马铃薯遗传转化方法
可溶性淀粉合成酶SSIII基因对马铃薯的遗传转化
可溶性淀粉合成酶SSIII基因对马铃薯的遗传转化可溶性淀粉合成酶SSIII基因对马铃薯的遗传转化引言：马铃薯（Solanum tuberosum）是世界上重要的食用作物之一，其主要利用部位为地下块茎。
地下块茎中主要储存的是淀粉，淀粉的品质和含量直接影响马铃薯的食用和加工价值。
可溶性淀粉合成酶SSIII基因在淀粉的合成和积累中发挥着重要作用。
为了改良马铃薯的淀粉性质，研究人员尝试将可溶性淀粉合成酶SSIII基因导入马铃薯，通过遗传转化的方式实现马铃薯的基因改造。
一、马铃薯的可溶性淀粉合成酶SSIII基因可溶性淀粉合成酶SSIII基因编码的酶参与了淀粉的聚合和支链的形成，对淀粉的颗粒结构和性质有直接影响。
在马铃薯中，淀粉是地下块茎的主要成分，通过导入可溶性淀粉合成酶SSIII基因，可以改变马铃薯淀粉的性质和含量，提高马铃薯的实用价值。
二、马铃薯的遗传转化技术马铃薯的遗传转化技术是将外源基因导入马铃薯细胞中，使其表达产生新的性状或增强原有性状的方法。
目前常用的遗传转化技术包括农杆菌介导的转染法、基因枪法和电穿孔法。
这些方法都能够有效地实现外源基因的导入，但具体的应用需要综合考虑基因的表达效率、稳定性以及转基因植株的安全性等因素。
三、基于可溶性淀粉合成酶SSIII基因的马铃薯遗传转化研究研究人员通过农杆菌介导的转染法将可溶性淀粉合成酶SSIII基因导入马铃薯，经过筛选和鉴定获得了转基因植株。
通过PCR、Southern blot等方法验证了外源基因的整合和稳定性，并通过RT-PCR分析了基因在转基因植株中的表达情况。
结果表明，可溶性淀粉合成酶SSIII基因成功地导入了马铃薯细胞，转基因植株表现出了不同程度的淀粉性状变化。
四、可溶性淀粉合成酶SSIII基因对马铃薯淀粉性质的影响经过长期培养和观察，研究人员发现，可溶性淀粉合成酶SSIII基因的导入对马铃薯淀粉的性质产生了显著影响。
转基因马铃薯的淀粉颗粒更为均匀，颗粒大小更为一致。
马铃薯转基因步骤
马铃薯转基因步骤马铃薯是世界上最重要的食物作物之一，是许多国家的主要粮食来源。
然而，马铃薯也面临着许多的病虫害威胁，这些威胁影响着马铃薯的生长和产量。
因此，转基因技术被用来改善马铃薯的品质和抗病性。
本文将讨论马铃薯转基因的步骤。
1. 确定目标基因马铃薯转基因的第一步是确定目标基因。
这个基因可能是与抗病性相关的基因，也可能是与马铃薯的营养价值相关的基因。
确定目标基因是转基因技术的关键步骤之一。
2. 克隆目标基因一旦确定了目标基因，就需要克隆它。
这个步骤通常涉及到DNA 插入和PCR放大等技术。
克隆目标基因的成功与否直接影响到后面的转基因过程。
3. 构建载体为了将目标基因引入马铃薯细胞内，需要构建一个载体。
载体是一个DNA分子，可以将目标基因插入到其中。
常用的载体包括农杆菌和病毒等。
4. 转化马铃薯细胞将构建好的载体引入马铃薯细胞中，从而将目标基因引入到马铃薯细胞中。
这个过程通常使用农杆菌介导的转化技术。
农杆菌是一种生活在土壤中的细菌，可以将外源DNA插入到植物细胞中。
5. 筛选转基因植株一旦转化成功，就需要筛选出带有目标基因的转基因植株。
这个过程通常使用基因检测技术和抗性筛选等方法。
只有成功筛选出目标基因的转基因植株才能进一步培育和繁殖。
6. 验证转基因植株的品质和安全性需要验证转基因植株的品质和安全性。
这个过程通常包括对转基因植株的抗病性、生长性能、品质和安全性等方面的测试。
只有通过严格的验证程序，才能保证转基因马铃薯的品质和安全性。
总结马铃薯转基因的步骤涉及到目标基因的确定、克隆、载体构建、转化马铃薯细胞、筛选转基因植株和验证品质和安全性等环节。
这些步骤都是非常关键的，只有在每个步骤都严格把控，才能成功地培育出优质、高产、抗病的马铃薯品种。
马铃薯再生体系的建立及HAL1基因遗传转化研究
