马铃薯遗传转化方法(protocal翻译)
遗传转化技术
遗传转化技术遗传转化技术（Genetic transformation）是一种将外源DNA导入目标细胞以改变其遗传性状的生物技术。
通过遗传转化技术，科学家可以将特定基因导入目标生物体，从而使其表达具有特定功能的蛋白质或产生特定的代谢产物。
这项技术在农业、医学和生物学研究领域都有重要的应用，可以帮助改良农作物、生产药物和研究基因功能等。
本文将从遗传转化技术的原理、方法、应用和未来发展等几个方面进行详细介绍。
一、遗传转化技术的原理遗传转化技术的原理是通过将外源DNA导入目标细胞，使其在目标细胞中稳定表达而产生特定的遗传性状。
这一过程包括DNA的导入、整合和表达等步骤，下面将分别介绍这些步骤。
1. DNA的导入DNA的导入是遗传转化的第一步，有多种方法可实现DNA的导入，包括化学转化、生物弹道法、冷冻转化法等。
其中，最常用的方法是利用冷冻转化法和冷冻方式使DNA导入目标细胞。
此外，也可以利用质粒、病毒和细菌等载体将DNA导入目标细胞。
2. DNA的整合DNA的整合是指外源DNA在目标细胞中的稳定整合，以确保其可以稳定地在细胞中传递和复制。
整合是遗传转化的关键步骤，其研究是提高转化效率和稳定性的重要途径。
3. DNA的表达DNA的表达是指外源DNA在目标细胞中被转录和翻译，最终产生特定的蛋白质或代谢产物。
DNA的表达与其整合程度、基因调控、转录水平等因素有关，对DNA的表达进行调控是提高遗传转化效率和稳定性的重要手段。
二、遗传转化技术的方法在遗传转化技术中，有多种方法可以将外源DNA导入目标细胞，并实现其稳定表达。
这些方法包括冷冻转化法、生物弹道法、基因枪法、质粒介导和病毒介导等，下面将对这些方法进行详细介绍。
1.冷冻转化法冷冻转化法是通过使目标细胞在低温条件下，先后进行冷冻和解冻，并向其注入DNA，利用渗透剂和真核细胞基因组重复生成的能力，使外源DNA稳定地整合到目标细胞的方法。
该方法简单、操作方便，适用于多种生物体。
遗传转化的名词解释
遗传转化的名词解释遗传转化是指通过不同的手段和技术，将外源基因引入到一个生物体的细胞或基因组中，使其在后代中表达该外源基因。
这一过程既可以在自然界中发生，也可以通过人工手段进行。
遗传转化的目的在于改变生物体的基因组，以获得某种特定的性状或功能。
这一技术广泛应用于农业、医学、生物工程等领域。
通过遗传转化，可以使植物具有抗病虫害能力、耐逆性和优异的产品特性，从而提高农作物的产量和质量。
在医学领域，遗传转化可以用于治疗遗传性疾病和其他疾病，并开发新的药物和治疗方法。
遗传转化的方法多种多样。
其中一种常见的方法是基因枪法（gene gun）。
基因枪法通过利用高压气体或炮火将DNA颗粒送入目标细胞，使其转化为转基因细胞。
这一方法适用于植物和动物细胞，被广泛应用于农作物改良和生物医学研究领域。
另一种常用的遗传转化方法是农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium-mediated transformation）。
农杆菌是一种普遍存在于土壤中的细菌，能够将其DNA片段传递给其他生物体。
通过改变农杆菌的基因，科学家可以将所需基因导入到目标生物体的细胞中，从而实现遗传转化。
除了以上两种方法，遗传转化还包括利用病毒载体、电穿孔和化学方法等。
这些方法各有特点，适用于不同类型的生物体和研究目的。
虽然遗传转化技术在农业和医学领域带来了很多好处，但也引发了一些争议。
其中一个主要争议点是关于转基因食品的安全性。
一些人担心转基因食品可能会对人体健康产生不良影响，因此对其持怀疑态度。
