农杆菌介导遗传转化原理
番茄的遗传转化（DOC）
番茄的遗传转化班级姓名学号摘要：本研究以小型番茄为试材,建立其以子叶、下胚轴为外植体的高效、稳定再生体系及遗传转化体系。
子叶外植体与农杆菌共培养后,经过诱导,根的再生，初步建立了农杆菌介导的遗传转化体系。
是目前最有效的途径之一。
农杆菌对植物释放的化学物产生趋化反应，向植物受伤组织集中。
经共培养后，受伤部位的化学诱导物透过农杆菌的细胞膜使Ti质粒上的Vir基因活化。
Vir基因产物使Ti 质粒上的T—DNA进入植物细胞，并整合到植物核基因组中。
插入在T—DNA 左右边界区内的目的基因也随之整合到植物染色体上，从而使目的基因在植物细胞中得到表达。
近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物中也得到了广泛应用。
关键字：番茄下胚轴子叶转化一、实验材料、试剂和仪器设备1.实验材料：番茄种子2.试剂：大量元素、氯化钙、微量元素、铁盐、有机成分、琼脂、蔗糖、蒸馏水、1mol∕LNaOH、6BA、NAA、升汞、蛋白胨、酵母粉、卡那霉素、75％乙醇3.仪器设备：天平、烧杯、量筒、移液管、药勺、称量纸、玻璃棒、吸耳球、PH 试纸、培养瓶、封口膜、橡皮筋、高压灭菌锅、电炉、标签纸、记号笔、滤纸、镊子、剪子、移液枪、枪头、酒精灯、培养皿二、实验步骤1.外植体的制备(1) MS培养基母液的配制按以下的成分与浓缩比例配制母液大量元素50mg∕L氯化钙50mg∕L微量元素1 mg∕L有机成分1 mg∕L蔗糖30 g∕L琼脂 6 g∕L(2)MS培养基的配置配制200ml的MS培养基，将所需要的试剂混合后加热溶解，用1mol∕LNaOH 调节PH至5.8，宁大勿小偏酸不凝固，然后分装到灭好菌的培养瓶中。
(3)高压灭菌将配制好的培养基、培养瓶、无菌水、有滤纸的培养皿灭菌(4)铺种子打开超净工作台紫外灯照射约30min，然后关闭紫外灯，打开超净工作台的风机。
先数好所需要的种子，放在一个小烧杯中，到入升汞，没过种子，五到六分钟。
然后回收升汞，把无菌水倒入摇晃，用灭菌好的无菌水洗3—4次，拿镊子灭菌，要灭透。
总结遗传转化过程各个环节的要点及注意事项
总结遗传转化过程各个环节的要点及注意事项
应用重组DNA技术、细胞组织培养技术或种质系统转化技术，有目的地将外源基因或DNA片段插入到受体植物基因组中并通过减数分裂获得新植株的技术第一类：外源裸露基因的直接导入法；通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物基因组中。
基因枪转法第二类：载体介导的转化方法；通过将目的基因连接在植物表达载体上，随着载体DNA的转移而将外源目的基因整合到植物基因组中。
农杆菌介导转化法，病毒介导的转化法第三类：种质转化系统法；包括植物原位真空渗入法和花粉管通道法。
（一）基因枪法；（1）原理：基因枪法把遗传物质或其他物质附着于高速微弹直接射入细胞、组织和细胞器。
气体基因枪可在广泛的细胞型中得到瞬时的、稳定的和高效率的转化作用，气体基因枪有一个产生冲击波的特殊结构，在恰当的气压范围内从3.5MPa-10MPa，具有相应不同的可破裂膜，将包覆DNA的粒子穿越，射入在轰击室底部的靶细胞中。
（2）程序与方法：（1）轰击微弹的制备（2）基因枪轰击参数（3）受体材料（4）轰击样品。
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥一、实验目的1.了解浸花法(floral tip)转化的机理；2.掌握拟南芥浸花法(floral tip)转化的技术二、实验原理拟南芥的花序大量产生时，将其在含有转化辅助剂silwet和蔗糖的农杆菌溶液中浸泡20秒，3-4周后对转化植株收种子。
在含有合适抗生素的平板上对种子进行筛选，能够健康生长的幼苗为转基因植株。
三、实验材料及仪器材料：生殖期的拟南芥植株，含目的基因质粒的农杆菌(PCAMIBIA 3301-ZEP)，无菌滤纸仪器设备：超净工作台，恒温摇床，培养箱，台式高速离心机，涡旋仪，抽滤器，高压灭菌锅，电子天平，酸度计，培养室用具：微量移液器，金属药匙，牙科手术钩或细菌涂布器，100 ml无菌三角瓶，直径9 cm 培养，200 ml及1ml tip枪头，枪形镊四、实验步骤1)当野生型株系的拟南芥植株生长了个月左右。
