1、免疫细胞的分离与检测解析
免疫细胞的分离技术
免疫细胞的分离技术概述免疫细胞分离技术是生物医学领域中的一项基础技术，它通过对免疫细胞的表面标记进行特异性识别，从而将不同类型的细胞进行有效的分离。
免疫细胞的分离技术在很多疾病的检测、治疗和研究中起着至关重要的作用，如肿瘤学、免疫学、细胞学等领域。
原理免疫细胞的分离技术主要是基于免疫受体（antigen）和特异性抗体之间的作用机制，该过程通常包括三个步骤：细胞表面标记的贴附、特异性抗体的结合和分离。
细胞表面标记的贴附细胞表面标记是指细胞表面上的蛋白或其他化合物，它们能够被抗体所识别。
免疫细胞分离技术中常用的细胞表面标记主要有细胞抗原（cell surface antigen）、细胞特异性蛋白质（cell type-specific protein）等。
特异性抗体的结合特异性抗体是指能够特异性识别并结合到目标物质的抗体。
在免疫细胞分离技术中，特异性抗体与目标细胞表面标记结合后，形成免疫复合物（immunocomplex），从而可以将目标细胞分离出来。
分离在特异性抗体与细胞表面标记结合后，需要利用某种手段将免疫复合物与其他细胞类型分离开来。
目前典型的分离方法包括磁珠分离（magnetic bead separation）、离心分离（centrifugal separation）等。
方法免疫细胞分离技术的具体实施方法可以按照以下步骤进行。
材料准备免疫细胞分离技术需要准备一系列实验材料和试剂，如细胞培养液、特异性抗体、免疫磁珠、离心管、离心机等。
细胞处理将需要分离的细胞进行初步处理，如清洗、培养等。
在细胞处理过程中，需要特别注意避免细胞受到损伤。
抗体结合将特异性抗体与细胞混合，让其发生结合反应。
这一步骤可以在离心管中进行，也可以在培养皿中进行。
分离步骤根据具体的分离方法，选择合适的步骤进行分离，如磁珠分离、离心分离等。
细胞复苏将分离出的细胞进行复苏处理，如使用培养液进行复苏，使其恢复生长和增殖的能力。
应用范围免疫细胞分离技术可以应用于各个领域的研究和应用，涉及以下方面：肿瘤学通过分离出不同类型的癌细胞，可以研究其生长、转化和浸润等机制，并用于肿瘤的诊断和治疗。
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要为（ D ） A 单核细胞和粒细胞 B 单核细胞
C 淋巴细胞 D 淋巴细胞和单核细胞
E 淋巴细胞和粒细胞
5.Percoll分离液的主要成分是E( )
A．聚蔗糖
B．泛影葡胺 C．聚乙二醇
D．聚乙烯吡咯烷酮 E．经聚乙烯吡咯烷酮处
理的硅胶颗粒
6.分离人外周血淋巴细胞分层液的最佳密度为( E ) A.1.030 B.1.035 C.1.092 D.1.020
泛影葡胺比重为1.077±0.002
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掌握
聚蔗糖泛影葡胺--Ficoll分离液
原理：单次差速密度梯度离心的分离法 组成：2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液+1份34%
泛影葡胺生理盐水溶液。 比重：1.077±0.001(最佳)
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1.077±0.001的分层液可将细胞分离
红细胞：1.093 粒细胞：1.092 单个核细胞1.0齐7齐6哈—尔医1.学0院9免0疫
全自动细胞分选系统
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荧光激活细胞分离仪分离法
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流式细胞分析仪
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四、不同细胞分离方法的综合评价
了解
早期：根据不同免疫细胞的物理属性和 生物学属性进行分离 近期：利用细胞表面标志进行分离
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1.分离外周血单个核细胞，单次差速密度梯度离 心法常
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Percoll：经聚乙烯吡咯烷酮（PVP)处理的硅胶颗粒。
死细胞、血小板 单核细胞 淋巴细胞
粒细胞 红细胞
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三、T、B细胞和T细胞亚群 熟悉
的分离
磁珠
高分子
(一)磁性微球分离法
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术免疫学研究是现代生物医学领域的一个重要分支，它研究的是人类和动物身体对各种病原微生物、异物和肿瘤细胞的防御反应。
在免疫系统中，免疫细胞是起关键作用的细胞类型。
它们能够识别和灭杀感染体和变异细胞，调节和模拟免疫反应，从而维持机体的免疫平衡。
因此，为了更好地研究免疫学的各个方面，对免疫细胞进行有效的分离和纯化是非常重要的。
免疫细胞的分离和纯化技术主要有以下几种：一、梯度离心分离法梯度离心分离法是采用密度梯度离心分离免疫细胞的方法。
具体步骤是将单个样品分离成不同的浓度梯度，并将样品均匀地添加在内层管子上，然后进行离心分离。
通过分析分离后的离心上清液中各种细胞类型的分布情况，可得到高纯度的特定免疫细胞。
该方法具有简单、快速、操作简单等优点。
二、单克隆抗体柱纯化法单克隆抗体柱纯化法是使用和特定抗体相结合的高亲和性蛋白质固相柱进行免疫细胞分离和纯化的方法。
该方法是将单个样品进行混合，将混合物通过配对的特定抗体柱，将目标细胞捕获和结合。
然后用缓冲液除去不结合的细胞，然后逐步提高pH、浓度等条件进行脱附和纯化。
该方法可以获得高纯度特定细胞的纯度，但需要对抗体进行结合实验，需要一些特殊的仪器和设备。
三、磁珠分离法磁珠分离法是将磁性珠子通过表面结合蛋白并与目标细胞结合的方法实现免疫细胞的分离和纯化的方法。