然而，多数科学研究表明，经过严格监管并符合安全标准的转基因食品是安全可靠的。
另一个争议点是关于遗传资源和基因的私有化。
一些大公司在利用遗传转化技术改良作物或开发新的药物时，通过专利等手段将其技术和产品垄断起来，使得部分基因资源无法自由流动，从而引发一系列的经济和伦理问题。
为了克服这些争议和挑战，需要加强对遗传转化技术的监管和评估，并确保技术的透明性和可追溯性。
马铃薯高效遗传转化受体体系的建立
马铃薯高效遗传转化受体体系的建立程永芳;张丽;宋玉霞【摘要】以4个马铃薯(Solanum tuberosum L.)栽培种为材料,对其叶片、茎段和试管薯3种外植体再生体系进行研究,筛选与优化马铃薯遗传转化的受体材料和条件,建立马铃薯高效遗传转化受体体系.结果表明:茎段较叶片愈伤组织形成速度更快、诱导率更高.其中,‘陇薯3号’愈伤组织分化效果最佳,分化率和出苗率分别达100％和175.0％.在添加1.0mg·L-1 ZT+1.0 mg·L-1 IAA+0.5mg·L-1 6-BA+0.2mg·L-1 GA的MS培养基中,4个品种的试管薯均可通过直接分化再生系统分化成苗.其中,以‘青薯168‘试管薯薯片出苗率最高(110.0％).验证了试管薯作为转化受体,受基因型的影响小,转化周期短,是马铃薯遗传转化的最佳材料,进一步建立试管薯繁育及再生体系,为马铃薯遗传转化奠定良好的基础.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2016(025)009【总页数】8页(P1350-1357)【关键词】马铃薯;茎段;试管薯;离体培养【作者】程永芳;张丽;宋玉霞【作者单位】宁夏农林科学院农业生物技术研究中心,宁夏农业生物技术重点实验室,银川 750002;宁夏大学生命科学学院,银川 750021;宁夏农林科学院农业生物技术研究中心,宁夏农业生物技术重点实验室,银川 750002;宁夏农林科学院农业生物技术研究中心,宁夏农业生物技术重点实验室,银川 750002【正文语种】中文【中图分类】S532马铃薯(Solanum tuberosum L.)为茄科(Solanaceae)茄属(Solanum)的1 a生草本块茎植物，营养价值丰富全面，是重要的粮菜兼用和工业原料作物,具有很高的经济价值[1-2]。
目前，中国马铃薯种植面积已达5.33×106 hm2，成为仅次于水稻、小麦、玉米的第4大主粮作物。
马铃薯块茎启动子驱动的淀粉合成酶基因RNAi载体构建及遗传转化
马铃薯块茎启动子驱动的淀粉合成酶基因RNAi载体构建及遗传转化陈国梁;张金文;徐露;严海霞;张向前【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2015(034)011【摘要】以马铃薯gbss、ssⅢ与ssⅡ基因的部分cDNA片段拼接成的融合基因gbs3s2为靶标,构建以马铃薯块茎组织特异性启动子GBSS驱动的RNAi表达载体pART-GF.采用农杆菌介导法对NHD3、NF和NC三个马铃薯品种进行了遗传转化,用PCR技术检测转基因植株,采用双波长法测定其微型薯中直链淀粉与支链淀粉的比值.经抗性筛选及PCR检测初步获得10株阳性植株,其中NC、NF和NHD3分别为2株、3株和5株,其微型薯中直链淀粉/支链淀粉比值明显下降.作者成功构建了马铃薯块茎启动子GBSS驱动的淀粉合成酶基因RNAi三价表达载体,初步获得了转基因马铃薯育种材料.