将其主薹剪掉，待其次生薹长出，浸染前剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花；2)将农杆菌菌液扩大培养接入到250 ml含有50 μg/ml的Kan和Rif的YEP的液体培养基中:3)将装有250 ml YEP液体培养基的500 ml三角瓶置于28℃ 200 rpm下振荡培养24 h;4)分批次将250 ml YEP液体培养基装在50 ml离心管中多次离心，每次7500 rpm离心5 min,直到把所有的农杆菌都聚集在管底；5)用5%的蔗糖溶液。
其中加了0.02%-0.05% (VV)的silwet L-77来重新悬浮聚集在管底的农杆菌，直到把浓度稀释到OD600为1.5左右即可；6)把蔗糖溶液重悬的农杆菌菌液放入50 ml 离心管中，将花盆倒转过来，将花序浸入农杆菌中20 s，轻轻转动和晃动植物，保证腋芽生长的花都能浸到液体溶液中，取出后能看见植物上有一层水膜，轻轻晃动植物3-5 s抖掉过多的液体(花在液体中浸泡时间过长有所伤害)。
7)浸染过得植株放置在塑料盆中并用一个高的遮光的袋子遮住植株以保持其湿度,并将盆置于弱光或黑暗的条件下一天；8）将其遮光袋拿去，移到智能气候室培养，并定期补浇营养液，直到角果成熟收获种。
eha105 拟南芥原理
EHA105 拟南芥原理详解拟南芥简介拟南芥（学名：Arabidopsis thaliana）是一种小型的模式植物，属于十字花科，是研究植物生物学和遗传学的重要模式生物。
拟南芥的基因组相对简单，具有短的生命周期和快速的生长速度，使其成为研究植物基因功能和表达调控的理想模型。
拟南芥转化技术拟南芥转化技术是将外源基因导入拟南芥植株中，使其表达特定的基因或蛋白质。
其中，EHA105是一种常用的拟南芥转化介导体，通过农杆菌介导的转化方法将目标基因导入拟南芥。
拟南芥转化技术的基本原理如下：1.农杆菌介导的转化：农杆菌是一种常见的土壤细菌，具有天然的遗传转化能力。
利用农杆菌的特性，可以将目标基因导入拟南芥细胞中。
转化过程中，农杆菌通过寄生在植物细胞上的线粒体和质体，将外源基因导入植物细胞的染色体中。
2.构建转化载体：为了将目标基因导入拟南芥细胞中，需要构建一个转化载体，其中包含了目标基因的DNA序列。
转化载体一般由多个功能模块组成，包括选择标记基因、启动子、终止子等。
选择标记基因可以在转化后的拟南芥中表达，用于筛选转化成功的植株。
3.转化条件优化：转化过程中，需要优化一系列的条件，以提高转化效率。
包括农杆菌的培养条件、拟南芥的生长条件、转化载体的浓度和转化时间等。
通过优化这些条件，可以提高转化效率，增加转化成功的概率。
4.筛选转化植株：转化后的拟南芥植株需要经过筛选，以确定哪些植株成功地导入了目标基因。
常用的筛选方法是通过选择标记基因的表达来鉴定转化植株。
选择标记基因一般与目标基因共同构建在转化载体中，通过选择标记基因的表达来判断转化是否成功。
5.遗传稳定性验证：转化后的拟南芥植株需要进一步验证其遗传稳定性。
通过后代分析，确定转化基因是否稳定地遗传给下一代。
通常，通过PCR、Southern blot等方法来检测目标基因的存在，并验证其在后代中的稳定性。
EHA105的特点和应用EHA105是一种常用的拟南芥转化介导体，具有以下特点和应用：1.高转化效率：EHA105具有较高的转化效率，可以在较短的时间内实现大量的拟南芥转化。
第四章植物遗传转化技术
Vir基因的功能： 诱导根癌农杆菌附着到植物受伤的部位上– VirA蛋白； 产物诱导T-DNA形成单股DNA片段--VirD蛋白； 将T-DNA转入植物细胞，整合到寄主基因组中-VirD、E蛋白； T-DNA基因被表达，使植物细胞增殖并产生冠 瘿碱。
第四章植物遗传转化技术
▪ T-DNA（Transfer DNA） ▪ 是农杆菌侵入植物细胞时从Ti质粒上转移到
第四章植物遗传转化技术
• 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿 碱种类不同分：