马铃薯再生体系的建立及HAL1基因遗传转化研究盐碱地是巨大的潜在资源,绿化盐碱地是扩大耕地面积,进一步发展农业生产、改善生态环境的重要措施。
利用基因工程手段培育能在盐碱地上种植的植物,是利用盐碱地的一条经济而有效的途径。
HAL1基因是酿酒酵母中的重要耐盐因子,其表达参与调节细胞内离子浓度。
尽管HAL1基因本身不是转运蛋白,但在盐胁迫下能与ENA1基因协同作用促进Na+外排,与其它转运系统协同作用增加K+的吸收,保持细胞内低的Na+/K+比,以减轻Na+毒害,因而在植物耐盐基因工程上具有很大的潜力。
本研究用农杆菌介导的叶盘法将HAL1基因转入马铃薯,探索农杆菌介导的遗传转化条件及其影响因素,并对转基因马铃薯的耐盐性进行评价。
主要研究结果如下:1.以克新12号、克新13号、东农303和早大白4种马铃薯试管苗茎段为材料,进行了各品种茎段的离体再生研究。
结果表明克新13号和克新12号的最适愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA2mg/L+2,4-D1mg/L ,东农303为MS + 6-BA2mg/L + 2,4-D0.5mg/L,早大白为:MS + 6-BA 2mg/L + 2,4-D0.5mg/L,愈伤诱导率分别为100%,100%,100%和90%。
克新13号愈伤组织分化的最佳培养基为MS + 6-BA 4.0mg/L + NAA0.1mg/L +GA3 1.0mg/L,克新12号为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+GA31.0mg/L,东农303为MS + 6-BA2.0mg/L + NAA0.1mg/L +GA31.5mg/L,早大白为MS + 6-BA2.0mg/L + NAA0.5mg/L + GA31.0mg/L,分化率分别为80%,90%,100%,76.7%。
根据以上试验结果,确定东农303为下一步遗传转化的受体材料。
2.以东农303试管苗茎段为材料,建立了较为理想的再生体系。
教学课件 马铃薯遗传育种技术--张美玲
• 三、学科意义作用及其发展动向
• 作物育种学是研究选育及繁殖作物优良品种的理论与方法的科学， 其基本任务是在研究和掌握作物性状遗传变异规律的基础上，发 掘、研究和利用各有关作物种质资源；并根据各地区的育种目标 和原有品种基础，采用适当的育种途径和方法，选育适于该地区 生产发展需要的高产、稳产、优质、抗（耐）病虫害及环境胁迫、 生育期适当、适应性较广的优良品种或杂种以及新作物；还在其 推广过程中，保持和提高其种性，提供数量多，质量好、成本低 的生产用种，促进高产优质高效农业的发展。
马铃薯遗传育种技术
概述
• 一、作物进化与马铃薯的遗传改良
• （一）自然进化与人工进化 Nhomakorabea• 各种作物都是从野生植物演变而来的。这种演变发展过程为 进化过程。
• 所有生物，包括野生植物和动物的进化取决于三个基本因素： 遗传、变异和选择。
• 遗传变异是进化的内因和基础，选择决定进化的发展方向， 自然进化是自然变异和自然选择的进化；而人工进化则是人 类为发展生产的需要，人工创造变异并进行人工选择的进化， 其中也包括有意识地利用自然变异及自然选择的作用。
• 作为育种实际上就是作物的人工进化，是适当利用自然进 化的人工进化，其进程远比自然进化为快。马铃薯的育种 也是在自然进化的过程中结合现代人工选择以创造和培育 出新品种。
• （二）遗传改良在马铃薯生产发展中的作用
• 遗传改良是指作物品种的改良。从野生植物驯化为栽培作 物，就显示出初步的、缓慢的遗传改良作用。
• 3．细胞工程育种
• 细胞工程育种主要是指利用花药组织培养、原生质体培养、 体细胞融合与杂交等技术进行育种的方法。
• 我国已经利用细胞工程学育种选育出不同特点的优良品系。 细胞工程育种的实施，为马铃薯远缘杂交育种带来了光明 的前景，因为它能够解决远缘杂交中存在的技术上的难题。 从根本上解决了科、属间，属、种间以及种、种间的杂交 不育的问题。