【总页数】5页(P1141-1145)【作者】陈国梁;张金文;徐露;严海霞;张向前【作者单位】延安大学生命科学学院,陕西延安716000;甘肃农业大学农学院,甘肃兰州730070;延安大学生命科学学院,陕西延安716000;延安大学生命科学学院,陕西延安716000;延安大学生命科学学院,陕西延安716000【正文语种】中文【中图分类】Q933【相关文献】1.ubi启动子驱动的花生芪合酶基因表达载体的构建及玉米遗传转化初报 [J], 郭志鸿;王汉宁;陶玲;张金文;白斌;陈正华2.水稻淀粉分支酶SBE3基因RNAi载体构建及愈伤组织转化影响因素 [J], 杨忠良;徐振华;刘海英;刘会;高洪儒;赵北平;黄翠3.马铃薯块茎颗粒结合型淀粉合酶基因的克隆及其RNAi载体的构建 [J], 刘玉汇;王丽;杨宏羽;余斌;李元铭;张俊莲;王蒂4.慈竹木质素合成酶基因4CL RNAi载体构建与烟草转化 [J], 周建英;曹颖;孙霞;陈珂;卢学琴;胡尚连5.荠菜TPD1基因启动子与GUS基因表达载体的构建及拟南芥遗传转化 [J], 何金花; 杨正修; 姜路华; 方磊; 赵燕因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
马铃薯反义PPO基因遗传转化体系的优化及转基因植株PPO活性、同工酶的分析
马铃薯反义PPO基因遗传转化体系的优化及转基因植株PPO活性、同工酶的分析通过农杆菌介导对马铃薯进行遗传转化是获得转基因植株的重要途径,由于转化材料的生理状态、外植体类型、农杆菌侵染时间及培养基的激素配比等对转化效率都有影响。
故遗传转化体系的优化与否直接影响转基因植株的获得。
另外,转基因植株是否取得了定向改变,其在大田中的表现如何,本文在对上述问题的研究中获得了以下结果: 1.利用农杆菌介导PC3-ASPPOqc 对加工型马铃薯品种Atlantic、Shapody、陇薯3 号、甘农薯1 号、甘农薯2 号及双单倍体品系83-8 进行遗传转化。
结果表明:(1)茎段和微型薯的最佳愈伤组织培养基和分化培养基分别为MS+0.5mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA 和MS+5.0mg/LGA3+2.25 mg/L 6-BA+3mg/L Zeatin;(2)叶盘预培养2d,共培养3 d,侵染10min 时,抗性愈伤组织频率最高为43.74%;茎段和微型薯预培养3d,共培养3d,分别被侵染8min 和10min 时,抗性愈伤组织频率高达50 %和56.25%。
外植体预培养或共培养超过3d,侵染大于10min,容易发生褐化并停止生长,抗性愈伤组织频率明显降低;侵染时间在8～10 min,外植体的污染可被Cef(头孢霉素)有效抑制,愈伤组织出愈率和转化率也相对较高;(3)不同的外植体采用的卡那霉素(Kan)选择压不同。
叶盘采用25mg/L的Kan 浓度,茎段和微型薯均采用50mg/L Kan 浓度;(4)外植体不同,抗性愈伤组织和转化率不同。
其中,试管微型薯的抗性愈伤组织频率和平均转化率为27.56%和5.4%;茎段的抗性愈伤组织频率和平均转化率为23.8%和3.01%。
另外,基因型不同,抗性愈伤组织频率及转化率也不同; 83-8 的抗性愈伤组织频率和转化率最高为22.5%和1.63%,Atlantic 的次之(21.5%,0.7%),而陇薯3 号和Shapody的分别为16.3%和0.37%、19.5%和0.5%。
二倍体马铃薯的组培再生体系建立及抗性相关基因的遗传转化的开题报告
二倍体马铃薯的组培再生体系建立及抗性相关基因的遗传
转化的开题报告
一、选题背景
马铃薯（Solanum tuberosum）是全球最重要的食用作物之一，在我国也有着广泛的种植。
然而，病虫害是制约马铃薯生产的重要因素之一。