目前，该方法是免疫学研究分离和纯化细胞的主要方法之一。
该方法具有结合力强、纯度高、高通量、实时观察和可重复等特点。
然而，现有产品价格较高，因此利用磁珠结合留存的免疫抗体分子，促进自主磁珠制备已成为热门技术研究领域。
四、流式细胞术流式细胞术是一种使用单胞悬液通过免疫表型分析和单细胞相关性分析的方法。
该技术是通过将免疫细胞进行标记，然后将其通过流式细胞术仪器进行检测和分析，以实现细胞分离和分析的方法。
流式细胞术是高分析刻度，可以分析更多的样品、更少的细胞、更少的步骤，同时也能够研究细胞的表面和内部组成，测定分析数据的精确性高，检测的速度快等多种优点。
临床免疫学检验-第十三章细胞免疫学技术
Ficoll分离法
聚蔗糖-泛影葡胺分层液的制备
6%聚蔗糖溶液 (Ficoll溶液)密度1.020
34%泛影葡胺溶液 (Hypaque溶液)密度1.2
酸性磷酸酶测定 非特异性酶的测定
巨噬细胞功能检测
炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90% 炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据 此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)， 间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒 的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判 断巨噬细胞的功能。
吞噬功能检测
鸡RBC
l液 密度1.135
细胞混悬液
高速离心 密
度
6小时
梯 度
低速离心 密 度 梯 度
死细胞残片和血小板 富含单核细胞的组分
富含淋巴细胞的组分 红细胞与粒细胞组分
淋巴细胞亚群的分离
T细胞和B细胞的分离
E花环分离法 尼龙棉分离法
E花环分离法
E受体
T
SRBC
B
E花环 T
离心
B
E花环
聚蔗糖-泛影
形成溶血空斑
可以检测致敏红细胞的各种抗原所对应的抗体,临 床应用比较广泛
反向空斑形成试验
反应物: 琼脂凝胶
SPA致敏的SRBC B细胞 补体 抗Ig抗体
形成溶血空斑
体外检测人类Ig分泌细胞的方法,与抗体的特异性 无关
酶联免疫斑点法
反应物:
包被在固相载体上的抗原 B细胞 酶标二抗
加底物显色
计数斑点形成细胞
免疫细胞的分离和保存技术
免疫细胞的分离和保存技术用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。
为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。
参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。
由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。
有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。
分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。
现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。
一、白细胞的分离（一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。
本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。
肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。
操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。
（二）聚合物加速沉淀法本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。
本法的细胞获得率比自然沉降法高。
二、外周血单个核细胞的分离外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。
免疫细胞分离及检测技术
第十三章免疫细胞分离及检测技术本章考点1.免疫细胞的分离2.淋巴细胞表面标志的检测3.淋巴细胞功能检测技术4.免疫细胞检测的临床意义第一节免疫细胞的分离一、外周血单个核细胞的分离1.原理：外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.030～1.035之间。
因而可利用一种比重介于1.075～1.092之间，而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。
2.试剂：常用的分层液有Ficoll与Percoll两种（1）Ficoll分层液法：主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。
Ficoll分层液即聚蔗糖-泛影葡胺，是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。
操作时，将分层液置于试管下层，然后将肝素化的全血或白细胞悬液以Hanks或PBS液稀释后，轻轻铺于分层液面上，经2000rpm15-20min离心后，红细胞与粒细胞因比重大于分层液，故较快沉于管底。
血小板则比重小于分层液而悬浮于血浆中。
唯有与分层液比重相当的单核细胞和淋巴细胞密集于血浆层和分层液的界面中。
其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。
见下图。
图聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法外周血小分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷（2）Percoll分层液法：是一种连续密度梯度离心分离法，其分布由上至下依次为：死细胞层，富含单核细胞组分层，富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。