利用遗传转化技术创造马铃薯(Solanum tuberosum L.)抗病新材料
利用遗传转化技术创造马铃薯（Solanum tuberosum L.）抗病新材料马铃薯是一种粮菜兼用型作物，具有悠久的栽培史，其抗病育种工作一直倍受关注。
但由于马铃薯栽培种具有同源四倍体遗传分离的特性，常导致雄性不育和自交不亲和。
因此，通过常规杂交育种很难在较短时间内育成具有抗性的优良品种。
通过新兴的基因工程技术向马铃薯中导入有效的抗性基因，为马铃薯的抗病育种工作开辟了新的途径。
本实验对马铃薯遗传转化体系进行了优化，使转化体系更加简便，且转化频率更为稳定。
利用这一体系把抗真菌的双价基因GLU-CHI和具有广谱抗菌性的抗菌肽基因SPCEMA导入马铃薯中，均得到了转基因的马铃薯新材料。
主要试验结果如下： 1．马铃薯的高效遗传转化体系通过对受体材料和转化条件的比较实验，建立于马铃薯栽培品种“台湾红”的最适转化条件：取生长健壮的马铃薯试管苗茎段和叶片在MS1：MS+BA2.5mg/L+2,4-DO.5mg/L上分别预培养4d和8d；以OD<sub>6</sub>00值为0.5～0.8左右的农杆菌液感染外植体5min；在MS上，23～25℃，黑暗条件下共培养3d；常温下，在120rpm 的摇床上用无菌水脱菌30～60min；在诱愈分化培养基MS1（附加Kan50mg/L和Cef300mg/L）上进行15～20d的抗性愈伤的诱导和筛选；在芽分化培养基MS<sub>2</sub>（MS+BA2.5mg/L+GA<sub>3</sub>5.0mg/L+ZT<sub>1</sub>.0mg/L，附加Kan100mg/L和Cef300mg/L）上诱导抗性芽，20～40d即可获得抗性芽；对抗性芽进行生根及茎段、叶片再生的Kan抗性检测。
2．转基因植株的检测本实验用双价基因表达载体pBIGLU-CHI转化“台湾红”叶片135个，茎段115个，分化出抗性芽的外植体分别是18个和47个，转化频率分别是13.33％和40.87％；用单价抗菌肽基因表达载体pBISPCAME转化“台湾红”茎段120个，得到抗性芽12个，转化频率为10.00％。
可溶性淀粉合成酶SSIII基因对马铃薯的遗传转化
可溶性淀粉合成酶SSIII基因对马铃薯的遗传转化马铃薯(Solanum tuberosum L.)是淀粉生产中重要的农作物之一。
淀粉是大多数植物当中主要的贮藏碳水化合物,它分为直链淀粉和支链淀粉两种。
支链淀粉占总淀粉含量的80%左右,是由α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键连接而成的具有分支结构的多聚糖,而直链淀粉是由α-1,4糖苷键连接而成的线性多聚糖。
目前在生产上推广的马铃薯栽培品种,其淀粉糊化温度、粘度、冻融稳定性都不太理想。
因此,选育出更适合于加工业领域的马铃薯新品系,对于马铃薯的淀粉加工产业有重要的意义。
本研究通过根癌农杆菌介导法将组成型表达启动子CaMV 35S 和块茎特异型表达启动子CIPP驱动的可溶性淀粉合成酶(SSⅢ)基因导入到马铃薯栽培品种克新1号和克新4号中,获得转基因马铃薯植株,为进一步明确SSⅢ基因在淀粉合成中的功能和获得淀粉改良的马铃薯新种质提供基础。
取得的主要研究结果如下:1.以马铃薯栽培品种克新1号和克新4号的试管薯为供体材料,分别用组成型表达启动子CaMV 35S和块茎特异型表达启动子CIPP驱动的可溶性淀粉合成酶(SSⅢ)基因干扰表达载体pBI-SSⅢ-RNAi和pBIC-SSⅢ-RNAi进行遗传转化,获得了65株转化植株。
通过PCR检测初步表明有31株中SSⅢ基因的干扰片段已整合到马铃薯基因组中。
2.将PCR结果呈阳性的马铃薯转基因植株移栽至温室蛭石中,4个月后收获微型薯。
通过半定量RT-PCR检测初步说明有19株中SSⅢ基因在转录水平上已受到了抑制。