传统的化学防治虫害及病害方法已经无法满足需求,基因工程技术为马铃薯育种提供了新的手段。
其中，遗传转化技术可直接将外源基因转入到马铃薯基因组中，从而实现对马铃薯的遗传改良。
因此，研究马铃薯的组培再生体系及其遗传转化，对于马铃薯育种具有重要的理论和实践意义。
二、研究目的
本课题旨在建立二倍体马铃薯的组培再生体系，对马铃薯进行遗传转化及抗性基因的表达分析，为今后马铃薯的遗传改良提供理论基础。
三、研究内容
1. 采用不同激素和生长调节剂对二倍体马铃薯进行组织培养，筛选出最适宜的培养基和培养条件。
2. 对培养出的愈伤组织进行诱导分化，建立马铃薯的再生体系。
3. 构建适合马铃薯的遗传转化载体，采用农杆菌介导法将目标基因转入到马铃薯细胞中。
4. 鉴定遗传转化后的马铃薯植株的稳定性和抗性表达情况。
5. 对转化后的植株进行抗性基因的表达分析及生物学特性研究。
四、预期结果
本研究将建立起适合二倍体马铃薯的组培再生体系，并成功将外源抗性相关基因转入到马铃薯基因组中。
进一步，将对转化后的植株进行抗性基因的表达分析及生物学特性研究，探讨在遗传转化过程中影响基因表达及生物学特性变化的因素和规律，形成一套可行的马铃薯遗传转化体系，为今后马铃薯抗性育种提供有力的基础数据。
农杆菌介导IP-10基因遗传转化马铃薯的研究
农杆菌介导IP-10基因遗传转化马铃薯的研究本论文利用马铃薯微型薯为试验材料,通过不同激素组合试验,优化了东农303品种的高效再分化体系。
采用农杆菌介导法将IP-10基因导入马铃薯基因组中,并通过PCR、RT-PCR、GFP蛋白荧光检测,验证了目的基因已转入马铃薯基因组中。
另外,探讨了转基因植株试管薯形成的最佳条件。
1.利用马铃薯脱毒试管苗茎段、叶片和薯块为试验材料,通过IAA、NAA、GA<sub>3</sub>、IBA、6-BA、ZT的不同组合,进行了再分化试验。
结果表明,诱导茎段愈伤的最适培养基为:MS+IBA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L,愈伤诱导率为86%;但其出芽率较低;诱导叶片再分化的最适培养基为:MS+ZT 10.0mg/L+NAA 0.1mg/L+GA<sub>3</sub> 0.2mg/L,出芽率达150%;薯块再分化最适培养基为:MS+IAA 1.0mg/L+ZT 3.5mg/L,分化率为120%。
2.对农杆菌侵染并通过潮霉素筛选的转基因植株,进行了IP-10基因和潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）的PCR扩增,分别获得了276bp和602bp所需目的条带。
通过进一步的RT-PCR反应和GFP荧光蛋白的激光共聚焦检测,最终获得3
个转基因株系。
3.探讨了KT、B9、CCC等激素和蔗糖浓度对转基因株系形成试管薯的影响。
结果表明,当KT浓度为100mg/L,B9的浓度为150mg/L,蔗糖的浓度为8%时试管薯形成量较多,其MT/Plantlet分别为1.4,1.5和1.6,表明KT、B9和蔗糖均为转基因试管薯诱导的可选试剂。
遗传转化技术
遗传转化技术遗传转化技术是一种将外源基因导入植物细胞并使其在整个植物体中传播的技术。
它是现代分子生物学和植物育种中的重要工具，被广泛应用于提高农作物产量和质量，增加抗病虫害能力，提高耐逆性以及改良植物形态和生理性状等方面。
遗传转化技术的基本步骤包括基因导入、基因表达和基因传递三个环节。
首先，通过载体介导，外源基因被导入植物细胞。
载体可以是嵌入外源基因的质粒或病毒。
质粒常用的载体是农杆菌（Agrobacterium tumefaciens），它能够通过致病基因导入植物细胞的方式实现基因转移。
