋芽茎尖 效果好。
4.茎尖培养脱毒的特点：
❖ ﹙1﹚脱毒效果好 ❖ ﹙2﹚后代遗传性稳定
所以是目前生产无病毒苗最安全、 最重要的一条途径。
草莓种苗脱毒苗与组培苗的区别
近两年草莓行情都比较好，有些老板挣到了钱，有些老板却亏了钱，很大原因是草莓种苗质量不行，很多种植多年的种植户买草莓种苗都感觉买草莓苗就像买彩票，运气好就能买到满意的种苗，运气不好今年可能补几茬草莓苗还是死苗。
为了提高草莓种苗品质和抗病能力，市场上脱毒种苗这几年逐渐多起来。
脱毒草莓种苗在生产上表现出生长势健壮、花序抽生能力强、抗病性强、畸形果率少、亩产量高等特点，能够极大的提高草莓种植经济效益。
那今天我们来看一看，什么样的种苗是脱毒苗。
首先我们来看看什么是草莓脱毒苗？脱毒草莓是取其分生区细胞先脱分化成具有全能性的愈伤组织，然后进行体外细胞培养，长成植株后再种。
草莓脱毒苗的培养方法：热治疗法、花药培养法和茎尖培养法。
草莓脱毒苗和草莓组织培养苗不同，在处理技术难度上差异很大。
草莓脱毒苗是以脱毒为目的，采用热处理分生组织培养的高技术手段，在无菌条件下切取0.2毫米大小的生长点，在特定的启动培养基上培养。
由于切取的生长点很小，培养的难度大，在最佳启动培养基上经过2个月的培育，才仅有少量生长点能长出无病毒的愈伤组织。
然后将愈伤组织接种在繁殖培养基上，1个月后才能长出丛生芽。
丛生芽再经转代和生根培养基培育后才能获得试管苗，试管苗还需要经过多次反复病毒鉴定，确认已经把草莓体内的病毒彻底去除后，才能加速繁殖出大量试管苗，并进一步繁殖出原种大苗，供生产上推广应用。
用茎尖培养法进行无病毒苗的培育，是目前世界上获得草莓无毒苗最普通且最有效的方法。
我们再来看一下草莓组培苗是什么呢？草莓组培苗草莓组培苗仅仅是应用组织培养技术进行草莓的加速繁殖。
在操作处理上，只要用草莓的顶芽、叶片、叶柄接种在合适的培养基上都可以培养出试管苗。
由于切取的材料大，一般均在1毫米以上，因此培养容易成功。
接种在一般的培养基上1个月就能长出丛生芽和试管苗。
培养成功率很高。
由于技术难度小，只要具有组织培养基本设备的单位都能进行草莓的组织培养工作，获得组织培养苗。
《植物组织培养技术》 讲义
《植物组织培养技术》讲义一、植物组织培养技术的概述植物组织培养技术是一种在无菌条件下，将植物的离体器官、组织或细胞培养在人工配制的培养基上，使其发育成完整植株的技术。
这项技术具有广泛的应用，包括植物快速繁殖、品种改良、脱毒苗培育、基因工程等领域。
植物组织培养技术的发展可以追溯到 20 世纪初。
经过多年的研究和实践，如今已经成为植物生物技术领域的重要手段之一。
二、植物组织培养技术的基本原理植物细胞具有全能性，即每个植物细胞都包含着该物种的全部遗传信息，在适宜的条件下，具有发育成完整植株的潜能。
在组织培养过程中，通过调节培养基的成分、激素的种类和浓度，以及环境条件（如温度、光照等），可以诱导植物细胞脱分化形成愈伤组织，再经过再分化形成芽、根等器官，最终发育成完整的植株。
三、植物组织培养的基本流程1、外植体的选择与消毒外植体是指用于组织培养的植物材料，如茎尖、叶片、茎段、花药等。
选择生长健壮、无病虫害的外植体，并进行严格的消毒处理，以去除表面的微生物。
2、培养基的制备培养基是植物组织培养的重要物质基础，通常包含大量元素、微量元素、有机成分、植物生长调节剂等。
根据不同的培养目的和植物种类，需要配制不同成分和比例的培养基。
3、接种在无菌条件下，将消毒后的外植体接种到培养基上。
接种过程要迅速、准确，避免外植体受到污染。
4、培养将接种后的培养物放置在适宜的环境条件下进行培养。
培养条件包括温度、光照、湿度等。
在培养过程中，要定期观察培养物的生长情况，并及时处理出现的问题。
5、继代培养当培养物生长到一定阶段后，需要进行继代培养，即将其转移到新的培养基上，以促进其生长和增殖。
6、生根与移栽当培养物分化出芽和根后，进行生根培养，待根系发育良好后，将植株移栽到土壤中，使其适应自然环境。
四、植物组织培养中的关键技术1、无菌操作技术无菌操作是植物组织培养成功的关键。
在整个操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，对实验器具、培养基、外植体等进行彻底的消毒，防止微生物的污染。
组织培养第九章植物脱毒技术
全世界已发现植物病毒有近788种。 病毒的危害： 组织和细胞病变 新陈代谢等生理机能受到干扰 外观表现不正常状态 由于危害可通过营养体传给后代，病毒对寄 主植物可造成毁灭性危害，导致大幅度减产， 甚至全株死亡。世界作物生产中，病毒危害程 度仅次于真菌。
危害一些植物的病毒数目
植物种 类
菊花 康乃馨
应用植物脱毒技术意义 植物脱毒技术可使植物恢复原来优良特性，
生长势增强，明显提高产量、改善品质，产 量的提高幅度最高可达300%。
植物脱毒技术不仅脱除了病毒，还可以去 除多种真菌、细菌及线虫病害，使种性得以 恢复，植株生长健壮，减少肥料和农药施用 量，降低生产成本，保护了环境
第一节 脱毒方法
一、茎尖培养脱毒 （一）通过茎尖培养脱毒的原理
水仙 唐菖蒲 风信子
月季
感染病 毒种类
19 11 4 5 3 10
植物种 类
矮牵牛 百合
马铃薯 大蒜 豌豆 樱桃
感染病 毒种类
5 6 17 24 15 44
植物种 类
苹果 柑橘 葡萄 草莓
桃 梨
感染病 毒种类
36 23 26 24 23 11
所谓脱毒就是采用一定的方法除去植物 体内病毒的技术。
无病毒苗：指不含该种植物的主要危害 病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存 在表现阴性反应的苗木。
一些常见病毒病引起的可见病症
症状
病毒病名称
症状 病毒名称
褪绿、黄 化
小麦黄矮病
斑点 十字花科黑斑病
花叶、斑 烟草花叶病、菜豆花叶病、 猝倒、棉花立枯病、瓜苗猝
驳
黄瓜花叶病
立枯 倒病、水稻烂秧病
溃疡 枯死 穿孔
杨树溃疡病、柑桔溃疡病， 番茄溃疡病