3.对转SSⅢ基因马铃薯淀粉颗粒形态、支/直淀粉含量及淀粉中磷含量进行了观察和测定。
结果表明有9个转基因植株的淀粉颗粒形态发生了明显的变化,其淀粉颗粒中心出现裂痕;这9个转基因马铃薯植株中直链淀粉含量都不同程度的有所增加,其中直链淀粉含量最低为14.55 %,最高为17.59 %,比未转基因的对照植株增加了2.68 %～29.05 %;与未转基因的对照植株相比,转基因植株的支/直淀粉比都有不同程度的降低;与未转基因的对照植株相比,克新1号的6个转基因株系的淀粉磷含量降低了9.94 %～58.36 %,克新4号的3个转基因株系的淀粉磷含量降低了34.76 %～56.04 %。
马铃薯PPase基因克隆及其遗传转化研究
马铃薯PPase基因克隆及其遗传转化研究马铃薯PPase基因克隆及其遗传转化研究马铃薯（Solanum tuberosum L.）作为世界上最重要的食物作物之一，其种植面积和产量一直居于全球的领先地位。
然而，由于各种逆境胁迫（如盐碱、干旱等）对马铃薯的生长和产量产生了严重的影响，研究人员开始探索提高马铃薯逆境适应性的方法。
一个有希望的策略是通过遗传改良来增强马铃薯对逆境的抵抗能力。
磷酸酶（PPase）是一种关键酶，参与细胞内磷酸盐代谢的调控以及离子转运。
PPase酶可分为两类，分别是酸性PPase（V-ATPase）和碱性PPase（PPi-Pase）。
前者是维持细胞内pH的平衡，后者则调节细胞中无机五磷酸（PPi）的水解，分解出无机磷酸盐（Pi）。
研究表明，PPase基因在植物对环境逆境的响应中起着重要作用。
因此，通过克隆和遗传转化研究马铃薯PPase基因，有望提高马铃薯的耐逆境能力。
为了克隆马铃薯PPase基因，研究人员首先需要在马铃薯基因组中寻找到目标基因的序列。
通过生物信息学方法，研究人员可以利用已知PPase基因的序列信息来筛选潜在的候选序列。
接下来，他们将使用特定引物和PCR技术来扩增目标基因的DNA序列。
通过PCR扩增后，研究人员将纯化目标基因的DNA片段，并进行测序确认。
通过这些步骤，马铃薯PPase基因成功被克隆。
在遗传转化研究方面，研究人员通常采用农杆菌介导的遗传转化技术，将目标基因导入到马铃薯的基因组中。
这种技术基于农杆菌与植物细胞间相互作用的天然能力，通过将目标基因植入到农杆菌载体中，再将载体转化到农杆菌中。
之后，研究人员将农杆菌接种到培养的马铃薯愈伤组织上，允许细菌进入植物细胞并将目标基因导入植物基因组。
随后，通过抗生素筛选和分子检测等方法，筛选出带有目标基因的转基因马铃薯植株。
通过马铃薯PPase基因的克隆和遗传转化研究，研究人员希望可以获得具有增强逆境抵抗能力的转基因马铃薯品种。
CryⅢA基因植物表达载体构建及马铃薯遗传转化
CryⅢA基因植物表达载体构建及马铃薯遗传转化CryⅢA基因植物表达载体构建及马铃薯遗传转化植物转基因技术是现代生物技术的一个重要分支，其应用范围广泛，不仅可以改良农作物的农艺性状，还可以提高农作物对病虫害的抗性。
其中，CryⅢA基因作为一种重要的抗虫基因，在植物遗传转化中得到了广泛的应用。
本文将介绍CryⅢA基因植物表达载体的构建以及其在马铃薯遗传转化中的应用。
首先，我们先来了解一下CryⅢA基因。
CryⅢA基因来自于一种土壤细菌Bacillus thuringiensis，它编码了一种具有杀虫活性的晶体毒素。
CryⅢA毒素主要对披蓟马等多种害虫具有杀灭作用，可以通过转基因技术将其导入农作物中，提高作物对害虫的抗性。
为了实现CryⅢA基因的遗传转化，需要构建一个能够稳定表达该基因的植物表达载体。
植物表达载体是一种能够在植物细胞中进行复制和表达的DNA分子。
构建CryⅢA基因表达载体的第一步是采集CryⅢA基因的DNA序列，并进行PCR扩增。
然后，将扩增得到的CryⅢA基因片段与植物表达载体进行连接，产生一个含有CryⅢA基因的表达载体。