而病毒则通过直接注入带有外源基因的RNA或DNA来实现基因导入。
接着，外源基因在植物细胞中被表达并转录成RNA，然后翻译成蛋白质。
最后，通过细胞分裂和花粉传输等方式，外源基因被传递到下一代植物体中。
遗传转化技术可以应用于大多数植物物种，但不同物种之间的表达效果可能有所不同。
对于不易被转化的植物物种，可使用基因枪或电穿孔等方法来提高转化效率。
此外，还可以利用基因编辑技术如CRISPR-Cas9来精确修改植物基因组，实现对目标基因的精确编辑。
遗传转化技术在农业领域有着广泛的应用。
通过导入外源基因，可以使植物具备抗虫、抗病的能力，减少农药的使用。
例如，转基因玉米中的Bt基因可以抑制玉米螟的生长，从而减少农民对杀虫剂的依赖。
此外，遗传转化技术还可以提高植物的营养价值，使作物更加营养丰富。
例如，转基因水稻中的金属螯合蛋白基因能够有效吸收土壤中的重金属，从而减少重金属对人体的危害。
不仅在农业领域，遗传转化技术也在植物学研究方面发挥着重要作用。
通过改变植物的方式、形态和生理性状，科学家可以深入研究植物的生长发育、代谢途径以及抗逆机制。
例如，通过转基因方式使水稻产生异色花朵，有助于对花色形成的相关基因进行研究。
此外，遗传转化技术还可以应用于植物品种改良，加速育种进程。
通过导入耐盐、耐旱等逆境相关基因，可以培育出具有更好逆境耐受性的新品种。
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重庆大学本科学生毕业设计（论文）附件附件C：译文 C 1 农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系
Steve Millam 摘要：马铃薯是一种全球性的重要农作物，其块茎作为营养丰富的食物，产量很高。马
铃薯之所以成为大量研究的焦点，是因为它既作为一种主要粮食作物，又能作为所关注的化合物的潜在重要来源。转基因技术的发展和应用已经用于马铃薯上，并以此来引进基础且实用的新奇目标特征。本文描述了一个快速、高效和低成本的马铃薯遗传转化系统，与平常的转化相比，其转化效率可超过40%。基于核酸印迹法的平均值计算，证实了每个外植体切片在转基因上的独立性。将节间切片与农杆菌一起培养，然后在卡那霉素的筛选下，经历一个双阶段的愈伤组织诱导/出芽系统。用这种描述的方法可以获得很高的幼芽再生率，而且经过2次继代培养后，离体茎段从伤口末端生根，保证有95%的外植体被转化。这种转基因状态可以通过分子分析来证实。马铃薯的块茎生长也促使了大范围的进一步的研究。
1．介绍 马铃薯是最早用于遗传转化的植物之一。Ooms等人在1986年用农杆菌浸染马铃薯Desiree品种的组织并使组织再生，这成为马铃薯转化的直接证据。转基因品种Desiree和Bintje所用的农杆菌由Stiekma等人提供。de Block报道了一种以叶圆片作为靶组织，且与基因型无关的转基因方法。Visser等人以茎段和叶片为外植体，提出了包括再生和转化在内的两步法，并作为目前众多已使用的实验方案的基础。各种马铃薯组织相对容易的根系再生也支持了这些已经报道的马铃薯遗传转化系统。 目前许多正在使用的实验方案都报道了一个两步再生法，及先进行愈伤组织诱导，再进行根系再生。在愈伤组织诱导阶段通常会尽可能避免马铃薯体细胞突变。第一步通常是加入1-5mg/L的玉米素（zeatin）或者玉米素核苷（zeatinriboside），并结合低浓度的生长素（通常是0.1-0.2mg/L的萘乙酸（NAA）或者吲哚乙酸（IAA））,以此促进外植体产生愈伤组织。