图连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷二、淋巴细胞的分离1.纯淋巴细胞群的采集：利用单核细胞在37℃和Ca2+存在时，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。
免疫细胞分型鉴定
免疫细胞分型鉴定
免疫细胞分型鉴定是指对免疫系统中的不同细胞类型进行鉴定和分类。
免疫细胞是组成免疫系统的关键组成部分，包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞等。
以下是一些常见的免疫细胞分型鉴定方法和指标：
1.免疫表型分析：利用流式细胞术（flow cytometry）等技术，
通过检测细胞表面的免疫标记物（抗原）来确定细胞的类
型。
例如，CD3、CD4和CD8用于T细胞的鉴定，CD19用
于B细胞的鉴定，CD56用于NK细胞的鉴定等。
2.细胞功能分析：通过测量细胞的功能，如细胞因子产生、
细胞毒性等，来鉴定细胞类型。
例如，T细胞可以通过检
测干扰素γ（IFN-γ）或白细胞介素-2（IL-2）产生来鉴定
Th1细胞；B细胞可以通过测量抗体产生来鉴定。
3.基因和蛋白质分析：使用分子生物学技术，如PCR和免疫
组化等，检测特定基因和蛋白质的表达来确定细胞类型。
例如，通过检测T细胞特异性基因编码的T细胞受体
（TCR）来鉴定T细胞子群。
4.细胞形态学分析：通过显微镜观察和分析细胞的形态和特
征来鉴定细胞类型。
例如，T细胞通常具有细的胞质、圆
形或椭圆形的细胞形态。
通过免疫细胞分型鉴定，可以对不同种类的免疫细胞进行准确的鉴定和分类，从而更好地了解免疫系统的功能和调节机制。
这对于研究免疫相关疾病的发病机制、制定免疫治疗策略以及评估免疫疫苗效果等有重要意义。
15-免疫细胞的分离和保存技术
淋 T细胞：CD2、CD3、CD4、CD8、
巴
CD25等。
细 胞
B细胞：CD19、CD20、CD21、CD22、 CD29等。
1、E花环沉淀法 方法：淋巴细胞+ SRBC悬液→加入 分层液→T细胞形成E花环而沉于管→ 悬液中为B细胞。
2、尼龙毛分离法
方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤维管 →洗脱下来的是T细胞。
（二）斑螯敷法
•此法可从人体组织液中获取较纯的吞噬细胞。 •方法：
用滤纸蘸取10%中药斑螯酒精浸出液 → 贴敷在臂内侧皮肤表面 → 4~5小时后皮肤局部充血 → 48小时后局部形成水泡 → 吸取水泡中的组织液，内 含大量巨噬细胞。 •但此法对病人皮肤有一定损伤，有时可引起局部感 染。
• 中性粒细胞的分离
→与磁珠结合的细胞运动将受限， 未与磁珠结合的细胞将先被洗脱
→再将该柱移出磁场
→与磁珠结合的细胞将被洗脱。
5、磁性激活细胞 分离器分离法
6、淘选法 (利用 表面标志分离淋 巴细胞亚群）
五、单核巨噬细胞的分离
（一）Percoll分离法 •此法从外周血中分离出单核-巨噬细 胞，但由于此类细胞在外周血中的含 量较低，分离时所需的血量较多。
人：静脉采血，抗凝剂抗凝。 动物：颈静脉采血法、尾部采血法、
眼眶采血法、心脏采血法等。
二、外周血中白细胞的分离
血液中红细胞与白细胞比例约为600:1~1000:1， ➢ 两者的比重不同，其沉降速度也不同，通常
用两种方法加以分离。 1、自然沉降法 2、聚合物加速沉淀法 ➢ 或采用0.83%氯化铵分离法使红细胞破裂后， 洗涤得到白细胞。
2、吸附柱过滤法 •将单核 细胞吸附于玻璃柱中，洗脱下 来的主要是淋巴细胞。
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（2）磁激活细胞分离术MACs：是一种特异性细
胞分选技术，其高度特异性来自抗体对抗原的特异性识别。 主要组成成分为MACS微珠、MACS分选柱和MACS分选器。 MACS微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微 粒。MACS分选柱置于一个永久性磁场—MACS分选器中， 可以将磁力增强1000倍，足以滞留仅标记极少量微珠的目的 细胞。用缓冲液冲洗分选柱，所有未标记的细胞被冲洗掉。 分选柱离开磁场，即可获得被标记的细胞组分。
一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型
1、以抗体识别抗原
2、以配体识别受体
二、免疫细胞膜分子的主要检测方法
1、免疫标记检测方法
荧光抗体法 酶免疫检测法 免疫金银染色法
2、补体依赖的细胞毒试验（CDC）
3、花环形成试验
SmIg的荧光抗体检测法
SmIg的酶免疫检测法
补体
染料
补体依赖的细胞毒试验（CDC）
MHC I类(左)和Ⅱ类(右)分子四聚体结构示意图
三、细胞的冻存与复苏
1、细胞冻存的原理与方法：在不加任何条件下直
接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶， 引起细胞死亡。向培养液加入保护剂，可使冰点降低。 在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细 胞。贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
E-花环：利用T细胞膜上的异种动物红细胞受体
花环形成细胞
B细胞
绵羊红细胞 T细胞
EA-花环：B淋巴细胞表面有Fc受体，能与免疫球蛋白的
Fc段结合，因此用抗体致敏的红细胞与B淋巴细胞混合，可见 B淋巴细胞周围粘附有红细胞
EAC-花环：B淋巴细胞表面有补体受体，在抗体致敏的
红细胞中加入补体，可形成红细胞-抗体-补体复合物，再与B 淋巴细胞混合，则可形成EAC玫瑰花环。
的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液
液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