这个表达载体还需要包含适当的启动子和终止子，以确保CryⅢA基因能够在植物细胞中得到高效的转录和翻译。
将构建好的CryⅢA基因表达载体导入植物细胞中的过程称为遗传转化。
目前，常用的植物遗传转化方法包括农杆菌介导的遗传转化和基因枪法。
在马铃薯中，农杆菌介导的遗传转化是最常用的方法。
首先，将构建好的CryⅢA基因表达载体导入一种常见的农杆菌，经过一系列的处理和培养，使其携带CryⅢA基因表达载体。
然后，将经过处理的农杆菌与马铃薯离体组织接种，使其与马铃薯细胞进行共培养。
随着细胞的分裂和分化，含有CryⅢA基因的DNA会随着细胞的遗传物质被传递给下一代细胞，并最终形成CryⅢA基因转化的马铃薯植株。
植物转基因技术是一种有前景的农作物改良方法。
CryⅢA 基因植物表达载体的构建及其在马铃薯遗传转化中的应用为我们提供了一种重要的抗虫策略。
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农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系Steve Millam摘要：马铃薯是一种全球性的重要农作物，其块茎作为营养丰富的食物，产量很高。
马铃薯之所以成为大量研究的焦点，是因为它既作为一种主要粮食作物，又能作为所关注的化合物的潜在重要来源。
转基因技术的发展和应用已经用于马铃薯上，并以此来引进基础且实用的新奇目标特征。
本文描述了一个快速、高效和低成本的马铃薯遗传转化系统，与平常的转化相比，其转化效率可超过40%。
基于核酸印迹法的平均值计算，证实了每个外植体切片在转基因上的独立性。
将节间切片与农杆菌一起培养，然后在卡那霉素的筛选下，经历一个双阶段的愈伤组织诱导/出芽系统。
用这种描述的方法可以获得很高的幼芽再生率，而且经过2次继代培养后，离体茎段从伤口末端生根，保证有95%的外植体被转化。
这种转基因状态可以通过分子分析来证实。
马铃薯的块茎生长也促使了大范围的进一步的研究。
1．介绍马铃薯是最早用于遗传转化的植物之一。
Ooms等人在1986年用农杆菌浸染马铃薯Desiree品种的组织并使组织再生，这成为马铃薯转化的直接证据。
转基因品种Desiree和Bintje所用的农杆菌由Stiekma等人提供。
de Block报道了一种以叶圆片作为靶组织，且与基因型无关的转基因方法。
Visser等人以茎段和叶片为外植体，提出了包括再生和转化在内的两步法，并作为目前众多已使用的实验方案的基础。
各种马铃薯组织相对容易的根系再生也支持了这些已经报道的马铃薯遗传转化系统。
目前许多正在使用的实验方案都报道了一个两步再生法，及先进行愈伤组织诱导，再进行根系再生。
在愈伤组织诱导阶段通常会尽可能避免马铃薯体细胞突变。
第一步通常是加入1-5mg/L的玉米素（zeatin）或者玉米素核苷（zeatin riboside），并结合低浓度的生长素（通常是的萘乙酸（NAA）或者吲哚乙酸（IAA））,以此促进外植体产生愈伤组织。
第二步，将玉米素浓度降低20%，将生长素浓度降低10倍，同时加入赤霉素来刺激根系再生。
每个外植体的再生速率都很高，经过4-6周可生出第一批根，培养10-12周后可每个外植体都会长出至少10条根。
以卡那霉素（kanamycin）或者潮霉素（hygromycin）作为筛选标记可以很容易地用肉眼进行分析，然后切除可能与转化无关的根。
那些含有抗生素抗性基因的苗将会很明显从茎的切口处长出根，而那些非转基因的苗将不会生根或者从不定位点生根。
使用不同的栽培品种或者组织，其转化效率也不同。
但是根据重复实验的记录显示，从最初的外植体到确定的转基因单株的比率在40%到100%之间。
尽管马铃薯通常是四倍体，但也经常使用双单倍体品系进行转基因研究。
此外，野生的二倍体植株也用此方法进行转化。
虽然许多的初步报道都基于模式植物的研究，但转化成功的基因型的范围也在不断扩大。