第二步，将玉米素浓度降低20%，将生长素浓度降低10倍，同时加入赤霉素来刺激根系再生。每个外植体的再生速率都很高，经过4-6周可生出第一批根，培养10-12周后可每个外植体都会长出至少10条根。以卡那霉素（kanamycin）或者潮霉素（hygromycin）作为筛选标记可以很容易地用肉眼进行分析，然后切除可能与转化无关的根。那些含有抗生素抗性基因的苗将会很明显从茎的切口处长出根，而那些非转基因的苗将不会生根或者从不定位点生根。使用不同的栽培品种或者组织，其转化效率也不同。但是根据重复实验的记录显示，从最初的外植体到确定的转基因单株的比率在40%到100%之间。 尽管马铃薯通常是四倍体，但也经常使用双单倍体品系进行转基因研究。此外，野生重庆大学本科学生毕业设计（论文）附件附件C：译文 C 2 的二倍体植株也用此方法进行转化。虽然许多的初步报道都基于模式植物的研究，但转化成功的基因型的范围也在不断扩大。在众多马铃薯品种中筛选具有转化潜力的品种的研究中，科学家发现了一个有意思的现象，即转化效率与转化潜力无关。最近几年，马铃薯的研究重心将集中到转基因的发展，包括赋予抗病虫害能力，提升块茎质量，以及提升淀粉产量。
2．材料 2.1．植物材料 马铃薯Desiree品种的试管苗（来自苏格兰农业科学局[SASA]，网址是http://www.sasa.gov.uk/ 或其他机构）确保最初使用的是脱毒苗。脱毒苗可以选择用马铃薯发芽的块茎培育的试管苗，或者温室中长势相同的马铃薯植株。
2.2．生长调节剂母液 提前准备好充足的生长调节剂母液用于配制16×250mL的完全培养基。母液先用过滤方式消毒，然后分装到无菌离心管中，并置于-20℃中保存，可以保存6个月。 1．萘乙酸（NAA）（Duchefa）：将20mgNAA溶解到1mL 1N的NaOH溶液中，再加蒸馏水定容至20mL，配成1mg/mL的NAA母液。NAA母液可于4℃保存6周。 2．赤霉素（GA3）（Duchefa）：将20mg GA3溶解到20mL 50%的乙醇（乙醇与蒸馏水的比例为1:1）中，配成1mg/mL的GA3母液。GA3母液可于4℃保存6周。 3．米素核苷（ZNR）（Duchefa）：将20mg ZNR溶解到1mL 1N的NaOH溶液中，再加蒸馏水定容至20mL，配成1mg/mL的ZNR母液。ZNR母液可于-20℃保存6个月。
2.3．抗生素母液 1．头孢霉素（Claforan，Cefotaxime powder，Roussel，Uxbridge，England）：用蒸馏水配制125mg/mL头孢母液，并用过滤方式消毒。母液可于-20℃保存6个月。 2．卡那霉素（Duchefa）：用蒸馏水配制50mg/mL卡那霉素母液，并用过滤方式消毒。母液可于-20℃保存6个月。 3．利福平（Sigma）：用甲醇配制50mg/mL利福平母液，不需要过滤方式消毒。母液可于-20℃保存6个月。 重庆大学本科学生毕业设计（论文）附件附件C：译文
C 3 2.4．培养基 所有的培养基都准备了250mL，分装至Durand bottles中，并在121℃下高压蒸汽灭菌20分钟，同时对抗生素进行过滤消毒。然后在超净工作台中，先将生长调节剂母液加入培养基中，再分装至10个9cm的培养皿中。 1.植物生长必需培养基（BM）：1×MS基本培养基加上维生素混合物（Duchefaproduct no.M022），20g/L蔗糖，用蒸馏水定容至1L，并调节pH至5.8。加入8.0g/L的琼脂粉，经高压蒸汽灭菌后，于4℃保存。 2.MS20培养基：即液体BM培养基，成分和上面相同，但是不加琼脂粉。 3.