• 章鱼碱型（octopine） • 胭脂碱型（nopaline） • 农杆碱型（agropine） • 琥珀碱型（agrocinoine）
第四章植物遗传转化技术
章鱼碱的遗传图
胭脂碱的遗传图
第四章植物遗传转化技术
Ti质粒结构
植物遗传转化载体
第四章植物遗传转化技术
作为植物遗传转化的载体，必须具有两种功能： 1.它能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去，并且 整合到宿主细胞的基因组DNA上； 2.它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的 DNA序列。
第四章植物遗传转化技术
农杆菌的Ti质粒
人们很早就发现双子叶 植物常发生一种冠瘿瘤病， 该病在法国、东欧和意大 利的葡萄和果树上曾大面 积发生。
第四章植物遗传转化技术
5 农杆菌介导
几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的 根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一 种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A. tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该 菌细胞内的野生型Ti （Tumor-inducing）质 粒介导的。
第四章植物遗传转化技术
第四章植物遗传转化技术
1 基因枪转化法 将待转化的DNA沉淀在细小金属珠的表面，用 特制枪将金属珠直接打入植物细胞，枪的威力 为430 m/s，植物细胞通常是胚胎细胞、玉米 籽、叶片等，但进去的DNA片段整合效率极低。
遗传转化的名词解释
遗传转化的名词解释遗传转化是指通过不同的手段和技术，将外源基因引入到一个生物体的细胞或基因组中，使其在后代中表达该外源基因。
这一过程既可以在自然界中发生，也可以通过人工手段进行。
遗传转化的目的在于改变生物体的基因组，以获得某种特定的性状或功能。
这一技术广泛应用于农业、医学、生物工程等领域。
通过遗传转化，可以使植物具有抗病虫害能力、耐逆性和优异的产品特性，从而提高农作物的产量和质量。
在医学领域，遗传转化可以用于治疗遗传性疾病和其他疾病，并开发新的药物和治疗方法。
遗传转化的方法多种多样。
其中一种常见的方法是基因枪法（gene gun）。
基因枪法通过利用高压气体或炮火将DNA颗粒送入目标细胞，使其转化为转基因细胞。
这一方法适用于植物和动物细胞，被广泛应用于农作物改良和生物医学研究领域。
另一种常用的遗传转化方法是农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium-mediated transformation）。
农杆菌是一种普遍存在于土壤中的细菌，能够将其DNA片段传递给其他生物体。
通过改变农杆菌的基因，科学家可以将所需基因导入到目标生物体的细胞中，从而实现遗传转化。
除了以上两种方法，遗传转化还包括利用病毒载体、电穿孔和化学方法等。
这些方法各有特点，适用于不同类型的生物体和研究目的。
虽然遗传转化技术在农业和医学领域带来了很多好处，但也引发了一些争议。
其中一个主要争议点是关于转基因食品的安全性。
一些人担心转基因食品可能会对人体健康产生不良影响，因此对其持怀疑态度。
然而，多数科学研究表明，经过严格监管并符合安全标准的转基因食品是安全可靠的。
另一个争议点是关于遗传资源和基因的私有化。
一些大公司在利用遗传转化技术改良作物或开发新的药物时，通过专利等手段将其技术和产品垄断起来，使得部分基因资源无法自由流动，从而引发一系列的经济和伦理问题。
为了克服这些争议和挑战，需要加强对遗传转化技术的监管和评估，并确保技术的透明性和可追溯性。
利用根瘤农杆菌制备转基因植物的方法
利用根瘤农杆菌制备转基因植物的方法一、背景介绍1. 转基因植物简介随着生物技术的发展，转基因植物已在农业生产中得到广泛应用。