稀释抗凝血
血浆 单个核细胞
淋巴细胞分离液
粒细胞 红细胞
离心前
离心后
2、黏附分离法-纯淋巴细胞群的分离
贴壁法：将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平
皿或扁平小瓶中，移至37℃温箱静置1h左右，单核细胞和
2、细胞复苏的原理与方法：细胞复苏时速度要快，
使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长， 活力受损不大。 目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们 对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。
细胞冻存罐
Байду номын сангаас二节
免疫细胞膜分子的检测
一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型 二、免疫细胞膜分子的检测方法
5、其他分离法
1、密度梯度离心法
聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分层液
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，亲水性高，平均分子量为
400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不
穿过生物膜。
红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单
核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液
N
S
MACS (阳性选择法）
N
S
MACS (阴性选择法）
5、其他分离法
花环沉降法：本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红
细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液 分离细胞。浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细 胞，而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理，使围 绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，则获得纯的T细胞。
称混合淋巴细胞反应(MLR)常用于器官移植前的组织配型， 以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容的程 度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活 化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和 CTL等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实 验模型。
第一节
免疫细胞的分类与分离
一、免疫细胞的种类与特征
二、免疫细胞的分离技术
三、细胞的冻存与复苏
一、免疫细胞的特征
1、免疫细胞的形态学特征 理化性状 生物学特性 2、免疫细胞的膜分子特征 CD分子
吞噬溶酶体
NK cells
二、免疫细胞的分离技术
1、密度梯度离心法
2、黏附分离法 3、荧光激活分离法 4、磁性分离法
可溶性MHC-肽四聚体法：mhc-肽四聚体复合物
的原理是通过增强t细胞受体与mhc-肽复合物亲和力，达 到可直接特异性检测t细胞的目的。 作为临床诊断工具，定量检测外周血及组织中抗原特异 性CTLs的比率，并进行表型及功能分析。 用于过继性肿瘤免疫治疗 用于疫苗疗效的监测
抗原肽-MHC分子四聚体技术
粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋 巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。因B 细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所 损失。
2、黏附分离法：淋巴细胞亚群的分离 尼龙毛法：混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、 单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数T细胞则 通过尼龙毛柱，这是获得富含T细胞群的有效方法。 T细胞得率为2030%左右。 亲和板法：利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细 胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞 悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未 吸附的细胞悬液中获取。
第三节
免疫细胞功能测定
一、转化、增殖试验 二、细胞毒试验 三、抗体形成试验 四、细胞吞噬与杀伤试验
一、转化、增殖试验
1、淋巴细胞转化试验：刺激物分为非特异性（如植
物血凝素、刀豆素A等）和特异性刺激因子（如抗原）；检 测方法为形态学检测法和3H-TdR掺入法及MTT法等。
2、混合淋巴细胞培养：混合淋巴细胞培养(MLC)或
吸附柱法：将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶 SephadexG10的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘 滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。此法简单易行， 对细胞极少损害。
3、荧光激活分离法（FACS）
流式细胞仪
4、磁性分离法
（1）磁铁吸引法：利用单核细胞具有吞噬的特性，在