共培养基（CM）：在BM培养基中加入0.2mg/L的NAA，0.02mg/L的GA3，2.5mg/L的玉米素核苷（ZR），8g/L的琼脂粉。 4.第一阶段再生培养基（CMC）：在CM培养基中加入500mg/L的头孢霉素（已用过滤方式灭菌）。 5.第二阶段再生培养基（CMCK）：在BM培养基中加入0.02mg/L的NAA，0.02mg/L的GA3，2mg/L的玉米素核苷（ZR），500mg/L的头孢霉素（已用过滤方式灭菌），50mg/L的卡那霉素（已用过滤方式灭菌）。 6.选择培养基（SM）：在BM培养基中加入500mg/L的头孢霉素（已用过滤方式灭菌），50mg/L的卡那霉素（已用过滤方式灭菌）。 7.LB培养基：10g/L的胰蛋白胨；10g/L的酵母提取物；10g/L的NaCl，pH= 7.5；18g/L的琼脂粉。
2.5．细菌菌株和载体 1．农杆菌菌株LBA4404。 2．DNA构建体：pBIN19的双元载体衍生物。载体通过电击转化进入LBA4404中。成功转化的细菌能够选择性地在含有100mg/L的卡那霉素和利福平的LB培养基上生长。农杆菌菌液需加入甘油，置于-80℃保存。 2.6．其他物品和溶液
1．灭菌剂：10%的Dmomestos（Lever Brothers，UK），其有效成分为1.0%的次氯酸钠。 2．混合肥：爱尔兰苔藓腐殖土（bedding grade），1200L；Pavoir沙，100L；石灰石（magnesium），2.5kg；石灰石（calcium），2.5kg；sincrostart基肥（William Sinclair，Lincoln，UK），1.5kg；Celcote湿润剂（LBS Horticulture，Lancashire，UK）,1.5kg；珍珠石，100L；Osmocote控释肥（Scotts，UK），2kg；Intercept杀虫剂（Bayer），重庆大学本科学生毕业设计（论文）附件附件C：译文 C 4 390g。
3．方法 3.1．培育试管苗 所有的试管苗都置于18-22℃，16小时光照（光照强度为80-110μE/m2/s），8小时黑暗环境下培养。
3.1.1．用发芽的块茎培育试管苗 1．将块茎上的芽切下，并用自来水冲洗。 2．先将切下的芽置于加有2滴吐温20的70%乙醇中浸泡1分钟，然后用10%的Domestos浸泡15分钟，再用无菌水清洗5遍，最后放在BM培养基中培养。 3．用装有BM培养基的90mm培养皿或者组培瓶对茎段和芽尖进行继代培养。
3.1.2．用温室中正在生长的植株培育试管苗 1．选择生长旺盛，且未受到病虫害侵袭的植株，将其茎段和芽尖剪下，并立即用自来水冲洗。 2．先将茎段和芽尖剪成5至10mm的小段，然后用加有2滴吐温20的70%乙醇漂洗1分钟，接着用10%的Domestos浸泡15分钟，再用无菌水清洗5遍，最后放在BM培养基中培养。 3．用装有BM培养基的90mm培养皿或者组培瓶对茎段和芽尖进行继代培养。
3.2．准备农杆菌 1．从用甘油保存的菌液或者含有100mg/L卡那霉素和利福平的LB平板培养基上挑取菌种，并置于5mL发酵培养基中活化。 2．将农杆菌加入5mL含有100mg/L卡那霉素和利福平的LB培养基中，然后放在摇床上，28℃，200rpm过夜培养。 3．过夜培养后，用250mL的锥形瓶将5mL的菌液转入50mL含有相应抗生素的LB培养基中，用相同的条件过夜培养。 4．过夜培养后，测量农杆菌悬浮液的光密度（OD）值为600nm。 5．将菌液加入无菌离心管中，700-1000g离心15分钟，然后用15mLMS20重悬沉淀。 6．同时，用650μL之前摇的菌液和350μL甘油混合，配成1mL菌液，用液氮速冻后，置于-80℃保存。