转基因植物是指将外源基因导入植物基因组，从而赋予植物新的性状或改善原有性状的植物。
转基因植物具有抗病虫害、耐逆境、提高产量等特点，在农业生产中具有重要的应用价值。
2. 根瘤农杆菌简介根瘤农杆菌是一种土壤中常见的细菌，它具有特殊的DNA转移酶，能够将外源基因导入植物细胞核。
根瘤农杆菌被广泛应用于制备转基因植物的过程中。
二、根瘤农杆菌制备转基因植物的方法1. 选择表达载体在利用根瘤农杆菌制备转基因植物的过程中，首先需要选择合适的表达载体。
表达载体是一种携带外源基因并能够在植物细胞内表达的载体。
常用的表达载体包括质粒和农杆菌头部。
2. 构建重组质粒将外源基因插入表达载体中，构建重组质粒。
在构建重组质粒时，需要考虑外源基因的稳定性、表达水平和对植物生长发育的影响。
3. 选择合适的宿主植物选择适合的植物作为宿主植物。
在选择宿主植物时，需要考虑植物的再生能力、组织培养条件和对外源基因的接受性。
4. 根瘤农杆菌介导的遗传转化将构建好的重组质粒介导至根瘤农杆菌中，使其在植物组织中导入外源基因。
通过适当的方法，将根瘤农杆菌转化入宿主植物细胞内，实现外源基因的导入。
5. 诱导再生植株待外源基因在植物细胞内表达后，通过诱导再生植株的方式，培养出带有外源基因的植株。
6. 筛选转基因植株通过对转基因植株进行筛选，筛选出带有目标性状的植株。
筛选过程中，通常使用抗性标记基因或荧光标记基因作为筛选标志。
7. 鉴定转基因植物对转基因植物进行鉴定，确认其确实带有外源基因并且表达稳定。
鉴定方法包括PCR、Southern blot等分子生物学技术和生化分析。
三、根瘤农杆菌制备转基因植物的优势1. 高效性根瘤农杆菌介导的遗传转化具有高效性，能够快速、准确地将外源基因导入植物细胞内。
2. 多样性根瘤农杆菌制备转基因植物的方法适用于多种植物，包括大豆、玉米、水稻等重要农作物。
根癌农杆菌
根瘤菌科，农杆菌属
（Agrobacterium）：
——革兰氏阴性菌，侵染植物伤口进 入细胞后，将T-DNA插入植物基因 组中，导致植物产生冠瘿瘤或毛状 不定根，干扰植物的正常生长
－根癌农杆菌（A. tumefaciens）
Ti质粒(tumor-inducing plasmid) （广泛使用）
纯化和稳定遗传 －不需要特殊的专用设备
缺点： －只能以T-DNA插入的方式导入寄主细胞，没
有方向性
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也称微弹轰击法：将外源DNA包 被在微小的金粒或钨粒表面，然后 在高压的作用下微粒被高速射入受 体细胞或组织。微粒上的外源 DNA进入细胞后，整合到植物染 色体上，从而实现基因的转化。
可将基因枪分为三种类型： 第一类是以火药作为动力； 第二类是以高压气体作为动力； 第三类是以高压放电作为动力。
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杀虫晶体蛋白的杀虫作用机理
当昆虫吞食后，ICP在昆虫中肠的碱性消化液和胰蛋 白酶作用下，变成有活性的毒蛋白，并与昆虫中肠 上皮细胞上的特异性受体结合，全部或部分嵌合于 细胞膜中形成离子通道，造成膜穿孔，细胞渗透平 衡受到破坏，代谢终止，昆虫停止进食，最后脱水 死亡。
由于ICP要形成有活性的毒蛋白，必须同时具备碱性 条件和特定的蛋白酶才能产生，因此人畜不受影响。
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基因枪
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1) 提高植物的农业价值（产量、品质、抗性）和园艺 价值（花色、花形、花期），eg. 抗虫棉、转基因 矮牵牛等；
2) 作为生物反应器生产某些重要蛋白质和次生代谢物 质，eg. 生长激素、干扰素、白介素-2、 乙肝疫苗、表皮 生长因子等；
3) 研究基因在发育及其他生理生化过程与代谢途径中 的作用
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Bt能杀死宿主昆虫主要靠其芽孢和毒素（杀虫晶体蛋白， Bt）。