在众多马铃薯品种中筛选具有转化潜力的品种的研究中，科学家发现了一个有意思的现象，即转化效率与转化潜力无关。
最近几年，马铃薯的研究重心将集中到转基因的发展，包括赋予抗病虫害能力，提升块茎质量，以及提升淀粉产量。
2．材料．植物材料马铃薯Desiree品种的试管苗（来自苏格兰农业科学局[SASA]，网址是或其他机构）确保最初使用的是脱毒苗。
脱毒苗可以选择用马铃薯发芽的块茎培育的试管苗，或者温室中长势相同的马铃薯植株。
．生长调节剂母液提前准备好充足的生长调节剂母液用于配制16×250mL的完全培养基。
母液先用过滤方式消毒，然后分装到无菌离心管中，并置于-20℃中保存，可以保存6个月。
1．萘乙酸（NAA）（Duchefa）：将20mg NAA溶解到1mL 1N的NaOH溶液中，再加蒸馏水定容至20mL，配成1mg/mL的NAA母液。
NAA母液可于4℃保存6周。
2．赤霉素（GA3）（Duchefa）：将20mg GA3溶解到20mL 50%的乙醇（乙醇与蒸馏水的比例为1:1）中，配成1mg/mL的GA3母液。
GA3母液可于4℃保存6周。
3．米素核苷（ZNR）（Duchefa）：将20mg ZNR溶解到1mL 1N的NaOH溶液中，再加蒸馏水定容至20mL，配成1mg/mL的ZNR母液。
ZNR母液可于-20℃保存6个月。
．抗生素母液1．头孢霉素（Claforan，Cefotaxime powder，Roussel，Uxbridge，England）：用蒸馏水配制125mg/mL头孢母液，并用过滤方式消毒。
母液可于-20℃保存6个月。
2．卡那霉素（Duchefa）：用蒸馏水配制50mg/mL卡那霉素母液，并用过滤方式消毒。
母液可于-20℃保存6个月。
3．利福平（Sigma）：用甲醇配制50mg/mL利福平母液，不需要过滤方式消毒。
母液可于-20℃保存6个月。
．培养基所有的培养基都准备了250mL，分装至Durand bottles中，并在121℃下高压蒸汽灭菌20分钟，同时对抗生素进行过滤消毒。
然后在超净工作台中，先将生长调节剂母液加入培养基中，再分装至10个9cm的培养皿中。
1. 植物生长必需培养基（BM）：1×MS基本培养基加上维生素混合物（Duchefaproduct ），20g/L蔗糖，用蒸馏水定容至1L，并调节pH至。
加入L的琼脂粉，经高压蒸汽灭菌后，于4℃保存。
2. MS20培养基：即液体BM培养基，成分和上面相同，但是不加琼脂粉。
3. 共培养基（CM）：在BM培养基中加入L的NAA，L的GA3，L的玉米素核苷（ZR），8g/L的琼脂粉。
4. 第一阶段再生培养基（CMC）：在CM培养基中加入500mg/L的头孢霉素（已用过滤方式灭菌）。
5. 第二阶段再生培养基（CMCK）：在BM培养基中加入L的NAA，L的GA3，2mg/L的玉米素核苷（ZR），500mg/L的头孢霉素（已用过滤方式灭菌），50mg/L的卡那霉素（已用过滤方式灭菌）。
6. 选择培养基（SM）：在BM培养基中加入500mg/L的头孢霉素（已用过滤方式灭菌），50mg/L的卡那霉素（已用过滤方式灭菌）。
7. LB培养基：10g/L的胰蛋白胨；10g/L的酵母提取物；10g/L的NaCl，pH= ；18g/L的琼脂粉。
．细菌菌株和载体1．农杆菌菌株LBA4404。
2．DNA构建体：pBIN19的双元载体衍生物。
载体通过电击转化进入LBA4404中。
成功转化的细菌能够选择性地在含有100mg/L的卡那霉素和利福平的LB培养基上生长。
农杆菌菌液需加入甘油，置于-80℃保存。
．其他物品和溶液1．灭菌剂：10%的Dmomestos（Lever Brothers，UK），其有效成分为%的次氯酸钠。
2．混合肥：爱尔兰苔藓腐殖土（bedding grade），1200L；Pavoir沙，100L；石灰石（magnesium），；石灰石（calcium），；sincrostart基肥（William Sinclair，Lincoln，UK），；Celcote湿润剂（LBS Horticulture，Lancashire，UK）,；珍珠石，100L；Osmocote控释肥（Scotts，UK），2kg；Intercept杀虫剂（Bayer），390g。
3．方法．培育试管苗所有的试管苗都置于18-22℃，16小时光照（光照强度为80-110μE/m2/s），8小时黑暗环境下培养。
用发芽的块茎培育试管苗1．将块茎上的芽切下，并用自来水冲洗。
2．先将切下的芽置于加有2滴吐温20的70%乙醇中浸泡1分钟，然后用10%的Domestos浸泡15分钟，再用无菌水清洗5遍，最后放在BM培养基中培养。
3．用装有BM培养基的90mm培养皿或者组培瓶对茎段和芽尖进行继代培养。
用温室中正在生长的植株培育试管苗1．选择生长旺盛，且未受到病虫害侵袭的植株，将其茎段和芽尖剪下，并立即用自来水冲洗。
2．先将茎段和芽尖剪成5至10mm的小段，然后用加有2滴吐温20的70%乙醇漂洗1分钟，接着用10%的Domestos浸泡15分钟，再用无菌水清洗5遍，最后放在BM培养基中培养。
3．用装有BM培养基的90mm培养皿或者组培瓶对茎段和芽尖进行继代培养。
．准备农杆菌1．从用甘油保存的菌液或者含有100mg/L卡那霉素和利福平的LB平板培养基上挑取菌种，并置于5mL发酵培养基中活化。
2．将农杆菌加入5mL含有100mg/L卡那霉素和利福平的LB培养基中，然后放在摇床上，28℃，200rpm过夜培养。
3．过夜培养后，用250mL的锥形瓶将5mL的菌液转入50mL含有相应抗生素的LB培养基中，用相同的条件过夜培养。
4．过夜培养后，测量农杆菌悬浮液的光密度（OD）值为600nm。
5．将菌液加入无菌离心管中，700-1000g离心15分钟，然后用15mLMS20重悬沉淀。
6．同时，用650μL之前摇的菌液和350μL甘油混合，配成1mL菌液，用液氮速冻后，置于-80℃保存。
．接种、转化和再生1．从生长3-4周的马铃薯植株上截取长约10mm，切面直径不低于的节间部分。
2．将外植体（数量不低于30个）放在装有MS20培养基的平板中，避免干燥。
3．在90mm平板培养皿中加入15mLMS20培养基，再加入1mL之前摇的菌液，然后将外植体放入培养皿中，用封口膜密封，置于细菌恒温摇床中，22℃，50rpm转化45分钟。
4．将农杆菌悬浮液倒入容器中，并使农杆菌失活。
5．用无菌滤纸将外植体表面的水分吸干，然后置于CM培养基上（每个平板上放30个外植体）。
将平板密封后，在18-22℃，弱光处（光照强度为20μE/m2/s）转化48小时。
6．然后将转化好的外植体置于CMC培养基上进行共培养，每个平板上的外植体应低于10个。
将平板密封后，在18-22℃，充足光照处（光照强度为80-110μE/m2/s）培养。
7．12天后，将CMC培养基中的外植体转移到CMCK培养基中进行培养。
8．每14天更换一次新的CMCK培养基。
9．愈伤组织和丛生芽在4周后出现，然后继续培养。
当大约第三次换CMCK培养基时，小心剪下5-10mm左右的丛生芽，然后置于SM培养基中。
10．继续每14天转移一次外植体，同时剪下后长出丛生芽，确保每个芽发育成单独的植株。
．选择和进一步生长转基因的丛生芽1．在SM培养基中培养14天后，移出存活的苗（即那些仅从芽的伤口处长出根的苗）。
剪取10-15mm的芽尖，然后放在新的SM培养基中进行2次筛选。
2．那些从切口处生根的植株可以认为是已成功转化的。
接下来就可以将这些植株放在SM培养基上进行共培养，最后转移到温室中进行培养。
Fig. 1. (A) 培养6周后从5mm的Desiree外植体茎段长出的丛生芽。
照片的放大倍数为3倍。
(B) 将可能转化的芽切下，放在含有50mg/L卡那霉素的MS培养基上培养14天后，可以看到左边的小苗长出根，因此推断是阳性植株。